Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Zusammenfassung

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Zusammenfassung

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Einleitung

In diesem Protokoll beschreiben wir effiziente Verfahren, um Gene in Maus-Makrophagen-Zelllinien unter Verwendung von siRNAs zu hemmen und die Wirkung dieser Behandlungen auf die angeborene Immunantwort zu überwachen. Diese Verfahren werden in 96-Well-Format durchgeführt, so dass für RNAi-Screens in Mittel- oder Hochdurchsatz-Mode.

In Reaktion auf eine Infektion, montieren Menschen sofort angeborenen Immunantwort und eine langsamere, aber bestimmte adaptive Immunantwort. Diese schnelle angeborenen Immunantwort beinhaltet die Rekrutierung und Aktivierung von phagozytierenden angeborenen Immunzellen einschließlich Makrophagen ^ein. Klassisch aktivierte Makrophagen sind im akuten Entzündungsreaktionen beteiligt und produzieren antimikrobielle Proteine ​​und Verbindungen, Zytokine und Chemokine, und präsentieren Antigene ^2,3. Alternativ aktivierte Makrophagen spielen eine Rolle bei der Regulierung der Immunität, die Aufrechterhaltung der Toleranz, die Gewebereparatur und Wundheilung ^4-8. Aufgrund ihrer breiten Palette von Funktionen, Makrophagen eine Rolle bei zahlreichen Krankheiten, darunter Arteriosklerose, Arthritis und Krebs ⁹ spielen. Somit hat das Studium der Makrophagen für einige Zeit in einer Vielzahl von Krankheitsfelder ein Schlüsselbereich der Forschung.

Trotz ihrer großen Bedeutung in der angeborenen Immunantwort kann Makrophagen werden herausfordernde Zellen, mit zu arbeiten. Insbesondere ist es schwierig, eine effiziente Transfektion mit Lipidreagenzien in Makrophagen ohne assoziierte Toxizität ^10,11 erhalten. Außerdem, selbst wenn siRNA wirksam an Makrophagen geliefert, die Robustheit der RNAi-induzierten Gens oft Knockdown kann ziemlich moderat sein und kann von Gen zu Gen variieren.

Um diese technischen Herausforderungen zu überwinden, haben wir Transfektion und Zuschlagsverfahren ^12-16 in zwei Maus-Makrophagen-Zelllinien, RAW264.7 ¹⁷ und J774A.1 ¹⁸ optimiert. Dieser Ansatz nutzt die Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System zur Transfektion; Dieses Systemverwendet eine Kombination von Spezialreagenzien und Elektroporation von Zellen in 96-well Format ¹⁹ transfizieren. Nach der Transfektion beschreiben wir Methoden zur Zellgewinnung und Lebensfähigkeit zu maximieren und die anschließende siRNA-induzierte Gen Knockdown zu maximieren. Um den Nutzen dieses Ansatzes zu verdeutlichen, beschreiben wir ein Protokoll für siRNA auf diese Makrophagen-Zelllinien, diese Zellen zu stimulieren mit Lipopolysaccharid (LPS) und überwachen die angeborene Immunantwort auf der Ebene der Produktion von mehreren pro-inflammatorischen Zytokinen. Wir stellen Beispieldaten, in denen wir den Toll-like Rezeptor (TLR) Familie, deren Mitglieder spüren LPS und andere Erreger associated molecular patterns (PAMPs), um angeborene Immunität regulieren Ziel.

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Protokoll

1. Aufrechterhaltung der Makrophagenzellinien

1. Wachsen RAW264.7 und J774A.1 Zelllinien in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ºC in Gegenwart von 5% CO _2. Zur Aufrechterhaltung der Sterilität wird mit 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) an die Medien (obwohl dies nicht unbedingt erforderlich).
2. Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die Makrophagen werden in einem gesunden Zustand wächst für eine effiziente Transfektion und siRNA-induzierte Gen Knockdown. Verwenden Zellen zwischen den Passagen 3 und 10 nach frischen Auftauen, da diese Makrophagen Linien zeigen die besten Transfektionseffizienz und pflegen robust nach der Transfektion Überleben in diesem Stadium; nicht mit einem höheren Durchlaufhäufigkeit (> 20), als Transfektionseffizienz und Knock-down sowohl stark vermindert.
3. Für eine optimierte siRNA Transfektion Platte Zellen bei 20% Konfluenz und wachsen ein bis zwei Tage, bis die Zellen nicht mehr als 80% Konfluenz erreichen. Overgrown Zellen nicht transfizieren efficiently.

