Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Zusammenfassung

Zeitraffer-Bildgebung ist eine Technik, die für die direkte Beobachtung des Prozesses der Morphogenese ermöglicht, oder die Erzeugung der Form. Durch ihre optische Klarheit und Zugänglichkeit für genetische Manipulation hat der Zebrafisch-Embryos zu einem beliebten Modellorganismus, mit der Zeitraffer-Analyse der Morphogenese in lebenden Embryonen durchzuführen. Konfokale Bildgebung eines lebenden Zebrafischembryo erfordert, dass ein Gewebe von Interesse ist, die dauerhaft mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist, wie einem Transgen oder Farbstoff injiziert. Der Prozess verlangt, dass der Embryo wird betäubt und an Ort und Stelle in einer Weise, dass eine gesunde Entwicklung normal verläuft statt. Parameter für die Bildgebung muss auf für dreidimensionale Wachstum Rechnung zu tragen und die Anforderungen der einzelnen Zellen zu lösen, während sich schnelle Schnappschüsse der Entwicklung auszugleichen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, langfristige In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zebrafisch-Embryonen durchzuführen und abwechslungsreiches Gewebe Verhaltensweisen erkennendie Schädel Neuralleiste, die kraniofaziale Anomalien verursachen. Entwicklungsverzögerungen, die durch Anästhesie und Montage verursacht werden, sind minimal, und Embryonen sind unversehrt durch den Prozess. Time-lapse abgebildet Embryonen zu flüssigen Medium bei später Punkte in der Entwicklung zurückgebracht werden und anschließend abgebildet oder fixiert. Mit einer zunehmenden Fülle von transgenen Zebrafischlinien und gut charakterisierten Schicksal Mapping-und Transplantationstechniken, Imaging ist eine beliebige Gewebe möglich. Als solche Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung kombiniert kraftvoll mit Zebrafisch-genetischer Methoden, einschließlich der Analyse von Mutanten und mikroinjizierten Embryonen.

Einleitung

Kraniofazialen Morphogenese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die koordinierte Wechselwirkungen zwischen mehreren Zelltypen erfordert. Die Mehrheit der kraniofazialen Skelett aus Neuralleistenzellen stammen, müssen von denen viele aus dem dorsalen Neuralrohr in transienten Strukturen genannt Pharyngealbögen ¹ migrieren. Wie bei vielen Geweben ist Morphogenese des kraniofazialen Skeletts komplizierter, als durch statische Bilder von Embryonen in bestimmten Entwicklungszeitpunkten zu verstehen. Obwohl es zeitaufwendig durchzuführen, stellt in vivo Zeitraffermikroskopie einen kontinuierlichen Blick auf Zellen und Gewebe eines sich entwickelnden Embryos. Jedes Bild in einem Zeitraffer-Serie verleiht Kontext zu den anderen, und hilft, einen Ermittler bewegen sich abzuleiten, warum ein Phänomen tritt nicht abzuleiten, was zu dieser Zeit auftreten.

In-vivo-Bildgebung ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die experimentelle deskriptive Ansätze zurdekonstruieren die Wege, die Morphogenese zu führen. Der Zebrafisch Danio rerio ist eine beliebte genetische Modell für die Wirbel embryonalen Entwicklung und ist besonders gut für die in vivo-Abbildung von Morphogenese geeignet. Moderne, bequeme Methoden zur Transgenese und genomische Modifikation schnell voran die Anzahl der Werkzeuge zur Verfügung, Zebrafisch-Forscher. Diese Tools verbessern bereits robuste Methoden zur genetischen Manipulation und Mikroskopie. In-vivo-Bildgebung von fast jedem Gewebe in fast jeder gewünschten genetischen Zusammenhang ist näher an der Realität als Phantasie.

