Capture Compound Mass Spectrometry - Ein leistungsfähiges Tool zum Identifizieren Novel c-di-GMP Effektorproteinen

Zusammenfassung

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Zusammenfassung

Beachtliche Fortschritte wurden im letzten Jahrzehnt auf die Identifizierung und Charakterisierung von Enzymen bei der Synthese (diguanylate Cyclasen) und Abbau (Phosphodiesterasen) beteiligt der second messenger c-di-GMP hergestellt. Im Gegensatz dazu ist wenig Information über die molekularen Mechanismen und Zellkomponenten durch die dieses Signalmoleküls reguliert eine Vielfalt von zellulären Prozessen. Die meisten der bekannten Effektor-Proteine ​​gehören zur Familie PilZ oder degeneriert diguanylate Cyclasen oder Phosphodiesterasen, die sich auf die Katalyse gegeben haben und Effektor-Funktion übernommen. So, um besser die zelluläre c-di-GMP-Netzwerk in einem weiten Bereich von Bakterien experimentelle Methodik zur Identifizierung und Validierung von neuartigen Effektoren für die zuverlässige in silico Vorhersage nicht definieren.

Wir haben vor kurzem eine neuartige Erfassung Verbindung Massenspektrometrie (CCMS) basierte Technologie als ein mächtiges Werkzeug, umbiochemisch zu identifizieren und zu charakterisieren, c-di-GMP-bindende Proteine. Diese Technik wurde bereits berichtet anwendbar auf einen weiten Bereich von Organismen ¹ sein. Hier geben wir eine ausführliche Beschreibung des Protokolls, die wir verwenden, um solche Signalkomponenten zu untersuchen. Als ein Beispiel verwenden wir P. aeruginosa, ein opportunistisches Pathogen in dem c-di-GMP spielt eine kritische Rolle bei der Virulenz und Biofilmkontrolle. CCMS identifizierten 74% (38/51) der bekannten oder vorhergesagten Komponenten des c-di-GMP-Netzwerk. Diese Studie erklärt die CCMS-Verfahren im Detail und stellt es als ein leistungsfähiges und vielseitiges Werkzeug, um neue Komponenten in kleinen Molekülen Signalisierung beteiligt sind.

Einleitung

c-di-GMP ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff von den meisten Bakterien verwendet, um verschiedene Aspekte des Wachstums und des Verhaltens zu steuern. Zum Beispiel regelt c-di-GMP Zellzyklusprogression, Motilität und die Expression von Exopolysacchariden und Oberflächen Adhäsine ^2-4. Durch die Koordination solcher Prozesse c-di-GMP fördert Biofilmbildung, ein Verfahren, das mit einer chronischen Infektion einer Reihe von pathogenen Bakterien ⁵ zugeordnet ist. c-di-GMP wird durch Enzyme genannt diguanylate Cyclasen (DGCs), die eine katalytische Domäne GGDEF ⁴ Hafen synthetisiert. Einige DGCs besitzen eine hemmende Website, die nach unten reguliert die Cyclase-Aktivität bei der c-di-GMP verbindlich. Der Abbau von c-di-GMP wird durch zwei unterschiedliche Klassen von Phosphodiesterasen (PDEs) beherbergen entweder eine katalytische EAL oder HD-GYP Domain ^6,7 katalysiert.

Die Mehrzahl der bekannten Effektorproteine, die direkt binden c-di-GMP gehören zu einer von drei Klassen von Proteinen: katalytischeVerbündeter inaktiv GGDEF oder EAL Domains und PilZ Domains, kleine molekulare Schalter, die Konformationsänderungen bei der c-di-GMP verbindlich ⁸ unterzogen werden. DGCs, PDEs und PilZ Proteine ​​sind gut gekennzeichnet und ihre Domains können in silico relativ sicher vorhergesagt werden. Ein besonderes Interesse gilt nun auf der Identifizierung von neuen Klassen von c-di-GMP Effektoren konzentriert. Einige c-di-GMP Effektoren mit unterschiedlichen Bindungsmotiven wurden kürzlich beschrieben, wie die CRP / FNR-Protein-Familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia oder der Transkriptionsregulator FleQ in P. aeruginosa ^9,10. Zusätzlich wurden c-di-GMP-spezifische RNA-Schalter kürzlich identifiziert und gezeigt, um die Genexpression in einer c-di-GMP-abhängige Weise ¹¹ steuern. Die c-di-GMP-Bindungsmotive von verschiedenen Effektoren nur schlecht konserviert machen bioinformatischen Vorhersagen solcher Proteine ​​schwierig. Um dieses Problem anzugehen, ein biochemisches Verfahren, das auf der Verwendung eines c-di-GMP spe basiert entwickelten wirsche Erfassung Verbindung mit der Massenspektrometrie ^1,12,13 kombiniert.

