Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Zusammenfassung

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Zusammenfassung

Zelloberflächenproteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, sich an allen wichtigen zellulären Prozessen und Funktionen, wie Wachstum, Differenzierung und Proliferation. Eine umfassende Charakterisierung dieser Proteine ​​bietet reichhaltige Informationen zur Entdeckung von Biomarkern, Zelltyp-Identifikation und Drogenzielauswahl, als auch helfen, unser Verständnis der Zellbiologie und Physiologie voraus. Oberflächenproteine ​​stellen jedoch erhebliche analytische Herausforderungen, die aufgrund ihrer inhärent niedrigen Fluss, hohe Hydrophobie und schwere post-translationale Modifikationen. Unter Ausnutzung der vorherrschenden Glykosylierung auf Oberflächenproteine, führen wir hier ein Hochdurchsatz-Glycopeptid-Capture-Ansatz, der die Vorteile von mehreren vorhandenen N-Glycoproteomikstrategie Mittel integriert. Unsere Methode kann die Glykopeptide von Oberflächenproteinen abgeleitet bereichern und entfernen ihre Glykane für einfache Proteomik mittels LC-MS. Die beschlossene N-glycoproteome umfasst die informationen von Protein Identität und Quantität sowie ihre Websites der Glykosylierung. Dieses Verfahren hat zu einer Reihe von Studien in Bereichen wie Krebs, Stammzellen und Arzneimitteltoxizität angewendet. Die Beschränkung des Verfahrens liegt in der geringen Häufigkeit von Oberflächenmembranproteinen, so dass eine relativ große Menge von Proben für die Analyse erforderlich im Vergleich zu Studien am cytosolischen Proteine ​​zentriert.

Einleitung

Zelloberflächen-Proteine ​​interagieren mit der extrazellulären Umgebung und leiten Signale von der Außenseite zur Innenseite der Zelle. Somit sind diese Proteine, einschließlich extrazellulären Matrixproteinen, spielen wichtige Rollen in allen Aspekten der Zellbiologie und der Physiologie von Proliferation, Wachstum, Migration, Differenzierung Alterung und so weiter. Oberflächenproteine ​​funktionieren durch die Interaktion mit anderen Zellen, Proteinen und kleinen Molekülen ^03.01. Molekulare Charakterisierung von Zelloberflächenproteinen ist von großem Interesse, nicht nur für Biologen, sondern auch für die pharmazeutische Industrie, da mehr als 60% der Medikamente, Zelloberflächenproteine ^​​4 ausgerichtet.

Tandem-Massenspektrometrie (MS), mit seiner überlegenen Sensitivität, Genauigkeit und Durchsatz für die Identifizierung von Proteinen und Peptiden, wurde ein leistungsfähiges Werkzeug für die globale proteomische Studien ^5,6. Doch stellen Oberflächenproteine ​​erhebliche Herausforderungen zu MS-basierte Proteomik, wiedie meisten Oberflächenproteine ​​gibt es in geringen Mengen und mit schweren Veränderungen. Die Membran-überspannenden Regionen der Oberflächenproteine ​​machen sie hydrophob ist; Dies ist insbesondere der Fall bei Multitransmembranproteine. Es ist daher schwierig, Membranproteine ​​in wässrigen Lösungen ohne Zuhilfenahme eines Detergens zu lösen; Jedoch ist die Verwendung von Waschmitteln in der Regel unterdrückt die Leistung der HPLC und MS ^1,7,8 Proteinidentifikation. Daher Membranproteine ​​wurden schlecht in direkten LC-MS basierte Proteomik gekennzeichnet.

Die Glykosylierung ist eine der wichtigsten und reichlich post-translationale Modifikationen, die sich in Zelloberflächenproteine ^​​9. Die enorme Komplexität und Heterogenität der Glykane behindern Peptide 'MS-Signal ^10. Dennoch haben mehrere proteomische Methoden dieses einzigartige Modifikation verwendet werden, um Oberflächenproteine ​​zu bereichern und die Zuckerreste von Proteinen vor der LC-MS-Analyse zu entfernen. Diese Methodes sind Lektin-basierte Affinitätseinfang ¹¹ und Hydrazid-basierten oder Borsäure Chemie Capture ¹² sowie hydrophile Trennungen ^8,13. Die Entfernung der Glykane verwandelt Membranproteine, regelmäßige Proteine ​​und vereinfacht die MS Charakterisierung drastisch. Da Glykosylierung in sezernierte Proteine, die eine hohe Löslichkeit im Gegensatz zu Membranproteine ​​erfolgt auch, viele glycoproteomische Methoden für lösliche Proteine ​​optimiert und tendenziell niedrigere Glycopeptid Selektivität und Empfindlichkeit, wenn sie eingesetzt werden, um Proteine ^​​8,14 Membran haben. Andere Verfahren bestehen auch zu bereichern, insbesondere Zelloberflächenproteine, wie z. B. jene, die Ultrazentrifugation ¹⁵ und Markierungsstrategien ^16. Ein detaillierter Vergleich zwischen unserem Verfahren und anderen bestehenden Methoden zur Charakterisierung von Membranproteinen durchgeführt wurde kürzlich ^17, und die Ergebnisse zeigten, daß unser Verfahren ebenso gut ausführen kann, wenn nichtbesser, als alle gegen Membran Proteomics Methoden, aber mit höheren Einfachheit.

Um Forscher mit dieser Methode, die wir hier ausführlich ein allgemeines Protokoll. Diese Methode integriert mehrere Vorteile der bestehenden Glycoproteomikstrategie Strategien und ist speziell für Membran-Glykoproteine ​​entwickelt, doch die Methode funktioniert genauso gut für sekretierte Proteine. Die Merkmale dieses Verfahrens sind: 1) eine vollständige Solubilisierung von Membranproteinen, 2) eine Anreicherung von Glycopeptiden anstelle von Glykoproteinen, die potentielle sterische Behinderung zu vermeiden, wenn unter Verwendung eines festen Erfassungs Substrat, 3) die Verwendung von Hydrazid-Chemie, um kovalente Bindungen zwischen Form Glycopeptide und die Erfassung Substrat, so dass das gebundene Glycopeptide können stringente Waschungen für Hoch glycoselectivity tolerieren, und 4) die Fähigkeit, die gesamte Aufnahmevorgang in einem Rohr zur Probenverlust reduziert und verkürzt die Dauer Verfahren durchzuführen. Nach Durchführung dieses Verfahrens, um das Studium eine variableety von biologischen Proben, einschließlich Zellen und Geweben beobachteten wir eine hohe Selektivität (> 90%) an Glycoproteine ^{​​8,17,18.}

Protokoll

Ein. Ernte-Membranen

1. Hinzufügen hypotonischen Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, pH 8,0) mit Proteaseinhibitorcocktail auf einen Zellpellet (~ 10 ⁸ Zellen) und Inkubation für 15-30 min auf Eis. Lyse der Zellen, indem die Probe durch Spritzennadeln (5-10 Durchläufe) oder Homogenisieren der Probe von einem Dounce Homogenisator (15-30 Schläge). Verwenden Sie eine Zählkammer und Trypanblaufärbung um die Effizienz der Lyse zu überprüfen.
2. Erhalten Sie die mikrosomale Fraktion durch eine differenzielle Zentrifugation des Lysats bei 3.000 gx 15 min und dann bei 100.000 gx 2 Stunden. Die erste Zentrifugation erhält man ein Pellet, das die Kernfraktion und die anschließende Zentrifugation des Überstandes erzeugt ein zweites Pellet, welches die Mikrosomenfraktion, die die Plasmamembran als auch membrangebundene Organellen ⁸ enthält. Die endgültige Überstand ist die cytosolische Fraktion. Bewahren Sie die mikrosomalen Fraktionen in -80 ° C-Gefrierschrank für weitere analysist wie nachstehend angegeben.

2. Auflösen, denaturieren und Digest Membranproteine

1. Löse den mikrosomalen Fraktion im Denaturierungspuffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) und dann inkubieren der Lösung auf 100 ° C für 10 min.
2. Kühlen der erhitzten Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, ultrahochreinen Harnstoffpulver in der Lösung auf 8 M Endkonzentration und Inkubation der Probe bei 37 ° C für 30 min.
3. Hinzufügen Iodacetamid Stammlösung zu der Probe auf 15 mM Endkonzentration, und Inkubieren der Lösung in der Dunkelheit für 30 min bei Raumtemperatur, um die freien Thiole in der Probe zu alkylieren. Hinzufügen DTT-Stammlösung zu der Probe auf 10 mM Endkonzentration der Lösung und Inkubation für weitere 10 min bei Raumtemperatur, um das überschüssige Iodacetamid stillen.
4. Verdünnt die erhaltene Lösung 10-fach mit 40 mM Tris-Puffer bei pH 8, und anschließend Trypsin hinzufügen, um die Probe bei einer 1:20-Verhältnis von trypsin zum Gesamtprotein. Aufrechterhaltung der Aufschlussreaktion in einem 37 ° C Ofen über Nacht, um sicherzustellen, wird die Reaktion beendet.
5. Beenden Sie die Verdauung durch Ansäuern der Probenlösung mit HCl, ein Zustand, bricht auch das Reinigungsmittel, dh Rapigest pH 1. Verschlechtern die Rapigest bei 37 ° C für 1 h, und entfernen Sie die entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren.
6. Reinigen Sie den Überstand, die Probe-Peptide enthält, die von einem C-18-Festphasenextraktion (SPE) Patrone und trocknen Sie die erhaltene Probe durch Speedvac.
7. Durchführen einer SDS-PAGE-Analyse von Proben vor und nach der Trypsin-Verdau, um die Effizienz der Verdauung zu bestätigen.

3. Glycopeptid-Capture-

1. Man löst die gereinigten Peptide im Kopplungspuffer (100 mM Natriumacetat, pH 5,5). Hinzufügen Natriumperiodat in die Peptidlösung in einer Endkonzentration von 10 mM für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Dadurch werden die cis-Diol-Gruppen in den Glycanen zu Aldehyden oxidieren, Welche die Glykane zu koppeln Harzes durch Hydrazid Chemie ermöglichen. Quenche die übermäßige Periodat durch Natriumsulfit bei einer Endkonzentration von 20 mM und pH 5 für 10 min bei Raumtemperatur.
2. Einführung Hydrazid-derivatisierten Harzes in die Peptidlösung in einem Verhältnis von 1:4 (Harz-Lösung) zu koppeln Glycopeptide zu dem Harz. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 1-2 Tage mit End-zu-End-Rotation für eine vollständige Kopplung.
3. Entfernen der nicht gebundenen Peptide durch Waschen des Harzes zweimal mit 1 ml von jeder der folgenden: DI-Wasser, 1,5 M NaCl, Methanol und 80% Acetonitril. Schließlich 3x Waschen des Harzes mit 1 ml 100 mM NH ₄ HCO ₃ bei pH 8, um den Puffer des Systems austauschen zu 100 mM NH ₄ HCO _3.
   1. Sammle den Überstand und die Waschschritte für die Analyse von ungebundenen Peptiden (optional).
4. Lösen der N-Glycopeptide vom Harz durch PNGase F in einer Inkubation über Nacht bei 37 ° C mitN-Ende-zu-Ende-Rotation. Sammeln Sie die freigesetzten Peptide durch Zentrifugation und einer 80% Acetonitril waschen. Trocknen Sie die erhaltene Lösung in der Speedvac für LC-MS-Analyse.

4. Weitere Fraktionierung (Optional)

Zur weiteren Vereinfachung Probenkomplexität, Fraktionierung der N-Glycopeptiden. Beispielsweise abgeblasen, und der getrockneten Peptide in 10 mM Ammoniak-Formiat, 20% Acetonitril pH 3 und mit starken Kationenaustauscher (SCX) gereinigt, um die Peptide zu fraktionieren. Trocknen des erhaltenen Elutionsmittel und dann analysiert die erhaltenen Peptidfraktionen durch Umkehrphasen-LC-MS ^8,17,18.

5. Reinigung der frei N-Glycopeptide (Optional)

Wenn Bedenken erheben für die mögliche Kontamination der Peptide, wieder aufzulösen die getrockneten Peptide in 0,1% Ameisensäure und verwenden Sie einen MCX SPE-Säule, um die Peptide weiter zu reinigen, bevor Umkehrphasen-LC-MS-Analyse.

Hinweis: Datenbanksuchparameter.

Bei der selektiven Spaltung von N-Glycopeptide aus dem Harz, wandelt die PNGase F-N-Glycan verknüpft Asparagin zu einer Asparaginsäure. Daher besteht ein 0,9840 Da Massenverschiebung der befreiten N-Glycopeptide. Diese Peptide genau zu identifizieren, muss diese Änderung der Suchparameter mit gemeinsamen Abänderungen wie der Carbamidomethylierung des Cystein und Oxidation der Methionin zugesetzt werden.

Ergebnisse

Ein repräsentatives Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Die Etikettierung und weitere Fraktionierung Schritte sind optional und Details sind in einer Veröffentlichung ¹⁸ beschrieben. Eine weitere Möglichkeit ist die unveränderten Peptide, die nicht mit dem Harz reagieren zu analysieren. Die Vorteile des Analysierens der unmodifizierten Peptide umfassen die Identifizierung von potentiellen nicht-glykosylierte Peptide und Proteine, wie Claudinen in ti...

Diskussion

Hier stellen wir ein Glycopeptid-Capture-Strategie zur Profilierung Zelloberflächenproteine. Das Verfahren kann angewendet werden, um sekretierte Proteine, wie sie in Blut, wie auch in anderen Körperflüssigkeiten oder Zellkulturmedien zu studieren.

Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der vollständigen Verdau von Proben; Daher ist ein SDS-PAGE-Charakterisierung der Effizienz der Verdauung notwendig, insbesondere für die erste Zeitanalyse einer Probe. Eine vollständige Verdauung kann ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755