Mit Hilfe eines α-Bungarotoxin Binding Site Tag an GABA A-Rezeptor-Membranlokalisierung und Handel Studieren

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff Alexa gekoppelt α-Bungarotoxin an GABA A-Rezeptor-Oberflächenlokalisierung und Endozytose in hippocampalen Neuronen zu messen. Durch die Verwendung von Konstrukten, die mit einem kurzen extrazellulären Tag, das α-Bungarotoxin, kann die Analyse der Plasma-Membran-Protein endozytischen Handel erreicht werden, bindet.

Zusammenfassung

Es wird zunehmend deutlich, dass Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich ionotropen GABA A-Rezeptoren (GABAAR), Ausstellungshochdynamischen Handel und Zelloberfläche Mobilität ^7.1. Rezeptorzelloberflächenlokalisierung und Endozytose zu untersuchen, die hier beschriebenen Verfahren kombiniert die Verwendung von Fluoreszenz-α-Bungarotoxin-Zellen, die mit Konstrukten, die eine α-Bungarotoxin (Bgt) Bindungsstelle (BBS). Die BBS (WRYYESSLEPYPD) an der α-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors Muskeln, die mit hoher Affinität Bgt ^8,9 bindet. Einbau des BBS-Website ermöglicht Fläche Lokalisierung und Messung von Rezeptor Einsetzen oder Entfernen mit Applikation exogener Fluoreszenz Bgt, wie zuvor in der Verfolgung von GABAA-und GABAB-Rezeptoren ^2,10 metabo beschrieben. Neben der BBS-Website, die zwischen den Aminosäuren 4 und 5 des reifen GABAAR Untereinheit durch Standard m eingesetzt wir eine pH-sensitive GFP (pHGFP ¹¹⁾olecular Biologie und PCR-Klonierung Strategien (siehe Abbildung 1) ^12. Die BBS ist 3 'der pH-sensitive GFP-Reporters durch ein 13-Aminosäure Alanin / Prolin-Linker getrennt ist. Für Handel in dieser Veröffentlichung, die auf festen Proben basieren beschriebenen Studien, die pHGFP dient als ein Reporter der Gesamt getaggt GABAAR Untereinheit Protein-Ebene, so dass eine Normalisierung der Bgt markierten Rezeptor Bevölkerung insgesamt Rezeptor Bevölkerung. Dies minimiert Zelle zu Bgt Färbung Signalvariabilität von höheren oder niedrigeren Ausgangs Ausdruck der markierten Untereinheiten GABAAR resultierende Zell. Außerdem die pHGFP Tag ermöglicht eine einfache Identifizierung der Konstrukt exprimierenden Zellen für Live-oder Fest Imaging Experimenten.

Einleitung

Die Verwendung von fluoreszenz gekoppelt α-Bungarotoxin Rezeptor Lokalisation und Dynamik zu studieren wurde in Studien der Nikotinacetylcholinrezeptor ^13-15, endogenen Ziel des Toxins Pionierarbeit geleistet. Anschließend Einbau des minimalen Bgt bindende Peptid (BBS) wurde genutzt, um Menschenhandel beider erregenden und hemmenden Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ^2,10,16-21 studieren. Das BBS-basierte Technik bietet Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für den Menschenhandel Studien wie Oberflächen Biotinylierung Methoden, Antikörpermarkierung von lebenden Zellen mit Antikörpern gegen die extrazelluläre Epitope und Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) verwendet. Während Zelloberflächen Biotinylierung freien Amine kovalent modifiziert, mit dem Potential, die zelluläre Aktivität beeinflussen. Antikörper basierte Studien haben oft durch Oberflächenantigen Clustering oder Deckelung, die Menschenhandel Ereignisse verändern kann behindert. Aufgrund der Bleichstufe für FRAP sTUDIEN, ist ein wichtiges Anliegen Beschädigung der zugrunde liegenden zellulären Struktur. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass BBS-markierten Konstrukte können auch für biochemische Methoden mit Biotin-gekoppelten Rezeptor Bungarotoxin zu beurteilen Handel verwendet werden. Dieses Verfahren ist leicht auf Zelllinien und Primärzellen. Zur Verwendung in Zellen, die nikotinergen Acetylcholin (nAChR)-Rezeptoren exprimieren, muß die nAChR-Antagonisten Tubocurarin gesamten Protokoll verwendet werden, wie angegeben. Durchführen einer einfachen Oberfläche Bgt Kennzeichnung (entspricht der T = 0 Zeitpunkt für die Endozytose-Protokoll) auf nicht-transfizierten Zellen in Abwesenheit von Tubocurarin wird Nachweis von endogenen nAChR bereitzustellen.

