Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

Zusammenfassung

Stress-Granulat (DMS) sind zytoplasmatische RNA Granulat installiert Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) und in der zellulären Antwort auf verschiedene Belastungen wichtig enthalten. Dynamik der SGs können in lebenden Zellen durch die Visualisierung der Lokalisation einer markierten Komponente von SGs in transfizierten primären Zellen nach Stress verfolgt werden.

Zusammenfassung

SGs in Zellen durch Immunfärbung von spezifischen Proteinkomponenten oder polyA + mRNAs visualisiert werden. SGs sind sehr dynamisch und die Untersuchung ihrer Montage und Schicksal ist wichtig, um die zelluläre Reaktion auf Stress zu verstehen. Der Mangel an Schlüsselfaktoren der SGs wie G3BP (RasGAP SH3-Domäne Binding Protein) führt zu Entwicklungsstörungen bei Mäusen und Veränderungen des zentralen Nervensystems. Um die Dynamik von SGs in Zellen aus einem Organismus, man kann Kultur primären Zellen zu untersuchen und folgen Sie der Lokalisierung eines transfizierten markierten Komponente der SGs. Wir beschreiben Zeitraffer-Experiment zu beobachten G3BP1 haltigen SGs in embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF). Diese Technik kann auch verwendet werden, um G3BP enthaltenden DMS in lebenden Neuronen zu untersuchen, die von entscheidender Bedeutung ist, wie es vor kurzem gezeigt, dass diese SGs sind beim Einsetzen von neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer-Krankheit, gebildet werden. Dieser Ansatz kann auf jeden anderen Zellkörper und Granulat Proteinkomponente angepasst und durchmit transgenen Tieren, so dass die Live-Studie von Granulaten Dynamik zum Beispiel in der Abwesenheit eines spezifischen Faktors dieser Granulate.

Einleitung

Stress Granulate (SGs) nicht membranöse zytoplasmatischen Foci als zelluläre Schutz Reaktion auf Umweltstress, z. B. erhöhte Temperatur, oxidativer Stress, Hypoxie, osmotischen Schock, UV-Bestrahlung, Glukoseentzug oder virale Infektion ¹ gebildet. Sie können chemisch durch Behandlung mit Verbindungen wie Natriumarsenit, die oxidativen Stress auslöst, induziert werden. SGs akkumulieren installiert Übersetzung verhaftet Messenger ribonucleoprotein (mRNPs)-Komplexe ^2, Maskierungs mRNAs von der Translationsmaschinerie und deren Montage kann durch die Phosphorylierung von eIF2a (eukaryotische Initiationsfaktor α 2) ausgelöst werden. SGs sind dynamische Strukturen, die Komponenten mit den Polysomen und andere Granulate, wie die P-Gremien auszutauschen. Sie bilden eine "Triage-Zentrum", wo mRNAs werden sortiert und entweder für Übersetzung, Reinitiierung, Abbau oder Verpackung in stabilen, nicht-polysomaler mRNPs ³ verarbeitet. Die Montage ist schnell SGs but ist es ein schleichender Prozess mit Anfangs zahlreiche kleine Aggregate, die in größere Körnchen zusammenwachsen. Die Verwendung von chemischen Inhibitoren, die stören oder Mikrotubuli stabilisieren zeigt, dass das Mikrotubulus-Netzwerk für SG Dynamik einschließlich Montage und Demontage Koaleszenz Verfahren erforderlich sind.

Die dynamische Anordnung von SGs auch durch Aggregation von spezifischen RNA-bindenden Proteinen (RNA-BP) wie TIA-1 (T-Zell-Antigen-Innen 1) und gefördert TIAR (TIA-1-verwandtes Protein), die in der Lage sind, zu dimerisieren und zu fördern Polysom ​​Demontage und das Routing von mRNAs in SGs ^4. G3BP (RasGAP SH3-Domäne-bindendes Protein) ist ein solches RNA-BP, die SGs lokalisiert, wenn die Zellen mit Arsenit oder Hochtemperatur betont, und die Überexpression von dephosphoryliert G3BP können SGs Anordnung ⁵ induzieren.

