Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Zusammenfassung

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Zusammenfassung

Viele Mikroorganismen wie Bakterien vermehren sich extrem schnell und die Populationen können hohe Zelldichten erreichen. Kleine Zellfraktionen in einer Population haben immer angesammelte Mutationen, die entweder schädlich oder vorteilhaft für die Zelle sind. Wenn der Fitnesseffekt einer Mutation der Subpopulation einen starken selektiven Wachstumsvorteil verschafft, können die Individuen dieser Subpopulation schnell überwettbewerben und sogar ihre unmittelbaren Mitmenschen vollständig eliminieren. So können kleine genetische Veränderungen und selektionsgesteuerte Anhäufung von Zellen, die vorteilhafte Mutationen erworben haben, zu einer vollständigen Verschiebung des Genotyps einer Zellpopulation führen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Überwachung der schnellen klonalen Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit durch Kokultivierung von fluoreszierend markierten Individuen des Gram-positiven Modellbakteriums Bacillus subtilisvor. Die Methode ist einfach durchzuführen und sehr anschaulich, um intraartenWettbewerb unter den Individuen in einer bakteriellen Zellpopulation zu zeigen.

Einleitung

Bodenbakterien sind in der Regel mit flexiblen regulatorischen Netzwerken und breiten stoffwechselnden Kapazitäten ausgestattet. Beide Eigenschaften ermöglichen es den Zellen, ihre katabolen und anabolen Bahnen anzupassen, um mit ihren Gefährten und anderen Mikroorganismen um die Nährstoffe zu konkurrieren, die in einer bestimmten ökologischen Nische verfügbar sind¹. Wenn die Bakterien jedoch nicht in der Lage sind, sich an ihre Umgebung anzupassen, können andere Mechanismen für das Überleben einer Art verantwortlich sein. In der Tat, da viele Bakterien schnell vermehren und die Populationen hohe Zelldichten Subpopulationen erreichen können spontan angesammelt positive Mutationen, die die Zellen mit einem selektiven Wachstumsvorteil und damit ihre Fitness zu erhöhen. Darüber hinaus können Mutations-Hotspots und stressinduzierte adaptive Mutagenese die Entwicklung eines unangepassten Bakteriums^2,3erleichtern. So ist die Anhäufung von Mutationen und Wachstum unter kontinuierlicher Selektion der Ursprung für die enorme mikrobielle Vielfalt, selbst innerhalb derselben Gattung^4,5. Wie in der Natur findet auch die Formgebung bakterieller Genome im Labor aufgrund der kontinuierlichen Kultivierung unter Auswahl statt. Ein Beispiel dafür ist die Domestizierung des Gram-positiven Bakteriums B. subtilis, das weltweit in der Grundlagenforschung und in der Industrie eingesetzt wird. In den 1940er Jahren wurde B. subtilis mit DNA-schädigenden Röntgenstrahlen behandelt, gefolgt von der Kultivierung unter einer spezifischen Wachstumsbedingung⁶. Die Mutationen, die sich in den Bakterien während ihrer Domestizierung angesammelt haben, sind für den Verlust vieler Wachstumsmerkmale verantwortlich, d.h. der Laborstamm 168 von B. subtilis verlor die Fähigkeit, komplexe Kolonien zu bilden^7,8.

Für die am besten untersuchten Modellbakterien Escherichia coli und B. subtilissteht heute eine Vielzahl leistungsstarker Werkzeuge zur Verfügung, um ihre Genome genetisch zu manipulieren, um spezifische wissenschaftliche Fragen zu beantworten. Manchmal verursacht die Inaktivierung eines Gens von Interesse einen schweren Wachstumsfehler, der dann auf dem Standardwachstumsmedium⁹deutlich sichtbar ist. Im Gegensatz dazu werden Mutationen, die einen schwachen Wachstumsfehler verursachen und damit nur geringfügig die Fitness der Sorte beeinträchtigen, oft ignoriert. In beiden Fällen führen jedoch eine längere Inkubation und Passage der mutierten Stämme für mehrere Generationen in der Regel zur Anhäufung von Suppressormutanten, die den Phänotyp des Elternstamms^2,9wiederhergestellt haben. Die Charakterisierung von Suppressormutanten und die Identifizierung der Mutationen, die den Wachstumsdefekt des Stammstamms wiederhergestellt haben, ist ein sehr hilfreicher Ansatz, der eine Aufklärung wichtiger und oft neuartiger zellulärer Prozesse ermöglicht^10,11.