2. Programmierung der 96-Loch-Shuttle System zur Transfektion

1. Startet den 96-well-Shuttle-Software auf dem Computer mit dem Shuttle verbunden. Wählen Sie neue Parameterdatei von der oberen linken Dateimenü.
2. Markieren der Vertiefungen, die auf der angezeigten Platte mit 96 Vertiefungen schema transfiziert werden. Ein grünes Feld zeigt an, welche Brunnen ausgewählt.
3. Wählen Sie das Programm, das auf die Makrophagen-Zelllinie verwendet (DS-136 für RAW264.7 oder DS-130 für J774A.1), und wählen gelten, unter dem diagramed 96-Well-Platte befindet entspricht. Beachten Sie, dass nach der Programmwahl, die Vertiefungen auf der schematischen Platte wird dunkelblau eingefärbt werden. Leere Kreise zeigen Brunnen, die nicht ein Programm zugewiesen haben und nicht schockiert sein.

3. Vorbereitung der Reagenzien für die Transfektion

1. Herstellung der Arbeits Nucleofector ™ Lösung durch Mischen SF-Zelllinie mit 96 Vertiefungen Nucleofector ™ Lösungmit dem Inhalt des beiliegenden Ergänzungsrohr. Ermöglichen, dass die gemischten Reagenzien bei Raumtemperatur vor der Verwendung äquilibriert. Speichern überschüssige komplette Nucleofector ™ Lösung bei 4 ° C für bis zu 3 Monate für die zukünftige Verwendung.
2. Vorwärmen der DMEM, RPMI-1640, 0,25% Trypsin / EDTA und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 ºC vor der Herstellung der zur Transfektion Makrophagen.
3. Bereiten Sie die siRNA zur Transfektion durch Auftauen auf Eis. Um die Anzahl der Frost taut der siRNA minimieren, Gefriert neue siRNAs in Aliquots sie das erste Mal verwendet werden.
4. In ersten Experimenten verwendet siRNA in einer relativ hohen Dosis von 2 & mgr; M (1:10 verdünnt 20 & mgr; M Bestände). Anschließend titriert siRNAs, die robust Gen auf niedrigere Dosen Knockdown zu induzieren, obwohl typischerweise höhere Dosen sind für eine effiziente Gen Knockdown in Makrophagen im Vergleich zu anderen Zelltypen benötigt.
   HINWEIS: siRNAs sind aus vielen Quellen erhältlich; recht robust Knock-down kann erhalten werdenVerwendung siGENOME SMARTPOOLs, die Pools von vier siRNAs jedes Gen sind. Als negative Kontrolle, verwenden Sie eine verschiedene nicht-Targeting siRNA Pools oder siRNAs.
5. Zur Überwachung der Transfektionseffizienz, Transfektion entweder die pmaxGFP Kontrollplasmid (in den Amaxa Kits bereitgestellt) oder fluoreszenzmarkierten siRNAs parallel zu den experimentellen siRNAs. 30-50% erwartet Transfektion des GFP-Plasmid (durch Mikroskopie getestet oder Durchflusszytometrie Tag nach der Transfektion) und> 99% der Transfektion von fluoreszenzmarkierten siRNA (durchflusszytometrisch unmittelbar nach der Transfektion und Gewinnung getestet).

4. Vorbereiten der Makrophagen für die Transfektion

1. Trennen adhärenten Makrophagen aus den Zellkulturschalen durch Trypsinierung. Saugen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS. Nach Entfernen des PBS, inkubiert die Zellen mit vorgewärmtem 0,25% Trypsin / EDTA (1 ml / 10 cm Platte) für 1-2 min, bis die Zellen beginnen, abzunehmen. Die Platte vorsichtig antippen und verschieben Sie die Lösungention während der Inkubation zu Trypsinierung maximieren.
2. Nach der Inkubation hinzufügen 9 ml DMEM + FBS Medien, vorsichtig mischen auf und ab, und sammeln die Zellen durch Pipettieren in einem sterilen Röhrchen.
3. Zähle die Anzahl der isolierten Makrophagen mit einer Zählkammer. Erwarten Sie etwa 10 Millionen Makrophagen pro 10 cm Platte. Berechnung der Gesamtzahl von Makrophagen erforderlich ist; jede Vertiefung der 96-Well-Shuttle erfordert 200.000 Zellen. Denken Sie daran, im Wert von Zellen, die ein paar zusätzliche Brunnen 'in den zum Pipettieren Verluste ermöglichen.
4. Pipettieren die berechnete Anzahl von Zellen in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen für 10 min bei 150 xg bei Raumtemperatur. Zu schnell Zentrifugieren Sie keine, da dies Makrophagen Gesundheit und Transfektionseffizienz verringern.

5. Nucleofection von Makrophagen mit siRNA

1. Mit einer sterilen 96-Well-Rundbodenplatte (das Mischen erleichtert und minimiert Reagenzienverlust), fügen Sie 2 ul jeder siRNA in jede Vertiefung zu sein transfreflektierte.
   Hinweis: Je nach der Anzahl der siRNAs, kann dies während des Makrophagen Zentrifugationsschritt durchgeführt werden.
2. Saugen Sie das Medium aus dem zentrifugiert Zellen. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren in Nucleofector ™ -Lösung SF (mit dem Ergänzungslösung), unter Verwendung von 20 & mgr; l pro 200.000 Zellen pelletiert. Sobald resuspendiert, verwenden Sie die Zellen sofort für eine optimale Transfektion.
3. Übertragen resuspendierten Zellen in ein steriles Trog; mit einer Mehrkanalpipette, Transfer 20 ul der resuspendierten Zellgemisch in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit den siRNAs. Vorsichtig mischen oben und unten.
4. Transfer 20 ul der Zell / siRNA-Gemisch in die 96-Well-Platte Nucleocuvette ™ kritischer Schritt. Erzeugen von Blasen zu vermeiden, während der Übertragungsschritt so kann Fehler während Nucleofection induzieren.
5. Nach dem Platzieren aller Versuchsproben in der Transfektion Platte Bedeckung die 96-well Platte mit dem Deckel versehen und very klopfen Sie leicht auf eine harte Oberfläche, um alle Blasen aus den Proben zu entfernen.
6. Zeigen 96-Well-Platte mit Deckel in den 96-Loch-Nucleofector Shuttle und wählen Sie "laden und starten" auf der rechten unteren Ecke des Programmbildschirm. Vor Nucleofection, folgen Sie dem Programm Aufforderung, um die Ergebnisse zu speichern.
   Hinweis: Während der Nucleofection Prozess, Brunnen erfolgreich transfiziert werden auf der 96-Loch-auf dem Bildschirm schema durch einen grünen Kreis mit einem Pluszeichen dargestellt werden. Ein roter Kreis mit Minuszeichen zeigt einen Fehler an, höchstwahrscheinlich aufgrund von Blasen oder Fehl Pipettieren das richtige Volumen von Reagenzien.

6. Wiederherstellung und Oberflächen von Makrophagen

1. Unmittelbar nach Nucleofection, mit einer Mehrkanalpipette je 80 ul vorgewärmten (37 ° C) RMP1-1640 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie die Medien auf der Seite jeder gut, so dass die Medien langsam mit den transfizierten Zellen, die sehr empfindlich sind in dieser Stufe mischen. Haben die Medien nicht zu schnell, da diesstark vermindern Lebensfähigkeit.
2. Platzieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen transfiziert mit Proben und RPMI-1640 in einem 37 ºC-Inkubator mit 5% CO ₂ für ₂ min; Dies ist wichtig, damit die Zellen sich zu erholen, bevor Manipulation weiter.
3. Entfernen Sie den 96-Well-Platte aus dem Inkubator und die Mischung vorsichtig übertragen aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit einer Mehrkanalpipette.
4. Mit einer Mehrkanalpipette, 100 l vorgewärmten (37 ° C) DMEM + FBS-Medium in jede Vertiefung.
5. Inkubieren des 96-Well-Gewebekulturplatte mit Proben in einem 37 ºC-Inkubator mit 5% CO ₂ für 24-36 h (Optimierung der genaue Zeitpunkt für die einzelnen siRNAs, wobei diese Zeitbereich arbeitet im allgemeinen gut).

7. Die Stimulation der Makrophagen mit LPS

1. Im Anschluss an die 24 bis 36 Stunden nach der Nucleofection Inkubation vorbereiten LPS (oder andere PAMPs) in frischem Medium. Bereiten Sie genügend frisches Medium für alle Vertiefungen (200 ul medien / Vertiefung der 96-Well-Platte plus ein kleines Extra für Pipettieren). Verdünnte LPS in einer Endkonzentration von 20 ng / ml in DMEM + FBS.
2. Saugen Sie vorsichtig Medien aus dem 96-Well-Platte und fügen Sie die frische Medien mit den LPS zu den Zellen.
3. Überwachung der Reaktion auf LPS oder andere PAMPs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation. 6 Stunden ausreichend, um eine robuste inflammatorische Zytokin-Antwort für Cytokine wie IL-6 oder TNF & alpha; zu erzeugen.