Morphogenetischen Bewegungen der Schlundbögen werden durch Signal Wechselwirkungen zwischen der Neuralleiste und dem benachbarten Epithelien, sowohl Ektoderm und Entoderm geführt. Es gibt zahlreiche Signalmoleküle durch die Epithelien exprimiert, die notwendig sind, um die Morphogenese der Gesichtsschädelskelettelemente fahren. Unter diesen Signalmoleküle, Sonic Hedgehog (Shh) ist von entscheidender Bedeutung foder kraniofazialen Entwicklung ^8.2. Shh wird sowohl durch die orale Ektoderm und Entoderm Rachen ^2,6,9,10 ausgedrückt. Die Expression von Shh im Endoderm regelt morphogenetischen Bewegungen der Bögen ^10, Strukturierung Neuralleiste in den Bögen ^10, und das Wachstum des Gesichtsschädelskelett ^11.

BMP-Signal ist auch für die kraniofaziale Entwicklung ¹² von entscheidender Bedeutung und kann Morphogenese der Schlundbögen ändern. Bmp Signalweg reguliert dorsalen / ventralen Musterbildung im Wappen der Schlundbögen ^13,14. Störung der Smad5 im Zebrafisch führt zu schweren Gaumendefekte und ein Ausfall des Meckel-Knorpel, angemessen an der Mittellinie ¹⁵ zu verschmelzen. Darüber hinaus sind die Mutanten und Fusions Reduktionen in den ventralen Knorpelelemente mit der ^{2., 3., 4.} und manchmal Pharyngealbogen Elemente an der Mittellinie ¹⁵ verschmolzen zeigen auch. Diese Fusionen stark vermuten, dass BMP-Signal leitet die Morphogenese dieser Rachen-Elemente.

PDGF-Signalisierung ist für kraniofaziale Entwicklung notwendig, hat unbekannte Rollen in Pharyngealbogen Morphogenese aber. Sowohl Maus und Zebrafisch-Mutanten PDGFRA haben tiefgreifende Mittelgesichts clefting ^16-18. Zumindest in dieser Zebrafisch Mittelgesichtsspaltbildung ist aufgrund eines Fehlers der richtigen Neuralleiste Zellmigration ^16. Neuralleistenzellen weiterhin PDGFRA äußern, nachdem sie die Schlundbögen eingetragen. Zusätzlich werden PDGF-Liganden durch Gesichts Epithelien exprimiert und in den Kiemenbögen ^16,19,20, damit PDGF-Signal könnte auch in der Morphogenese der Schlundbögen nach der Migration eine Rolle spielen. Allerdings Analysen der Morphogenese der Schlundbögen in PDGFRA Mutanten wurden nicht durchgeführt.

In vivo-Konfokalmikroskopie pharyngul Hier zeigen wir,a-Phase transgenen Zebrafisch und beschreiben Sie die Morphogenese der Schlundbögen innerhalb dieses Zeitraums. Wir zeigen weiter, Gewebe Verhaltensweisen, die durch Mutationen, die die Bmp, PDGF, Shh und Signalwege zu stören betroffen sind.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Tierhaltung und Mutant Allele

1. Heben und Zebrafisch zu züchten, wie beschrieben ^21.
2. Zebrafisch-Mutante Allele in dieser Studie verwendet wurden, waren ¹⁶ PDGFRA ^{B1059, B1100} Smad5 ²² und ²³ smo ^B577. Quellen für diese Zebrafisch-Stämme schließen ZIRC.

2. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge

Hinweis: Alle Lösungen und Geräte können im Voraus und für eine spätere Verwendung gespeichert werden.