Wir sind an der Kontrolle der Glutamathomöostase in B. subtilis¹²interessiert. Ähnlich wie E. colireagiert B. subtilis auf die Störung der Glutamathomöostase(d.h.Block im Glutamatabbau²) durch die Anhäufung von Suppressormutanten. Die genomischen Veränderungen in diesen Suppressormutanten, die durch spontane Mutation erworben wurden, erwiesen sich schnell wieder GlutamatHomöostase^9,13. Daher ist es nicht verwunderlich, dass sich die Anpassung von B. subtilis an einen spezifischen Wachstumszustand während der Domestizierung des Bakteriums in der Enzymsynthese und in den entwickelten enzymatischen Aktivitäten widerspiegelt, die am Glutamatstoffwechsel beteiligt sind¹². Es wurde vermutet, dass der Mangel an exogenem Glutamat im Wachstumsmedium während des Domestizierungsprozesses die treibende Kraft für die Entstehung und Fixierung des kryptischen Glutamatdehydrogenase (GDH) gudB^CR-Gens im Laborstamm 168^2,14war. Diese Hypothese wird durch unsere Beobachtung gestützt, dass die reduzierte Menge an GDH-Aktivität im Laborstamm den Bakterien einen selektiven Wachstumsvorteil verschafft, wenn exogenes Glutamat knapp ist². Darüber hinaus führt die Kultivierung eines B. subtilis-Stamms, die die GDH GudB synthetisiert, in Ermangelung von exogenem Glutamat zur Anhäufung von Suppressormutanten, die das gudB-Gen ^inaktivierthaben 2 . Offensichtlich ist das Vorhandensein eines katabolisch aktiven GDH für die Zelle nachteilig, da endogen produziertes Glutamat, das sonst für Anabolismus verwendet werden könnte, zu Ammonium und 2-Oxoglutarat degradiert wird (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu hat ein B. subtilis-Stamm, der mit hoher GDH-Aktivität ausgestattet ist, einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber einer Sorte, die nur einen funktionellen GDH synthetisiert. Es ist davon auszugehen, dass die hohe GDH-Aktivität es den Bakterien ermöglicht, Glutamat als zweite Kohlenstoffquelle zusätzlich zu anderen Kohlenstoffquellen zu nutzen, die vom Medium² bereitgestellt werden (siehe Abbildung 1). So, GDH-Aktivität stark beeinflusst die Fitness von Bakterien, abhängig von der Verfügbarkeit von exogenen Glutamat.

Hier stellen wir eine sehr anschauliche Methode zur Überwachung und Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz zwischen zwei B. subtilis-Stämmen vor, die sich in einem einzigen Ort auf dem Chromosom unterscheiden (Abbildung 2). Die beiden Stämme wurden mit den Yfp- und cfp-Genen beschriftet, die die Fluorophore YFP und CFP kodieren, und unter verschiedenen Ernährungsbedingungen kokultiviert. Durch Probenahmen im Laufe der Zeit und durch Das aufgeeignete Verdünnungen auf Agarplatten konnten die Überlebenden in jeder der Kulturen leicht mit einem gemeinsamen Stereofluoreszenzmikroskop überwacht werden. Das in diesem Papier beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen und geeignet, die schnelle klonale Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer Zellpopulation im Laufe der Zeit zu visualisieren.

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Protokoll

1. Herstellung von Agar-Platten, Kulturmedien, Kryostocks und Vorkulturen

1. Bereiten Sie Wachstumsmedien und erforderliche Reagenzien vor (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).
2. Streifen Sie die B. subtilis Stämme (z.B. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) und BP52 (rocG⁺ gudB⁺ amyE::P_gudB-cfp) aus, die ein bzw. zwei aktive GDHs ausdrücken)^2, die im Wettbewerbsexperiment auf SP-Medium-Agarplatten verwendet werden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Nehmen Sie einzelne Kolonien und impfen sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssiges Medium. Wachsen Sie die Bakterien über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm.
4. Wachsen Sie Übernachtkulturen bei 28 °C, um zu vermeiden, dass die Zellen lyse oder sporulate.
5. Messen Sie die optische Dichte der Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) mit einem Standardspektralphotometer.
6. Wenn die Kulturen eine OD₆₀₀ von 2,0 erreicht haben, mischen Sie 0,75 ml der Kulturen mit 0,75 ml einer sterilen 50%-Glyzerinlösung in 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Die endgültige OD₆₀₀ sollte 1,0 sein, um Kryostocks mit etwa 10⁸ Zellen/ml zu erhalten.
7. Bewahren Sie die Rohre bei -80 °C auf.
8. Machen Sie drei Vorkulturen jeder Sorte, die mit den cfp- und yfp-kodierenden Fluorophorgenen gekennzeichnet sind. Impfen Sie die Präkulturen (sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssigem Medium) mit 1 l Zellen aus -80 °C Kryostocks. Die Kulturen über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm bebrüten.