G3BP ist eine evolutionär konservierte RNA-BP, die zunächst durch die Interaktion mit einem Ras-GTPase-aktivierendes Protein gekennzeichnet war (p RasGAP120 ^6); aber diese Wechselwirkung wurde vor kurzem überarbeitet ^7. Die Familie G3BP zwei Mitglieder bei Säugetieren, G3BP1 (als G3BP genannt) und G3BP2 ^8. Beide Proteine ​​co-lokalisieren in SGs, wenn die Zellen auf Stress ⁹ unterzogen. Den kanonischen RNA-Erkennungsmotiv (RRM) mit konservierten RNP1 und RNP2 Motive: G3BPs umfassen eine N-terminale Domäne NTF2 vorgeschlagen, um ihre Lokalisation und Oligomerisierung, gefolgt von Prolin-reiche (PxxP) Motive zu beeinflussen, dann C-terminalen Motive mit RNA-Bindung verbunden durch eine Arginin-Glycin reichen (RGG) Feld gefolgt. Interessanterweise ist die Analyse der verschiedenen Teile des Proteins durch Konstruktion verschiedener Domänen EGFP fusioniert zeigte, dass die NTF2-ähnliche Domäne und die RNA-Bindungsdomäne waren die effizient SGs rekrutiert, was auf die Bedeutung der Eigenschaften der Dimerisierung und RNA-Bindung in die Montage der SGs. Diverse Modelle haben unterschiedliche Funktionen von Proteinen in vitro G3BP ^10-13 offenbart.Unterbrechung G3BP in Mäusen haben die Bedeutung dieses Proteins in der Entwicklungs Wachstum und Überleben ^14, sowie eine wichtige Rolle für G3BP in das zentrale Nervensystem (ZNS), von Ataxie und Defekte in der räumlichen Arbeitsspeicher ¹⁵ gekennzeichnet dargestellt. G3BP Mangel führt zu veränderten neuronalen Plastizität und Calcium-Homöostase und stellt eine direkte Verbindung zwischen SG Bildung und neurodegenerative Erkrankungen ^15. Es ist daher wichtig, um die Dynamik der SGs in primären Zellen wie Neuronen zu studieren.

Dieses Protokoll bietet einen einfachen Weg, um die Montage von G3BP1 haltigen SGs in primären Zellen unter Arsenit Behandlung zu beobachten. Es kann verwendet werden, um DMS Anordnung unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, zum Beispiel verschiedene Arten von Spannungen werden. Es kann auch zu anderen Granulaten oder anderen Bestandteilen der SGs angepasst werden. Tatsächlich konzentriert sich dieses Protokoll auf G3BP1, aber es gibt andere Stress Granulat Marker wie TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein-Syndrom) ^16, TDP-43 (transaktiven Reaktion DNA-bindendes Protein 43) ^{18 17} oder Staufen. Insbesondere Proteine ​​wie TIA-1 / R sind wie G3BP, Keim RNA-bindende Proteine, die SGs Montage induzieren kann, wenn überexprimiert wird, auch wenn die verschiedenen geformt SGs in Funktion, Regulation und zugehörigen Transkripte unterscheiden. Transfektion von Fluorophor-markierte Version eines dieser Schlüsselkomponenten oder Nucleatoren von SGs können, um bestimmte Bild SGs Montage und Dynamik durchgeführt werden.

Protokoll

Alle Tier-Verfahren in diesem Protokoll sind die strikte Einhaltung der Richtlinien der Richtlinie vom 24. November 1986 (86-609/EEC) European Community Council. Haus die Mäuse in der Gruppe, so dass Nahrung und Wasser ad libitum. Pflegen sie in einer kontrollierten Umgebung (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% Luftfeuchtigkeit) mit einem 12 Std.: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus (Licht an um 7.00 Uhr).