Eine wichtige Überlegung für die Verwendung dieser Technik entsprechende Einsetzen der BBS, so dass es an einer extrazellulären Stelle, wenn das Protein von Interesse an die Plasmamembran geliefert vorliegt. Zum Beispiel können die N-terminalen Domänen von GABAAR Einheiten befinden sich in den Bläschen Lumen während TRAFHandels und werden nach Einsetzen Rezeptor in der Plasmamembran der extrazellulären, so dass spezifische Markierung von Zelloberflächenrezeptoren und die Bewertung ihrer Entfernung von der Zelloberfläche von endozytischen Veranstaltungen. Wir haben früher gezeigt, dass die Zugabe von GFP, myc oder BBS Epitope dieser Domäne GABAAR Einheiten funktionell still. Standardkontrollen durchgeführt werden sollte, um sicherzustellen, dass das markierte Protein wird in ähnlichen Mengen zu einer unbezeichnet Konstrukt exprimiert wird, dass es angemessen lokalisiert, und dass es keinen Einfluss auf die Rezeptorfunktion. Diese Charakterisierung von transfizierten Konstrukte werden auch bei der Fehlersuche die Überexpression Anliegen zu unterstützen.

Protokoll

Alle unten beschriebenen Protokolle sind in Übereinstimmung mit der IACUC und IRB Institutional Review Boards der University of Pittsburgh School of Medicine.

1. Vorbereitung der Hippocampus Neuronale Kulturen in Gewebekultur Hood

Hinweis: Verwenden steriler Technik und Reagenzien während Protokoll 1.

1. Vorbereitung Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in H ₂ O) beschichteten Deckgläsern als Substrat für die neuronale Kultur.
   1. Zeigen 4-5 runden Glasdeckgläschen in jedem 3,5 cm Gewebekulturschale.
   2. Punkt 70 ul Poly-D-Lysin auf jede 12 mm Deckglas. Hinweis: Für die Live-Aufnahmen, ein Glasboden 3,5-cm-Gewebekulturschale verwendet werden können (vor Ort 200 ul Poly-D-Lysin auf eingebettete 14 mm Deckglas).
   3. Lassen Sie die zubereiteten Speisen in der Gewebekultur Haube O / N. Um Poly-D-Lysin-Verdampfung zu minimieren und halten sterile Oberflächen in der Gewebekultur Haube, und schließen Sie den Fensterflügel und schalten Sie the Gebläse O / N. Hinweis: UV-Lampen werden während der O / N Inkubation verwendet.
   4. Am nächsten Morgen, waschen das Geschirr 3x mit 2 ml H ₂ O.
   5. Nach dem Entfernen der letzten H ₂ O waschen, 2 ml von Medien, um je 3,5 cm Schale und lassen Gerichte in Inkubator, bis bereit, die Neuronen in Schritt 1.4 plattieren.
2. Hippocampus-Neuronen aus embryonalen Tag 18-19 (E18-19) Ratten (von ²² Goslin modifiziert) vorbereitet.
3. Transfektion von frisch gewonnenen Neuronen am Tag der Kultivierung mit 1-4 ug maxiprepped DNA-Konstrukt.
   Hinweis: typischerweise 3 ug DNA in 1-2 Millionen Neuronen transfiziert mit einer Lebensfähigkeit von 50% und eine Transfektionseffizienz von 60% (z. B. beginnend mit 2 Millionen Neuronen ((2 x 10 ⁶ Neuronen x 0.5) 0.6) sieht ca. 1 Million Neuronen;.. davon 600.000 transfiziert ¹ Unterschiedliche Mengen an DNA-Konstrukt kann bei der Fehlersuche potenzielle Probleme von transfiziert werdenÜberexpression, gefolgt von entsprechenden Charakterisierung Konstrukt Lokalisation und Funktion.
4. Platte der transfizierten Neuronen auf Poly-D-Lysin beschichtete Deckgläser mit einer endgültigen Dichte von etwa 200.000 Neuronen pro 3,5 cm Schale. Hinweis: Für eine Glasbodenschale, Teller 40.000-50.000 Neuronen auf der 14 mm Glasfläche.
5. Ersetzen Sie die Medien 4-24 Stunden nach der Herstellung der neuronalen Kulturen, dann lassen Neuronen im Inkubator entwickeln, bis 14-17 Tage in vitro (DIV) oder gewünscht Bühne.

2. Endozytose Assay

ACHTUNG: Hinweis auf α-Bungarotoxin Tubocurarin und Abfallkosten:

1. Handhabung aller Peptid Neurotoxine wird innerhalb der Richtlinien der biologischen Sicherheitsstufe-2 (BL-2) Forschungsprotokolle empfohlen. Alle geeignete Schutzkleidung getragen werden. Lyophilisiert Toxin Pulver sollte nach den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert. Toxin Abfall should unter Beachtung der Umweltschutz und Sicherheit Richtlinien der Regierungsinstitution entsorgt werden.
2. Um potenzielle Peptidaggregate, die während der Lagerung gebildet haben können, sollten α-Bungarotoxin Aliquots kurz vor Gebrauch zentrifugiert, und der Überstand sollte für den Versuch verwendet werden.
3. α-Bungarotoxin (Bgt) Bestände zu einer Konzentration von 1 mg / ml in sterilem H ₂ O bei -20 ° C resuspendiert und in 10 &mgr; l Aliquots gelagert Fluoreszenz gekoppelt Bgt Bestände bei 3 pg / ml verwendet. Tubocurarin wird in einer Endkonzentration von 150 &mgr; M verwendet.

1. Stellen Sie Tisch Heizblock auf 16 ° C im Kühlraum mit dünnen Aluminium-oder Edelstahlplatte an der Spitze. Alternativ, falls vorhanden, eine Tisch Kühl / Heizvorrichtung kann für jeden Schritt benötigt 16 ° C eingesetzt werden
2. Kühlen extrazellulären Hepes-gepufferter Salzlösung (HBS, enthaltend in mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 Glucose, 1,2 MgCl _2, 2,5CaCl _2, pH 7,4) auf 16 ° C in einem Wasserbad.
3. Über Neuron Gerichte Aluminiumplatte bei 16 ° C und cool für 5 min.
4. Medien entfernen (halten konditionierten Medien-und Reserve in Inkubator für Schritt 2.8, Endozytose Testzeit Punkte) und ersetzen mit 1 ml 16 ° C HBS + Tubocurarin (150 uM) für 2 min.
5. Entfernen HBS + Tubocurarin zu beschrifteten Abfallbehälter und ersetzen mit 1 ml 16 ° C HBS + Tubocurarin (150 uM) + α-Bungarotoxin Alexa 594 [3 pg / ml], Inkubation bei 16 ° C für 15 min.
6. Entfernen HBS + + Tubocurarin α-Bungarotoxin Alexa 594 Abfallbehälter beschriftet und Geschirr spülen 3x mit 2 ml 16 ° C HBS (die Waschungen kann durch Absaugen im Vakuum-Kolben, der 50 ml 50% Bleichmittel gesammelt werden).
7. Für Live-Bildgebung Zeitreihen-Experimenten nach Rezeptor Endozytose mit einem Glasboden-3.5 cm Kulturschale, die Schritte 2.1-2.6, dann Transfer Gericht erhitzt Bühne(Peltier-Vorrichtung) am Mikroskop, und beginnen Sie mit einem konfokalen Imaging-oder TIRF-Mikroskop-Setup.
8. Übertragen T = 0 Zeitpunkt Deckgläser in eine Schale von RT 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose für 20 min, weiter mit anderen Deckgläser zu Schritt 2.9.
9. Für andere Zeitpunkte, zu ersetzen HBS Anlage mit 37 ° C ins Gleichgewicht Medien (in Schritt 2.4 reserviert) und zum Brutkasten für Endozytose bei 37 ° C. Hinweis: vorgeschlagen, zusätzliche Zeitpunkten T = 15, 30 und 60 auf.
10. Zu den Zeitpunkten benötigt, nehmen Sie Gerichte aus Inkubator, schnell waschen zweimal mit 2 ml DPBS RT (DPBS kein Kalzium, Magnesium), dann in 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose für 20 Minuten zu beheben.
11. Nach 20 min Fixierung, entfernen Sie 4% Paraformaldehyd / 4% Saccharose in Abfallgebinde und Geschirr spülen zweimal mit 2 ml DPBS RT.
12. Deck Inkubation bei RT für 10 min in der Immunfluoreszenz Blocklösung (Blocklösung = 5% Pferdeserum, 0,5% BSA in DPBS), enthaltend 0,2% Triton X-100 zu Durchläsize die Neuronen und ermöglichen anti-GFP-Immunfärbung von intrazellulären Rezeptor-Pool und / oder Kennzeichnung von anderen Proteinen von Interesse.
13. Entfernen Block + 0,2% Triton X-100 und Inkubation Deckgläser in Immunblock Lösung ohne Triton X-100 für 20-30 min.
14. Führen primären Antikörper-Inkubationen von Deckgläsern in Block mehrere Stunden bei RT oder O / N bei 4 ° C. Hinweis: Inkubation von Deckgläsern mit Vorwahlen bei 4 ° CO / N routinemäßig produziert verbesserte Immunfluoreszenz Ergebnisse.
15. Wash Deckgläser 3x mit DPBS (5 min für jeden Waschschritt).
16. Deck inkubieren mit sekundären Antikörpern in Blocklösung für 1 h bei RT.
17. Wash Deckgläser 3x mit DPBS (5 min für jeden Waschschritt).
18. Deckmontage, Handhabung jedes Deckglas individuell: Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Rückseite des Deckglases mit Laborgewebe, dann invertieren Deckglas auf 4 ul Eindeckmedium auf einem Glasträger.
19. Veröffentlichung Folien bei RT trocknen abgedeckt 30 min dann stErz bei 4 ° C bis bereit zu Mikroskopie durchzuführen.
20. Bildaufnahme und Auswertung des Experiments mit konfokaler Mikroskopie (blind Versuchsbedingung). 60X NA 1.49 Öl-Immersionsobjektiv mit folgenden Lasern: Argongas 488 nm, 561-Diode, 640 Diode.
    1. Mit den gleichen Einstellungen Bildaufnahme, erwerben einzigen Z Schnittbilder mit der neuronalen Zellkörper und mehrere dendritischen Prozesse im Fokus.
    2. Quantifizierung von α-Bungarotoxin Alexa Fluoreszenzsignal und GFP-Immunfärbung auf 20 &mgr; m von 3-4 proximalen Dendriten pro Neuron unter Verwendung derselben Schwelle für die Analyse aller Daten Endozytose.
    3. Analysieren von Daten 10-12 Neuronen für jeden Zeitpunkt, Wiederholung des Experiments mit mehreren unabhängigen neuronalen Kulturen.