2. Kokultivierung von Bakterien, Probenentnahme und Probenlagerung

1. 100 ml C-Glc und CE-Glc minimal enparieren (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) und 20 ml jedes Mediums in sterile 100 ml Schüttelkolben übertragen.
2. Nehmen Sie 0,1 ml der Übernacht angebauten Vorkulturen, verdünnen Sie sie mit 0,9 ml LB-Medium in einer 1,5 ml Küvette und bestimmen Sie die OD₆₀₀.
3. Nehmen Sie für das Wettbewerbsexperiment die Vorkulturen der verschiedenen Stämme, die eine ähnliche OD₆₀₀ zwischen 1.0-1.5 aufweisen.
4. Um gemischte Zellpopulationen zu erhalten, verdünnen Sie die Zellen der Vorkulturen, die die entsprechende OD₆₀₀ auf eine OD₆₀₀ von 0,05 in 20 ml C-Glc und CE-Glc Minimalmedium in 100 ml Schüttelkolben ergänzt hatten. Für das Wettkampfexperiment sollten die beiden Stämme im Verhältnis 1:1 gemischt werden.
5. 10 ml Proben aus den Kolben nehmen, in 15 ml Kunststoffröhrchen übertragen, die Zellen durch Zentrifugieren 10 min bei 4.000 x g in einer Standardtischzentrifuge ernten und den Überstand entsorgen.
6. Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml frischem LB-Medium aus und übertragen Sie die Zellen in einen sterilen 1,5 ml Reaktionsbecher. 0,5 ml 50 % steriles Glycerin hinzufügen, die Suspension durch rigoroses Wirbeln mischen und die Proben bis zur weiteren Behandlung in einem Gefrierschrank von -80 °C lagern.
7. Inkubieren Sie die Zellen, die in den Schüttelkolben für bis zu 24 Stunden bei 37 °C und 220 U/min übrig bleiben. Halten Sie die Schüttelkolben im Dunkeln, um ein Photobleichmittel der Fluorophore zu verhindern.
8. Nehmen Sie weitere Proben von 0,1 ml nach 7 Stunden und 24 Stunden Wachstum. Messen und beachten Sie die OD₆₀₀ von 1:10 Verdünnungen (in C-Glc oder CE-Glc minimal medium) der Proben.
9. Nehmen Sie die entsprechende Menge an Zellen aus jeder Kultur, um Kryostocks herzustellen, die eine OD₆₀₀ von 1,0 haben. Bewahren Sie die Proben bis zur weiteren Behandlung bei -80 °C auf.

3. Probenbehandlung, Beschichtung und Inkubation für quantitative Analysen

1. Nach dem Sammeln aller Proben die Kryostocks auftauen und die Zellen in einer 0,9%igen Salinlösung (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) bis zu 10^-3verdünnen.
2. Platte 0,1 ml der 10^-3 Verdünnungen auf SP-Mittelagarplatten und verteilen die Zellen mit sterilen Glaspipetten.
3. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.

4. Zählen der Überlebenden durch Stereo Fluoreszenzmikroskopie für die quantitative Analyse

1. Teilen Sie den Boden der Agarplatte mit einem schwarzen Stift in vier Teile für eine bessere Orientierung, während die Überlebenden unter dem Stereofluoreszenzmikroskop gezählt werden.
2. Stellen Sie die Platte kopfüber unter das Mikroskop und bringen Sie die Kolonien mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.
3. Sobald die Kolonien im Fokus sind, wechseln Sie zum entsprechenden Filtersatz für CFP, um die überlebenden Zellen des cfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden dieser Sorte, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und notieren Sie die Zahl.
4. Entfernen Sie die Etiketten mit Ethanol, und wechseln Sie zum YFP-Filtersatz, um die verbleibenden Zellen des yfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden erneut, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und die Zahl notieren.