1 Kultur von murinen Primärzellen:. Embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

1. Autoklav dünnen Pinzette sowie gebogene Pinzette und Schere sezieren. Bewahren Sie in einem sterilen Behälter. Sterile D-PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Vorbereitung abgeschlossen MEFs Medium: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), 1 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,5 mM 2-Mercaptoethanol ergänzt und warm bei 37 ° C
2. Euthanize eine schwangere Maus (13,5 Tage nach coitum (dpc)), Durch zervikale Dislokation. Entfernen Sie die Gebärmutterhörner von der Maus mit 90% EtOH desinfiziert. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in 37 ° C vorgewärmt D-PBS. Die Hörner, Ort öffnen die Embryonen in einem 100 mm sterile Kunststoffpetrischale, reinigen Sie sie aus der Nabelschnur Material und waschen Sie sie mit warmem D-PBS, um den Blutüber entfernen. Unter einem Fernglas, entfernen des Embryos Gliedmaßen, die inneren Organe und der obere Teil des Kopfes, welche die Gehirn.
3. In einer neuen Petrischale, die Hackfleisch Embryonen in sehr kleine Stücke mit einer sterilen chirurgischen Klinge Schere oder (zumindest für 1 min). Im Fall von Embryonen verschiedener Genotypen, vorsichtig sein, jeden einzelnen Embryo in Petrischalen gelegt und halten den Schwanz oder die oberen Kopf für die Genotypisierung.
4. Bedecken Sie den Embryo mit 1x Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 1 mM EDTA). Inkubation für 30 min bis 1 h in einem 37 ° C Inkubator. 10 ml KomplettMEFs mittel-bis Trypsin-Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um alle Aggregate zu entfernen. Lassen Sie sich die Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen (gefüllt mit Komplettmedium) für 10 min zentrifugiert und der Überstand für 5 Min. bei 300 × g bei Raumtemperatur. Das Pellet in Vollmedium (6 ml für 1 Embryo). Lebensfähige kernhaltigen Zellen können mit Trypanblau gezählt werden blau (Etwa 5 x 10 ⁶ Zellen können von einem Embryo zu erwarten). Plate 3 ml pro 60 mm Petrischale.
5. Ändern Sie das Medium am nächsten Tag und damit die Zellen wachsen, bis die Gerichte werden konfluent. Viele Zelltypen zu erkennen, sondern nur Fibroblasten Subkultur überleben.
6. Teilen Sie die Zellen und es ihnen ermöglichen, in 35 mm-Schalen mit Glasboden (wichtig für Zeitraffer-Experiment) wachsen, bis 50-70% Konfluenz für die Transfektion. Test auf Mykoplasmen und Maus Pathogene.