Wir haben vor kurzem entwickelt, eine neuartige dreiwertigen c-di-GMP-Capture Verbindung (CDG-CC, Abbildung 1) ^1. Diese chemischen Gerüst besteht aus: 1) als Köder, um c-di-GMP erfassen bindenden Proteinen verwendet eine c-di-GMP-Einheit, 2) eine UV-photoaktivierbare reaktive Gruppe verwendet werden, um vernetzen CDG-CC zu den gebundenen Proteine ​​und 3) einem Biotin, um die aufgenommenen Proteine ​​unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen zu isolieren. Die CDG-CC kann verwendet werden, um direkt und spezifisch einzufangen c-di-GMP-Effektoren aus komplexen Mischung von Makromolekülen, wie Zell-Lysaten. Capture-Verbindung auf der Basis chemischer und Proteomik Ansätze wurde bereits berichtet Anwendbarkeit auf einen breiten Bereich von Organismen, wie zB Caulobacter crescentus, Salmonella enterica Serovar typhimurium und S. aeruginosa ^1,14.

In diesem methodischen Papier,bieten wir eine eingehende Beschreibung des CCMS Verfahren unter Verwendung von Extrakten von P. aeruginosa als ein Beispiel. Diese Studie stellt CCMS als eine leistungsfähige und vielseitiges Werkzeug, um biochemisch identifiziert neue Komponenten in kleinen Molekülen Signalgebung beteiligt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Lysatherstellung

1. Wachsen P. aeruginosa-Zellen in LB an die gewünschte OD.
   HINWEIS: Für Hinweise: Verwenden ≈ 100 ml Kultur / Probe für stationäre Phase Kulturen und ≈ 500 ml cultur / Probe für log-Phase Kulturen (OD _600nm = 0,5).
2. Pellet durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g.
3. Resuspendieren 0,5-1 g Pellet in 1 ml Lyse-Puffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, 1 mM DDT, pH 7,5) und füge einen Proteaseinhibitor (vollständige Mini, EDTA-frei) sowie als DNaseI.
4. Lyse der Zellen durch 3 Passagen durch einen Französisch Druckzelle bei 20.000 psi (siehe Materialliste).
5. Ultrazentrifuge das Zelllysat bei 100.000 x g für 1 h bei 4 ° C.
6. Speichern Sie den Überstand (gehen Sie zu Schritt 2).
7. Durch Auf- und Abpipettieren Waschen des Pellets mit 1 ml 1x Lysepuffer.
8. Ultrazentrifuge bei 100,000 x g für 1 h bei 4 ° C.
9. Flash-einfrieren des Pellets inflüssigem Stickstoff und bei -20 ° C bis zur Erfassung von Membranproteinen (siehe Schritt 3).

2. Entfernung von Freier c-di-GMP und andere Nukleotide (lösliche Fraktion Only)

1. Mit 10 ml kaltem Lysepuffer Waschen eine PD10-Entsalzungssäule (siehe Materialliste).
2. Gießen Sie den Überstand (≈ 1 ml) auf die PD10, um Nukleotide zu entfernen.
3. Eluiert mit 4 ml kaltem Lysepuffer (500 ul Stufen).
4. Wählen Sie die am stärksten konzentrierten Fraktionen wie von Bradford bestimmt und sie gemeinsam.