5. Probenbehandlung und Mikroskopie für semiquantitative Analysen

1. Zur Veranschaulichung der Abbildungen erkennen Sie 10 l der Verdünnung von 10^-4 (ca. 100 Zellen) aus Schritt 3.1 auf einer SP-Agarplatte (siehe Abbildung 3).
2. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.
3. Stellen Sie die Petrischale ohne Deckel unter das Mikroskop und bringen Sie den Punkt mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.
4. Machen Sie Fotos von den Spots für illustrative Figuren. Wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit, um die Bilder der Kolonien mit der Kaltlichtquelle zu machen.
5. Ohne die Platte zu bewegen, wechseln Sie zum CFP-Filtersatz, passen Sie die Belichtungszeit an und machen Sie ein Bild. Tun Sie das gleiche mit dem YFP-Filtersatz und speichern Sie die Bilder für weitere Analysen.

6. Datenanalyse

1. Verwenden Sie Software wie Excel für die quantitativen Datenanalysen. Berechnen Sie anhand der gezählten Kolonien den prozentualen Anteil der gelben und blauen Kolonien in Bezug auf die gesamte Anzahl der Kolonien, die auf 100% festgelegt sind.
2. Verwenden Sie die berechneten Zahlen, um ein gestapeltes Balkendiagramm zu erstellen (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm wie Adobe Photoshop, um zusammengeführte Bilder der Bilder zu erstellen, die von den verschiedenen Spots aufgenommen wurden. Alternativ kann die frei verfügbare Software ImageJ, die von http://rsbweb.nih.gov/ij/ herunterladbar ist, für die Bildverarbeitung verwendet werden.
3. Öffnen Sie die Bilder von einer Stelle, die mit dem CFP-Filtersatz und dem YFP-Filtersatz aufgenommen wurden. Optimieren Sie den Kontrast und die Helligkeit, um die Hintergrundfluoreszenz von den Medien zu reduzieren.
4. Gehen Sie zu einem der Bilder und wählen Sie alle aus. Kopieren Sie das Bild, und fügen Sie es in das andere Bild ein.
5. Verwenden Sie entweder die Funktion "Color Dodge", um die Bilder zusammenzuführen, oder überlagern Sie die fluoreszierenden Bilder über die Registerkarte Kanäle. Zusammengeführte Bilder der Kolonien aus verschiedenen Medien und unterschiedlichen Zeitpunkten stellen das Wachstum der verschiedenen Stämme innerhalb der flüssigen Kultur dar.

7. Spezifische Tipps: Farbstoffschalter-Experiment und Kokultivierung von isogenen Stämmen, die mit cfp und yfp gekennzeichnet sind

Die Expression eines der beiden fluorophorkodierenden Gene in B. subtilis könnte die Fitness und damit die Wachstumsrate der Bakterien beeinflussen. Daher wird empfohlen, die folgenden Experimente durchzuführen, um auszuschließen, dass die Eliminierung eines KonkurrierendenStamms aus der Zellpopulation während des Anbaus einfach auf eine negative Wirkung des Fluorophors zurückzuführen ist:

1. Wiederholen Sie das ganze Experiment und kokultiv beschriftete Stämme(z.B. wird der frühere cfp-markierteStamm nun mit dem yfp-Gen beschriftet und umgekehrt). Obwohl inverse, sollten die erhaltenen Ergebnisse mit der vorherigen Beobachtung vergleichbar sein, dass ein Stamm einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber dem anderen Stamm hat.
2. Wiederholen Sie das gesamte Experiment und kokultivieren Sie isogene Stämme mit yfp und cfp (z.B. BP40 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-yfp) und BP41 (rocG⁺ gudB^CR amyE::P_gudB-cfp)). Schätzen Sie die negativen Auswirkungen eines der beiden Fluorophore auf die Fitness der Bakterien, indem Sie die Zusammensetzung der Zellpopulation im Laufe der Zeit verfolgen.

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Ergebnisse

Die hier beschriebene Methode wurde erfolgreich angewandt, um den Wettbewerb innerhalb von Arten in einer Zellpopulation zu visualisieren, die aus B. subtilis-Stämmen besteht, die mit den cfp- und yfp-Genen gekennzeichnet wurden, die die Fluorophore CFP bzw. YFP kodieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann die Methode verwendet werden, um den Wettbewerb innerhalb der Spezies sehr anschaulich zu visualisieren. Durch das Aufspüren der Proben auf kleinen Flächen wurde die klon...