2. Kultur Adaptations im Fall von Neuronen

1. Am Tag vor der Kultur, Fell 35 mm Glasboden-Petrischalen mit Poly-L-Lysin (200 ul von 0,1 mg / ml) unter einer sterilen Haube und sauber, und lassen Sie über Nacht.
2. Am nächsten Morgen gründlich mit sterilem reinem Wasser, zweimal für 5 Minuten und einmal 45 Minuten bis 1 Stunde. Ersetzen mit 2 ml DMEM plus 10% FBS-Medium und halten in einem 37 ° C-Inkubator.
3. Dissect Embryonen bei 18,5 dpc. Unter einer sterilen Haube und sauber, legen die Hörner mit den Embryonen in kaltem sterilem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) in 100 mm Petrischale. Neugeborenen Welpen können auch anstelle von Embryonen, um die Lebensdauer des Dammes zu erhalten, und um weitere Nachkommen zu erzeugen, insbesondere im Falle von transgenen Tieren, die schwierig zu erhalten sein können verwendet werden. In einzelnen Petrischalen, nehmen Sie jede Embryo oder Neugeborenen und schneiden den Kopf mit einer Schere. Halten Sie den Kopf durch das Einfügen einer gebogenen Pinzette in die Augen, schneiden Sie die Haut und öffnen Sie vorsichtig das weiche Schädel von der Rückseiteder Kopf, bis die Augen, auf jeder Seite des Kopfes. Schneiden Sie die Sehnerven und Hirnstamm, entfernen Sie das Gehirn, und steckte es in eine neue Petrischale mit HBSS. Unter einem Stereoskop, entfernen Sie alle Hirnhäute mit zwei dünnen Pinzette. Trennen den Hippocampus, den Kortex oder einem anderen Teil des Gehirns abhängig von der Struktur zu untersuchen.
4. Tauchen Sie den sezierten Hirnstruktur in 4,5 ml kaltem HBSS zuvor vorbereitet in 15-ml-Röhrchen und auf Eis zu halten, bis die Verdauung mit Trypsin. 0,5 ml von 2,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 15 min bis 20 min. Spülen Sie die Trypsin 3x mit HBSS, äußerst vorsichtig, um die Hirnteile nicht verdaut zu verwerfen.
5. Resuspendieren in 500 ul (Hippocampus) auf 1 ml (Cortex) DMEM plus 10% FBS und und abpipettieren mehrmals mit einer 1 ml-Mikropipette mit einer 1 ml-Spitze ausgestattet ist, dann mit 1 ml plus 200 ul Spitzen ausgestattet, bis es keine sichtbaren Aggregat.
6. Verteilen 100-200 ul Zellsuspension in jede 35 mm Glas bottom Schale mit DMEM plus 10% FBS und lassen die Neuronen haften bei 37 ° C für mindestens 3 Stunden. Ersetzen durch vorgewärmte Neuron Vollmedium (Neurobasalmedium, ergänzt mit 250 uM L-Glutamin und NS21, hergestellt wie in Chen et al. Beschrieben ¹⁹⁾ und lassen bei 37 ° C, um neuronale Wachstum zu ermöglichen. Transfektion die Neuronen bei 5 bis 14 Tagen in vitro (div) (die Effizienz der Transfektion höher nach ein paar div aber synaptischen Verbindungen besser 7-10 div etabliert sind).

3. Transfektion von EGFP-Konstrukt G3BP1

Transfizieren der Zellen mit einem Vektor, der die cDNA des Proteins von Interesse (jede Komponente des DMS) mit einem fluoreszierenden Marker (GFP, YFP, etc.) fusioniert, unter Verwendung von 3 ug gereinigte Plasmid pro 35 mm-Schale.

1. Transfektion die MEFs mit einem handelsüblichen Verfahren, nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
2. Transfektion die Neuronen mit einem Calcium-Phosphat-Methode von Xia et al ²⁰ Kurz angepasst.:
   1. Bereiten Sie die Lösungen: DMEM-Wasch: DMEM mit 25 mM KCl; Transfektionslösung: DMEM-Wasch aus 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl ₂ 10 mM, Phenol-Rot); und Schock Lösung: HeBS 1x, 1x DMKY und DMSO 2% (v / v); und halten sie bei 37 ° C
   2. Entfernen Sie die Medien aus den Neuronen, Filtrat, und halten Sie sie bei 37 ° C Waschen mit DMEM-Wasch dann mit Transfektionsmediums ersetzen und bei 37 ° C zu halten während der Herstellung der Calciumphosphat-Plasmid-DNA ausfällt.
   3. In einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen (in dieser Reihenfolge) Braun Wasser (Endvolumen 50 &mgr; l), 5 &mgr; l 2,5 M CaCl _2, und 3 &mgr; g Plasmid-DNA. Lassen Sie diese Mischung auf 50 ul HeBS 2x bereits in einem Rund Polypropylen-Röhrchen eingeführt. Mischen Sie den Schlauch durch die Drehung zusammen mit dem Ablegen. Den Niederschlag Form bei Raumtemperatur während 30 min.
   4. Fügen Sie den precipitate tropfenweise auf die Nervenzellen und lassen bei 37 ° C während 30 bis 50 min.
   5. Ersetzen mit Schock-Lösung für 1 min, dann mit DMEM-Wasch spülen und schließlich die Wiedereinführung vorkonditioniert Medium. Halten der Zellen bei 37 ° C.

4. Visualisierung von G3BP Enthält SGs Versammlung und Dynamics

1. Ersetzen Sie das Medium der Zellen, die Phenol-Rot von Phenolrot-freiem Medium enthält.
2. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit Fluoreszenz für die Akquisitionen ausgestattet. Schalten Sie die Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Wärmen Sie die Kammer auf 37 ° C mindestens 20 min vor Beginn der Akquisitionen.
3. Die Überexpression von G3BP induziert die spontane Bildung einer Art von SGs. Die Zellen können daher für die Montage der SGs 24 Stunden direkt nach der Transfektion ohne Stressinduktion beobachtet werden. Alternativ können Stress induziert werden, um weitere induzieren die von SGs. In 0,5 mM Natriumarsenit und Sternet die Übernahme kurz nach der Zugabe der Verbindung (Granulat wird gut innerhalb 1 Stunde gebildet werden.)
4. Öl in der Immersionsobjektiv (40X oder 63X verwenden Ziele) und installieren Sie die Petrischale vor dem Ziel, in der 35 mm angepasst Mikroskop Halter stabilisiert Halter auf der Bühne. Überprüfen Sie, dass das Gericht ansonsten flachen die Akquisitionen verändert werden. Einschalten des Fluoreszenzlichts nach der entsprechenden Fluorophors und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist im Bereich um die Bleich und Zytotoxizität zu minimieren.
5. In der "erwerben Reiter", wählen Sie die Laser in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge des Tags Fluorophor (488 nm in unserem Protokoll, das EGFP-markierten G3BP verwendet), und wählen Sie den Emissionslänge angepasst für den PMT (Photomultiplier). Stellen Sie die Laserleistung (in der Regel nicht mehr als 10%), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie den Gain-und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verändern.Schnelle Scannen (1000 Hz), um die Dauer der Laser Exposition (Linie 2 Durchschnitt, Rahmen Durchschnitt 1) ​​zu minimieren. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stapel in der Lage sein, um das Bild in 3D (Z ein Schritt von 1 um ist in der Regel gut mit Zellen) zu rekonstruieren. Bestimmen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb: kleinere Intervalle erlauben, eine kohärentere Film zu erhalten, aber dies kann Photobleaching und Toxizität (ein Intervall von 20 Sekunden wurde in den beschriebenen Experimenten verwendet) zu induzieren. Dauer der gesamten Anschaffungs je nach Belastung variieren. Viele G3BP haltigen SGs sehr schnell unter Arsenit Behandlung gebildet und sind gut sichtbar nach 1 Stunde der Behandlung: in diesem Fall, wählen Sie die Zellen schnell zu filmen und starten Sie die Akquisitionen direkt nach dem Stress, mit einer Gesamtdauer von Akquisitionen von 15 - 20 Minuten weitgehend ausreichend, um die Montage mehrerer SGs zu beobachten.
6. Speichern Sie die Bilder und rekonstruieren die Stapel-und Film mit ImageJ Software.

Ergebnisse

Stress Granulatbildung in der Reaktion der Zellen auf Stress wichtig, was eine zelluläre Adaption mit Übersetzung ins Stocken geraten, bis die Belastung behoben ist, der Verhinderung der Apoptose assoziiert sind. Dieser Test ermöglicht es, die SGs in primären Zellen zu untersuchen, indem Sie die Lokalisierung von Schlüssel SGs Proteinkomponenten (Abbildung 1). G3BP, ein Schlüsselfaktor für SGs Montage ist derzeit eher diffus im Zytoplasma von kultivierten Neuronen oder MEFs (2A a...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte im Protokoll betreffen die Transfektion und insbesondere der Zeitraffer-Akquisitionen, die sorgfältig, um weiter unten die Zytotoxizität überwacht werden müssen.

Kultur von Primärzellen ist nicht eine schwierige Teil, solange sterilen Bedingungen eingehalten werden und Vorsicht, um Schäden während der Präparation und Zelldissoziation Schritte zu verhindern. MEFs kann in frühen Passagen eingefroren werden. Neuron Transfektion mit Calciumphosphat wurde gezeigt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5