1. Machen Embryo Medien (EM), wie zuvor beschrieben ^21.
2. Machen Sie 4 g / L MS-222 (Tricaine). Löse 4 g Natriummonohydrogenphosphat (Na ₂ HPO ₄₎ in 450 ml sterilem Wasser. 2 g MS-222 auf die Lösung. PH-Wert auf 7,0 bis 7,2 innerhalb. Hinzufügen sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml.
3. Optional: Stellen Sie 4 g / L Nelkenöl. Wiegen 0,2 g reines Nelkenöl in einem 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen EM auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Lagern bei 4 ° C
4. Machen Sie 3% methylcellulose. Bringt 50 ml EM + 0,1 M HEPES zum Kochen bringen. Vom Herd nehmen. Stir in 1,5 g Methylcellulose, bis die Lösung homogen ist. Lagern bei 4 ° C
5. Machen 0,2% Agarose. In 0,1 g Agarose auf 50 ml EM. Bringen EM zum Kochen in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte und überprüfen, dass die Agarose aufgelöst hat. Aliquot in 500 ul-Volumina in Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C Anmerkung: Band kann nach Bedarf eingestellt werden.
6. Machen Kapillare Poker. Geben Sie einen Tropfen Superkleber in einem 0,9 mm ID Kapillare. Legen Sie eine 4-5 cm Länge von 6 lb-Test Monofile Angelschnur in der Kapillare, so dass etwa 3-4 mm Linie erstreckt sich über das Ende der Röhre.
7. Machen Sie zwei überbrückt Deckgläser pro Probe. Superkleber 22 x 22-1 Deckglas auf jedes Ende eines 24 x 60-1 Deckglas Verlassen der Mitte frei. Machen Sie Singles (1 kleines Deckglas pro Ende) Embryonen für weniger als einen Tag alt, Doppel (2 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen 03.59 days alt, oder Tripel (3 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen fünf Tage oder älter.
8. Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit Hochvakuumfett. Hinweis: Vakuumfett dient als Dichtmittel, um eine Dehydratation der Proben über lange Zeiträume hinweg zu verhindern, und hat eine niedrige potentielle Toxizität gegenüber volatiler Dichtstoffe.

3. Montagezebrafischembryonen für konfokale Mikroskopie (Siehe Abbildung 1)

1. Bereiten Betäubung Medium. Schmelzen Sie ein Aliquot 0,2% Agarose durch die Mikrowelle in 20 Sekunden-Intervallen, bis sie vollständig flüssig. Mischen 8 ul MS-222 in 192 ul 0,2% Agarose oder 5 &mgr; l von 4 g / L Nelkenöl in 195 ul 0,2% Agarose. Pflegen Sie in einem 42 ° C Heizblock. Hinweis: Langzeitbelichtung zu MS-222 verursacht stärkere Entwicklungsverzögerungen als Nelkenöl hat in der embryonalen ^{Zebrafisch-24.}
2. Falls erforderlich: Manuell dechorionate unhatched transgenen Embryos, nur vor der Analyse analysiert werden. Mit einer Pinzette langsam tear das Chorion offen, bis der Embryo wird befreit.
3. Anesthetize das Zebrafisch-Embryonen. 1 ml einer 4 g / L Lager von MS-222 bis 24 ml Embryo Medien. Alternativ fügen 390 ul von 4 g / L Nelkenöl auf 24 ml Wasser ²⁴ Fische. Hinweis: Nelkenöl wirkt langsam so mindestens 15-20 min vor Zeitraffer-Mikroskopie führen Sie diesen Schritt.
4. Platzieren einer Wulst aus Vakuumfett um die Mittelfläche von einer nach oben gerichteten Deck überbrückt. Langsam schieben Sie den Vakuumfett aus der Spritze, so dass eine glatte, durchgehende Raupe, die neben und innerhalb der Brücken und der Kante der Deckglas ist.
5. Verbreiten Sie einen Kreis von 4% Methylcellulose in der Mitte des Brückendeckglas mit einem Holz Applikator.
6. Übertragen des Embryos, die abgebildet werden. Wenn der Embryo wird betäubt ziehen Sie es in eine Glaspipette. Halten Sie die Pipette vertikal, damit der Embryo auf der Unterseite der Flüssigkeit in die Pipette zu versenken. Bewegen Sie die Pipette in die Agarose-Lösung und damit der Embryo zu fallenin der Agarose. Sie vertreiben die Flüssigkeit nicht.
7. Legen Sie die Probe. Zeichnen Sie eine Agarose-Lösung und den Embryo in die Pipette. Vertreibt den Embryo in einem Tropfen Agarose-Lösung auf der Oberseite der Methylcellulose. Verwenden Sie ein Kapillar-Poker um den Embryo nach unten auf die Methylcellulose schieben und richten den Embryo als für die Bildgebung gewünscht.
8. Verschließen Sie die Probe.
   1. Legen Sie eine überbrückt Deckglas auf der montierten ein, nach unten zeigt. Bewerben mäßigen Druck auf beiden Seiten der Deckgläser eingeklemmt, bis die Brücken machen den direkten Kontakt und die Agarose-Drop-Dichtungen an beiden Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass der Embryo richtig ausgerichtet ist.
   2. Reiben Sie eine Holz Applikator entlang der Glas zu glätten Risse und Lücken in der Vakuumfett Perle. Überschüssiges Fett von den Rändern.