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Diskussion

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Wettbewerbstauglichkeit von Bakterien zu analysieren¹⁶. In vielen Fällen wurden die Bakterien mit verschiedenen Antibiotika-Resistenzkassetten¹⁷gekennzeichnet. Ähnlich unserem Ansatz ermöglicht die Kennzeichnung der Zellen mit Antibiotikaresistenzkassetten die Beurteilung der Wettbewerbstauglichkeit der Bakterien während der Kokultivierung unter definierten Wachstumsbedingungen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wettbewerbstaug...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Roth, Germany	3746
Agar	Difco, USA	214010
Ammonium ferric citrate (CAF)	Sigma-Aldrich, Germany	9714
CaCl2	Roth, Germany	5239
Glucose	Applichem, Germany	A3617
Glycerol	Roth, Germany	4043
K2HPO4•3H2O	Roth, Germany	6878
KCl	Applichem, Germany	A3582
KH2PO4	Roth, Germany	3904
KOH	Roth, Germany	6751
MgSO4•7H2O	Roth, Germany	P027
MnCl2	Roth, Germany	T881
MnSO4•4H2O	Merck Millipore, Germany	102786
NaCl	Roth, Germany	9265
Nutrient broth	Roth, Germany	X929
Potassium glutamate	Applichem, Germany	A3712
Tryptone	Roth, Germany	8952
Tryptophan	Applichem, Germany	A3445
Yeast extract	Roth, Germany	2363
1.5 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,690,001
2.0 ml Reaction tubes	Sarstedt, Germany	72,691
15 ml Plastic tubes with screw cap	Sarstedt, Germany	62,554,001
Petri dishes	Sarstedt, Germany	82.1473
1.5 ml Polystyrene cuvettes	Sarstedt, Germany	67,742
15 ml Glass culture tubes	Brand, Germany	7790 22
100 ml Shake flasks with aluminium caps	Brand, Germany	928 24
Sterile 10 ml glass pipettes	Brand, Germany	278 23
Incubator (28 and 37 °C)	New Brunswick	M1282-0012
Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl)	Eppendorf, Germany	4910 000.034, 4910 000.042,
Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes	Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany	75002425
Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes	Heraeus Biofuge Primo R, Germany	75005440
Standard spectrophotometer	Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany	80-2112-21
Stereofluorescence microscope	Zeiss SteREO Lumar V12, Germany	495008-0009-000
Freezer (-20 and -80 °C)	-	-
Fridge (4 °C)	-	-
Autoclave	Zirbus, LTA 2x3x4, Germany	-
pH meter	pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany	766
Vortex	Vortex 3, IKA, Germany	3340000
Balance	CP2202S, Sartorius, Germany	replaced by
Black pen (permanent marker)	Staedler, Germany	317-9
Powerpoint program	Microsoft, USA	-
Office Excel program	Microsoft, USA	-	Program for data processing
Adobe Photoshop CS5	Adobe, USA	replaced by CS6, download	Computer program for image processing
Computer	PC or Mac	-
ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope	Zeiss, Germany	410135 1002 110	AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss
Specific solution recipes
SP Medium
8 g Nutrient broth
0.25 mg MgSO4•7H2O
1 g KCl
15 g agar for solid SP medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration
1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration
2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
LB Medium
10 g Tryptone
5 g Yeast extract
10 g NaCl
15 g agar for solid LB medium			if required
add 1 L with H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
C-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
25 ml Glucose (20%)			autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
CE-Glc Minimal Medium
200 ml 5 x C salts
10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration
10 ml III’ salts
20 ml Glutamate (40%)
25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C
add 1 L with sterile H2O
5 x C salts
20 g KH2PO4
80 g K2HPO4•3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
III’ salts
0.232 g MnSO4•4H2O
12.3 g MgSO4•7H2O
add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C
40% Glutamate solution
200 g L-Glutamic acid
adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
0.9% Saline (NaCl) Solution
add 1 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
50% Glycerol solution
295 ml Glycerol (87%)
add 0.5 L with sterile H2O			autoclave for 20 min at 121 °C
Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168)
Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)	Laboratory strain collection
Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp)
Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp)