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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.

Zusammenfassung

Neuronen der Hirnrinde während der Gehirnentwicklung von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC), die einen mehrreihigen Epithel der lateralen Ventrikel des embryonalen Gehirn bilden erzeugt. Genotoxischen Stress, wie ionisierende Strahlung, haben hocheilige Wirkungen auf das sich entwickelnde Gehirn, um die hohe Empfindlichkeit NSPC bezogen. Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen hängt von der Charakterisierung der DNA-Schadensantwort dieser bestimmten Arten von Zellen, die ein genaues Verfahren erfordert NSPC Progression durch den Zellzyklus in der beschädigten Gewebe zu bestimmen. Hier ist eine Methode, die auf aufeinanderfolgende intraperitoneale Injektionen von EdU und BrdU bei schwangeren Mäusen und weiteren Nachweis dieser zwei Thymidin-Analoga in koronalen Abschnitte des embryonalen Gehirns gezeigt. EdU und BrdU sowohl in DNA replizierender Zellen während der S-Phase eingearbeitet und werden von zwei verschiedenen Techniken (Azid oder detektiertein spezifischer Antikörper bezeichnet), die ihre gleichzeitige Detektion zu erleichtern. EdU und BrdU-Färbung werden dann für jedes NSPC Kern in Abhängigkeit von seinem Abstand von der ventrikulären Marge in einem Standardbereich der dorsalen Telen bestimmt. Damit diese doppelte Markierungstechnik ermöglicht die Unterscheidung Zellen durch den Zellzyklus von denen, die Zellzyklus-Kontrollpunkt, die zu Zellzyklusarrest in Reaktion auf DNA-Schäden aktiviert fortgeschritten.

Ein Beispiel für ein Experiment vorgestellt, in dem EdU wurde vor der Bestrahlung und unmittelbar nach BrdU injiziert und Analysen innerhalb der 4 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt. Dieses Protokoll stellt eine genaue Analyse der DNA-Schadensantwort akuten NSPC der in Abhängigkeit von der Phase des Zellzyklus in der sie bestrahlt wurden. Dieses Verfahren ist leicht umstellbar auf viele andere Systeme, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf die Zellzyklus-Progression in lebenden Geweben zu bestimmen.

Einleitung

Während der embryonalen Entwicklung des Gehirns, werden Projektionsneuronen des zerebralen Kortex in der ventrikulären Zone erzeugt wird, ein mehrreihigen Epithel von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC) besteht, die Linien der lateralen Ventrikel. Unter NSPC die radialen Gliazellen (RGC), die als neuronale Stammzellen dienen, unterzogen interkinetic Kernwanderung (INM): sie Mitose führen an der Oberfläche der Herzkammer und der S-Phase an der Grundgrenze des ventrikulären Zone (VZ) 1, 2,3. Sie können entweder symmetrisch teilen, um zwei RGC erzeugen oder asymmetrisch um ein RGC und ein Neuron oder eine Zwischenvorläuferzelle (IPC) 4, 5 zu erzeugen. IPC wandern zu einer darüberliegenden Schicht wuchernden genannt Subventrikularzone (SVZ), wo nach einem letzten symmetrische Teilung sie zwei unreifen Projektionsneuronen 6-8 generieren. Im Gegensatz zu RGC, IPC nicht unterziehen INM (9 Bewertung). Neu erzeugte Neuronen MIGRaß radial entlang der radialen Fasern durch die Zwischenzone (IZ) an ihren Bestimmungsort in der kortikalen Platte (CP) 10, 8 zu erreichen. Das perfekte Timing aller dieser Ereignisse ist von wesentlicher Bedeutung für eine korrekte kortikalen Entwicklung. Zum Beispiel der Wechsel von Proliferation, die Differenzierung von neuronalen Vorläuferpopulationen wird durch die Dauer der G1-Phase 11, 12 gesteuert. Die Verlängerung der G1-Phase korreliert somit mit der Zelldifferenzierung.

Genotoxische Stress, wie ionisierende Strahlung, stark beeinträchtigen die Entwicklung des Gehirns (in 13 überprüft). Wir und andere haben gezeigt, dass NSPC sind sehr anfällig für strahlungsinduzierte Apoptose 14, 15,16. Ionisierende Strahlung induziert DNA-Doppelstrangbrüche, die am meisten zu schweren Schäden an wuchernden Zellen sind. Eine wesentliche Komponente der DNA-Schadensantwort (DDR) in Rad-Zellen die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in der G1 / S oder G2 / M-Übergänge oder während SPhase (intra-S-Checkpoint) 17-21. Sie blockieren die Zellzyklus-Progression, um Zeit für DNA-Schäden zu reparieren oder Beseitigung von beschädigten Zellen zu liefern. Folglich kann Zelltod sowie verzögerte Progression des Zellzyklus die Entwicklung des Gehirns als Reaktion auf ionisierende Strahlung 22-24 verändern. Es war daher interessant, ein Verfahren, um die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in NSPC im bestrahlten Maus embryonale Gehirn beurteilen zu entwickeln.

Das Fortschreiten des Zellzyklus wird routinemäßig mit dem Einbau eines Thymidin-Analogon, 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) gefolgt. BrdU während der S-Phase des Zellzyklus, wenn die DNA repliziert aufgenommen. Die Verwendung von einem Antikörper gegen BrdU ermöglicht danach die Detektion von Zellen, in die S-Phase während des Pulses von BrdU waren.

Eine neuartige Thymidin-Analogon, 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EDU) von einem fluoreszierenden Azid detektiert. Die verschiedenen Möglichkeiten, um EdU und B zu erkennen RDU nicht kreuzreagieren, 25, die den gleichzeitigen Nachweis beider Thymidin-Analoga, die nützlich für das Studium der Zellzyklusprogression ist. Normalerweise Zellen werden zunächst mit EdU gepulst und dann mit BrdU, wo die Zeit zwischen den beiden Eingemeindungen dauert zwei Stunden 25, 26 gepulst. Zugabe von BrdU in Kulturmedien, die EdU führt vorzugsweise Einbau von BrdU in die DNA unter Ausschluss von Bildung, während gleichzeitiger Zugabe von 25 EdU mit äquimolare oder äquimolare BrdU Hälfte der Medien ergibt nur BrdU-Inkorporation 27. Dies erleichtert die doppelten Markierungsprotokoll durch die Beseitigung der Waschschritte, die normalerweise erforderlich sind, um die erste Markierung aus dem Kulturmedium vor der Zugabe des zweiten Etiketts zu entfernen. Dies ist auch von besonderem Interesse für die in-vivo-Studie, in der die Waschschritte sind nicht möglich, den genauen Zeitpunkt der S-Phase Eintritt oder Austritt von Zellpopulation zu bestimmen.

t "> Kürzlich wurde ein Verfahren zur Zwei-Puls-Markierung in embryonalen Mäusehirn EdU und mit BrdU 23, 24,22 ist entwickelt worden, um die Zellzyklusprogression und INM der NSPC nach Bestrahlung in utero zu analysieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass bei S-Phase, Maus-Zellen replizieren zunächst die Euchromatin Regionen und dann die perizentrischen Heterochromatin 28,29,30. Interessanterweise perizentrischen Heterochromatin von verschiedenen Chromosomen in interphasic Kerne gruppiert, um heterochromatischen Herde auch als Chromozentren bekannt und leicht durch DAPI-Färbung als helle Herde nachweisbar bilden. Daher werden die Differenz EdU und BrdU-Färbungen von Euchromatin und Chromozentren half uns, genauer zu analysieren Fortschreiten der S-Phase NSPC.

Diese Methode erlaubt die Demonstration der scheinbaren Mangel an G1 / S Kontrollpunkt in NSCP 22-24, die ganz überraschend ist, da diese Checkpoint soll entscheidend für die Genomstabilität sein. Mehrere experimental Designs basierend auf verschiedenen Kombinationen von Bildung und BrdU-Impulse werden verwendet, um die Zellzyklusprogression in der ventralen und dorsalen Telen analysieren. Hier geben wir ein Beispiel für die Protokolle, die die Untersuchung der akuten DNA-Schäden von NSPC innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Bestrahlung in utero E14.5 Mausembryonen.

Protokoll

1. Tierverfahren

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Richtlinie Europäischen Gemeinschaften Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) entwickelt und ist von unseren institutionellen Ausschusses für Tierschutz (Cetea-CEA DSV IdF) genehmigt worden.

  1. Injektionen mit EdU / BrdU und Bestrahlung von E14.5 schwangeren Mäusen (Abbildung 2A).
    1. Eine Lösung aus EdU bei 1 mg / ml BrdU und bei 5 mg / ml in PBS. Ausführen einer intraperitonealen (ip) Injektion von 100 ul EdU Lösung unter Verwendung einer 25 G-Nadel in schwangeren Mäusen. 1,5 Stunden später, bestrahlen Mäusen (Ganzkörperbestrahlung) bei 0 Gy oder 2 Gy (0,6 Gy / min). Unmittelbar nach injizieren (IP) 200 ul BrdU-Lösung mit einer 25 G Nadel in den schwangeren Mäusen.
  2. Vorbereitung der koronalen Scheiben von embryonalen Gehirnen.
    1. Bei 1 h oder 4 Stunden nach der Bestrahlung, einschläfern die schwangeren Mäusen durch Kohlendioxid.
    2. Öffnen Sie die Bauch cavity über drei Zentimeter mit einer Schere. Trennen der beiden Uterushörner von dem Rest des Uterus durch Schneiden beider Enden der Hörner. Übertragung der Uterushörner in eine Petrischale mit PBS 0,6% Glucose. Öffnen der Uterushörner mit der Zange, um die Embryonen zu isolieren. Entfernen Sie die Fruchtblase von jedem Embryo mit einer Pinzette.
    3. Präparieren Sie embryonalen Köpfe mit einer Pinzette und befestigen Sie sie durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd (PFA, pH = 7,4) O / N bei 4 ° C
    4. Spülen embryonalen Köpfe in PBS für mindestens eine Nacht bei 4 ° C. Heads in PBS für mehrere Tage aufbewahrt werden.
    5. Einbettung in Paraffin Köpfe unter Verwendung einer Vakuuminfiltrationsprozessor wie in Tabelle 1 angegeben. Köpfe Einbettung kann auch unter einer chemischen Haube für Ethanol und Xylen Bäder in einem 65 ° C Ofen für die Paraffinbäder durchgeführt werden, und dann.
    6. Bereiten 5 um dicke koronale Schnitte mit einem Mikrotom.
    7. Montieren Sie auf Polylysin-beschichtete Objektträger.
    8. Folien können bei Raumtemperatur (RT) für mehrere Monate aufbewahrt werden.

2. EdU / BrdU-Färbung

  1. Entparaffinierung und Antigen-Demaskierung
    1. Entparaffinieren Paraffin eingebetteten Gehirnschnitte durch Eintauchen der Objektträger in 3 Bäder Toluol für 5 min.
    2. Rehydrieren für 3 min in 2 Bäder mit jeweils Lösungen von Ethanolkonzentration abnimmt, wie folgend: Ethanol 100%, 95% Ethanol, 70% Ethanol und 5 min in H 2 O. Folien können in entionisiertem Wasser für mehrere Stunden gehalten werden.
    3. Koche die Scheiben für 10 min in Citrat-Lösung (10 mM, pH 6) und dann in deionisiertem Wasser für 5 min inkubiert.
  2. EdU Färbung
    1. Führen EdU Erfassung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Durchdringbar Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min.
    2. Bereiten 1X EdU Puffer-Zusatz durch Verdünnen der 10X-Lösung in VE-Wasser. Diese Lösung sollte frisch hergestellt und am selben da verwendet werden,y.
    3. Bereiten EdU Reaktion Cocktail, einschließlich EdU Alexa Fluor 488 Azid. Es ist wichtig, die folgenden Bestandteile, die in Tabelle 2 aufgeführten Reihenfolge hinzugefügt, andernfalls wird die Reaktion nicht optimal ablaufen. Verwenden Sie die EdU Reaktion Cocktail innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung.
    4. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer (Schritt 2.1.1), dann zweimal mit PBS waschen.
    5. In 150 ul EdU Reaktion Cocktail, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 30 min im Dunkeln bei RT.
    6. Entfernen Sie die EdU Reaktion Cocktail, dann einmal mit PBS waschen.
  3. BrdU-Färbung
    1. Vorbereitung Sättigungspuffer 7,5% Ziegenserum und 7,5% fötales Rinderserum in PBS. In 150 ul Sättigungspuffer auf Gehirnschnitten, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT, um nicht-spezifische Antikörper blockieren verbindlich.
    2. Entfernen Sie das Deckglas. In 150 ul Maus-Anti-BrdU primären Antikörper bei 1/300 Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation O /N bei 4 ° C
    3. Entfernen Sie das Deckglas, dann waschen Sie 3-mal in PBS.
    4. In 150 ul Ziege-Anti-Maus-Alexa594 sekundären Antikörper bei 1/400, die in Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT.
    5. Entfernen Sie das Deckglas, dann einmal in PBS waschen.
    6. Kernfärbung: add 150 ul 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) bei 1 ug / ml in PBS, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation für 2 min bei RT.
    7. Montieren Sie Folien in Montagemedium.

3. Analyse

  1. Untersuchen Hirnschnitten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv oder ein konfokales Mikroskop und Bilder zu erhalten in drei Kanäle (488 nm, 594 nm und UV) trennt als Dateien.
  2. Stapeln Sie Bilder mit Photoshop-Software.
  3. Analysieren Gehirnschnitte in einem Standard-Sektor der dorsomedial Hirn Wand. Dieser Bereich ist 100 um im medial-lateralen Abmessung und ist in 18 bins (oder mehr) von 10 μ geteiltm Höhe in ihrer radialen Abmessung mit einem Raster von Bildern überlagert (Fig. 1), wie zuvor beschrieben 31.
    1. Ausrichten des Gitters wie das erste Fach ist an der ventrikulären Oberfläche mit ihrer langen Achse parallel zu der ventrikuläre Grenze. Dann die Nummer des markierten EdU, BrdU-und / oder pyknotische Kerne (entspricht apoptotischen Kerne) in jedem Fach. Anzahl einen Kern an der Grenze der beiden Fächer in den Papierkorb, die seine größeren Teil oder im unteren Behälter enthält, wenn der Zellkern befindet sich gleich Bereiche innerhalb der zwei Behälter entfernt.
  4. Die statistische Analyse.

Analysieren Sie mindestens zwei kortikalen Scheiben pro Embryo. Wiederholen Experimente an mindestens 3 Embryonen aus verschiedenen Würfen. Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben werden. Statistische Analysen sind mit Graphpad Prism mit Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni Post-hoc-Mehrfachvergleich Tests durchgeführt.

Ergebnisse

In der in Fig. 2 beschriebenen Experiment wurde EdU 1,5 h vor der Bestrahlung verabreicht wird und BrdU nur nach Bestrahlung. Vier Arten von Zellen wurden dann in den kortikalen Scheiben auf 1 oder 4 h nach Bestrahlung zubereitet aus, nach dem Einbau von BrdU oder EdU entweder beide oder keines (2A und 2B). Wichtig ist, dass weder EdU noch BrdU-Einbau verändert die Höhe der Strahlung induzierte Apoptose (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ermöglichen die Färbemet...

Diskussion

Die hier auf der Grundlage Einbau von EdU 1,5 h beschriebenen Versuchsaufbau vor der Bestrahlung und der Einbau von BrdU unmittelbar nach der Bestrahlung erlaubt die Demonstration, die nach einer NSPC sind in der Lage, S und G2 / M Kontrollpunkte aktivieren, nicht aber die G1 / S Kontrollpunkt während der 1. Stunde genotoxischen Stress in der fetalen Gehirn der Maus. Wir führten weitere Experimente, in denen EdU hat zu verschiedenen Zeiten nach der Bestrahlung und BrdU injiziert worden, nur 1 Stunde vor Mä...

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 323267 erhalten, von der Electricité de France (EDF) und von l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement Santé et Travail-(ANR-SEST, Neurorad).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
MicrotomeLeicaRM 2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kitLife TechnologiesC10083
Anti-BrdUGE HealthcareRPN2021/300
Goat anti mouse-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
Polysine slideThermo scientificJ2800AMNZ
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
Microscope BX51Olympus
Confocal microscope SPELeica
Prism softwareGraphpadVersion 5.0c
Photoshop softwareAdobe

Referenzen

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