Ergebnisse

Charakterisierung eines BBS tagged Konstrukt wichtigen Elemente wie die Bestimmung, ob das exprimierte Protein korrekt assembliert (insbesondere Rezeptoren von mehreren Untereinheiten zusammengesetzt), Verkehre auf der Zelloberfläche lokalisiert und geeignet. Hemmende Synapsen von GABA A-Rezeptor-Cluster, die Oberfläche mit der inhibitorischen Gerüstprotein Gephyrin colokalisieren und an präsynaptischen inhibitorischen Terminals, durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter, die GABA und Glycin in s...

Diskussion

Die hier beschriebenen BBS Basis fest und Live-Techniken können verwendet werden, um Rezeptor oder anderen Plasmamembranprotein Handel in Zelllinien, Neuronen und anderen primären Zellen zu verfolgen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Membran Einsetzen und Entfernen der Liganden-gesteuerte Ionenkanäle und GPCR untersuchen und Veränderungen in den Handel zu beurteilen aufgrund der Gegenwart der Rezeptor-Agonisten und Modulatoren. Schwerpunkte sind entsprechende Lokalisierung der Tag, um eine extrazelluläre Lage u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
P3 Primary Cell 4D kit	Lonza	V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate	Molecular Probes	B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes	B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	B13423
(+)-Tubocurarine chloride	Tocris	2820
Mounting medium	DAKO	cS703
DPBS no calcium, magnesium	Invitrogen	14190-136
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Gephyrin antibody	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT antibody	Synaptic Systems	131 002	1:1,000
anti GFP	Life Technologies	A6455	1:2,000
Glass bottom tissue culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm	Warner Instruments	640-0702