4. Zeitraffer-konfokale Imaging transgener Zebrafischembryonen

(Dieses Protokoll wurde für eine Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop uns optimierting ZEN Imaging Software und kann zur Verwendung mit anderen Systemen modifiziert werden.)

1. Aktivieren Ausrüstung. Schalten Sie den konfokalen Mikroskop und externer Lasergeräte. Einschalten des Computers, um das konfokale Mikroskop verbunden. Offene konfokalen Imaging-Software und wählen Sie "Start System", um die Bildaufnahme Kontrollen zu aktivieren.
2. Bereiten beheizten Bühne. Senken Sie die Testplattform des konfokalen Mikroskops und bewegen Sie die Objektive aus der Position. Ersetzen Sie den Standardstufe mit einer elektronischen beheizten Bühne. Schalten Sie den Controller für das erwärmte Bühne und die Temperatur 29,5 ° C
3. Positionieren der Probe in das Blickfeld. Legen Sie die Probe montiert auf der Bühne. Bewegen Sie den 20X Objektiv in Position und heben Sie die Testplattform. Aktivieren Sie den sichtbaren Lichtemitter und schauen durch die Okulare. Zentrieren Sie den Kopf des Embryos in das Blickfeld.
4. Definieren Sie die Testeinstellungen.
   1. Fluoreszenzkanäle aktivieren, indem Siedie Fluoreszenzwellenlänge erfasst werden, und wählen Farbnachschlagtabellen (LUT) für jeden Kanal. Falls erforderlich, verwenden Sie den manuellen Kontrollen in der Software, um auf die erforderlichen Laser (z. B. 561 nm für RFP) zu drehen. Für jeden Fluoreszenzkanal, stellen Sie die Laserintensität auf 10,0 und die Photomultiplier-Spannung (HV oder Verstärkung) zwischen 600-700. Stellen Sie die Mittelung bis 4 und die Bit-Tiefe auf 16 Bit.
   2. Aktivieren Sie die Z-Stapel und Zeitreihen-Module. Stellen Sie die Lochblende für eine 5 um oder kleiner Z-Auflösung, und stellen Sie die Z-Intervall auf den vorgeschlagenen optimalen Abstand.
      Hinweis: Im Allgemeinen erlaubt 5 um Z-Auflösung jedes Bild Z-Stapel, um schnell genug für gesammelt werden eine "Momentaufnahme" des Embryos zu einem bestimmten Zeitpunkt, während auch die Lösung einzelner Zellen. Absenken des Mittel reduziert auch die Menge an Zeit pro Bild.
   3. Definieren Sie das gewünschte Zeitintervall zwischen den Bildern (in der Regel 10 bis 20 Minuten) und die Gesamtlänge des Experiments.
5. Stellen Sie PositionsInformationen.
   1. Schalten Sie die Kamera, um den Live-Modus. Stellen Sie den Fokus und Laserintensität erhöhen, wenn notwendig, um die Fluoreszenz zu sehen. Stellen Sie den digitalen Zoom bis 0,6 für eine größere Ansicht, wenn gewünscht.
   2. Positionieren Sie die Bühne, so dass alle interessierenden Strukturen sichtbar sind und es gibt Platz im Sichtfeld für Auswuchs dorsal und ventral. Konzentrieren durch den Embryo an den oberen und unteren Grenzen der Fluoreszenz. Einstellen der ersten und der letzten Z-Stapel-Schichtpositionen mindestens 100 &mgr; m oder mehr über diese Grenzen hinaus.
6. Optimieren Fluoreszenzintensität.
   1. Stellen Sie die Display-Anzeige LUT zu reichen. Leuchtstoff-Strukturen sollte jetzt weiß, und der Rest des Sichtfeldes sollte blau (keine Erkennung) oder schwarz sein.