8. Überwachung der induzierten angeborenen Immunantwort, Knock-down und Lebensfähigkeit in Makrophagen

1. LPS-induzierte Cytokin-Produktion zu überwachen, Pipetten den Überstand von den Zellen in eine 96-Well Platte. Cytokin-Produktion kann dann durch ELISA gemessen werden.
2. Nachdem der Überstand entfernt wird, überwacht die Zelllebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (wenn durch zelluläre Esterasen in lebenden Zellen gespalten wird, wird diese Verbindung fluoreszierend). Identifizieren siRNAs, die Zielgene, die die Lebensfähigkeit der Zellen zu steuern mit tseinen Ansatz. Hinweis: Die Transfektion Prozess selbst sollte eine geringe Wirkung auf die Lebensfähigkeit haben, wenn sie richtig durchgeführt wird.
   1. In Fluoresceindiacetat (5 mg / ml Stamm in Aceton) in jede Vertiefung (1: 100 endg Verdünnung in PBS).
   2. Inkubieren bei Raumtemperatur für ein bis fünf Minuten, und anschließend die Fluoreszenz in den Zellen unter Verwendung eines Plattenlesegerät (460 nm Anregung, 515 nm Emission) zu überwachen.
   3. Optional: Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz in den Vertiefungen ist einheitlich, lysieren die Zellen mit Puffer wie RIPA; Dies stellt eine gleichförmige Fluoreszenzsignal in dem Bohrloch, wie einige Plattenleser so konfiguriert sind, nur einen kleinen Teil des Schachtes zu überwachen; Wenn die Zellen nicht gleichförmig überzogen, könnte das Fluorescein-Diacetat ein ungenaues Lesen zu geben.
3. Als eine Alternative zur Überwachung Zelllebensfähigkeit, überwachen siRNA-induzierte Gen-Knockdown von qPCR unter Verwendung von RNA aus den anhaftenden Zellen.
   1. Nachdem der Überstand wird von den Zellen entfernt (Schritt 8.1), Add RLT-Puffer (die Lyse und Konservierung von RNA verwendet wird) direkt auf die anhaftenden Zellen, um sie zu lysieren.
   2. Isolieren RNA mit einem RNA Vorbereitung Kit wie die RNeasy Mini-Kit, und verwenden qPCR mit Gen-spezifischen Primern, um Gen-Knockdown relativ zu siRNA Behandlung steuern überwachen. Verwenden Primer an Βactin oder GAPDH zur Normalisierung.
4. Als eine weitere Alternative zu anderen Aspekten der angeborenen Immunantwort zu überwachen, überwacht die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen durch Zugabe von FITC-markierte E. coli Partikel direkt auf die anhaftenden Zellen unter Verwendung eines Kits. Nach Herstellerprotokoll, das nur ein paar Stunden dauert, zu überwachen Phagozytose mit einem Plattenleser oder Mikroskopie.

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Ergebnisse

Um die Effizienz der Transfektion unter Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, verfolgten wir die Aufnahme von FITC-markierter siRNA unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Abbildung 1).

Um die Brauchbarkeit des Ansatzes zur Überwachung der angeborenen Immunantwort zu veranschaulichen, transfizierten wir siRNAs bekannten angeborenen Immunregulationsgene in die RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie, die Zellen stimuliert mit LPS und dann überwacht Produktion der proinfl...

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Diskussion

Es wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, in denen einzelne Gene von siRNA in murinen Makrophagen gezielt worden. Während Lipid-vermittelte Transfektion wurde verwendet, um siRNA zur Makrophagenzelllinien auf einer individuellen Basis zu liefern, leiden diese Verfahren unter potentiellen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, begrenzte Knock-down, und die Variabilität von Gen zu Gen. Um robustere Assays, die verwendet werden könnten, um Gene in Mittel- oder Hochdurchsatzverfahren zielen entwickeln optimierten wir...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amaxa nucleofector 96-well shuttle system	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool	Dharmacon	D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electroporation	Invitrogen	13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM, high glucose	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)	Fisher	SV30010
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200072
96-well tissue culture plates	Fisher	07-200-89
96-well round bottom sterile plates (not coated)	Fisher	07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY406
Mouse TNFα Duoset ELISA kit	R&D Biosystems	DY410
Fluorescein diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
RLT buffer	Qiagen	79216
RNeasy mini kit	Qiagen	74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit	Invitrogen	V-6694