   2. Steigern HV / Gewinn auf ein Niveau knapp unter dem gesättigten (rot) Pixel angezeigt. Falls erforderlich, versetzt, so eine Mehrheit der Hintergrund wird nicht erkannt (blau). Hinweis: Kleinere Lochblendendurchmesser und höhere Laserintensität sowohl Verbesserung der Bild definition, aber Laserintensität muss niedrig gehalten werden, um lebende Gewebe zu bewahren. Erhöhte HV / Gewinn-und Lochblendendurchmesser (<5 um) sind in der Regel vorzuziehen, erhöhte Laserintensität.
   3. Halten Sie den Lochblendendurchmesser breit genug, um Bilder in einer zeitgemäßen Weise zu sammeln, durchschnittlich bis 4 Sätze. Die Z-Intervall sollte immer auf die vorgeschlagenen optimalen Abstand für den Lochblendendurchmesser eingestellt werden. Führen kurzen Scans (Mittelwertbildung = 1) mit verschiedenen Einstellungen, und verwenden Sie die minimale Laserintensität, die gewünschte Auflösung erreicht.
7. Abwicklung des Versuchs für die gewünschte Zeitdauer. Danach entfernen Embryo von der beheizten Bühne und trennt langsam die Deckgläser. Tauchen Sie das Deckglas und Embryo im EM in einer 30 mm Petrischale. Mit einer Glaspipette vorsichtig waschen, den Embryo aus der Deckglas und entfernen Sie das Deckglas aus der Petrischale. Setzen Sie den Embryo in eine 28,5 ° C Inkubator weiter zu entwickeln.
8. Wachstum vergleichen. Am Ende des Experiments, nehmen einzelne ZsKlebrigkeit Bilder Agarose montierten Geschwister Embryonen, die ähnlich zu den Proben zu Beginn des Versuchs aufgeführt wurden, wurden aber in EM in einem 28,5 ° C-Inkubator angehoben.
9. Messen Sie Schlundbögen, wie gebraucht. Die Messungen können in einigen konfokalen Software-Suiten durchgeführt werden. Die Messungen wurden hier durch Import und Z-ragt. Lsm-Dateien der einzelnen Frames unter Verwendung Fiji25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

In Wildtyp-Embryonen nach Neuralleiste Bevölkerung, länglichen die Schlundbögen entlang der anterior / posterior und dorsal / ventral Achsen während der Bewegung in einer Richtung rostral (Film 1). Bei 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ist die vordere / hintere Länge des ersten Schlundbogen zwischen 1,8 bis 1,9-fache seiner dorsalen / ventralen Höhe. Rücken / Bauchdehnung schreitet stetig schneller als vorderen / hinteren Verlängerung bis 36,5 hpf. Von hier aus dorsal / ventrale Höhenplatea...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Zeitraffer-konfokale Mikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse der Entwicklung. Hier zeigen wir, Nützlichkeit der Methode bei der Untersuchung Pharyngealbogen Morphogenese in Zebrafisch-Mutante, die für wichtige Signalwege, die mit einem transgenen Neuralleistenzellen Etiketten sind. Neben Gewebe-Ebene analysiert, Zeitraffer Analysen sind auch auf zellulärer Ebene zu einem ^28-Analysen. Viele verbreitete Zebrafisch Verfahren können auch in Zeitraffer-Mikroskopie Experimente, einschließlich ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.