3. Pellet Resuspension und Solubilisierung (Membranfraktion Only)

1. Das Pellet in 500 bis 1000 ul 1x Sammlungspuffer (ohne Reinigungsmittel) (siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Das Pellet ist schwierig, wieder zu suspendieren. Es ist mit der ersten Pipette auf und ab mit einer Pipette wird empfohlen, etwa das Pellet, dann, eine Spritze 27 G zu verwenden, um auch die Lösung zu homogenisieren.
2. 1% (w / v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM).
3. Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 h (oder O / N) auf einem rotierenden Rad.
4. Ultrazentrifuge bei 100,000 x g für 1 h bei 4 ° C.
5. Ernten Sie den Überstand.

4. Proteinkonzentrationsmessung

1. Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays (BCA-Assay für Membranfraktion).
2. Stellen Sie die Gesamtproteinkonzentration auf 10 mg / ml.

5. Erfassen

1. Mischungs 300 ug Protein und mit 1 mM GDP, GTP, ATP, CTP und 20 ul 5x Aufnahmepuffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% Glycerin, pH 7,5) (Tabelle 1). Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 100 ul mit H ₂ O.
   HINWEIS: das Gesamtvolumen umfasst das Volumen des CDG-CC und c-di-GMP bei der Wettbewerbskontrolle (siehe Schritt 5.3 und Tabelle 2).
   HINWEIS: Alle Experimente wurden in 200 & geführt# 181; l 12-Rohr-PCR-Streifen (Thermo Scientific).
   HINWEIS: für die Membranfraktion, stellen Sie sicher, immer die DDM-Konzentration zu halten über der kritischen Mizellenkonzentration (0,01% w / v), bis das Protein Solubilisierungsschritt in 8 M Harnstoff (Schritt 7.1).
2. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min auf einem sich drehenden Rad.
3. In 10 uM CDG-CC (Endkonzentration).
   HINWEIS: eine Steuer ohne CDG-CC (als "Perle Steuerung" bezeichnet), und eine Steuer mit 1 mM c-di-GMP ("Wettbewerbskontrolle") ergänzt (siehe Tabelle 2).
   Hinweis: Die CDG-CC-Konzentration von 1 bis 10 & mgr; M eingestellt werden.
4. Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 h (O / N für die Membranfraktion) auf einem rotierenden Rad, in der Dunkelheit.
5. Nach einer kurzen Spin, vernetzen durch Aktivierung des reaktiven Rest des CDG-CC mit UV-Licht für 4 Minuten mit einem CaproBox (siehe Materialliste, λ = 310 nm, Bestrahlungsstärke ≥10 mW / cm², Entfernung von der Quelle = 2 cm). HINWEIS: Entfernen Sie den Deckel der Streifen vor der Vernetzung.
6. Man gebe 25 & mgr; l 5x-Waschpuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) und 50 ul gut resuspendierten Streptavidin-Magnetkügelchen, sanft zu homogenisieren.
7. Inkubieren bei 4 ° C für 1 h auf einem rotierenden Rad.

6. Waschschritte

HINWEIS: (Magnet: siehe Materialliste). Beginnen Sie mit einer Erfassung der magnetischen Kügelchen in der PCR-Streifen Deckel, mit dem Magneten. Dann ersetzen Sie die PCR Streifen durch eine neue mit dem nächsten Waschlösung. Entfernen Sie den Magneten und resuspendieren die Perlen, und Inkubation 2 min. Spin down, und ersetzen Sie den Deckel durch eine frische Deckel.

1. Waschschritte (lösliche Fraktion nur)
   1. 6-mal in 200 ul 1x Waschpuffer waschen.
   2. Einmal in 200 ul HPLC-Qualität H ₂ O Waschen
   3. 6-mal in 200 ul 80% Acetonitril waschen.
   4. Waschen Sie 2-mal in 200 ul HPLC-Qualität H ₂ O
2. Waschschritte (membrane Bruch nur)
   1. 5 mal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0.1% DDM waschen.
   2. In 200 ul 1x Waschpuffer + 0,05% DDM waschen 2 mal.
   3. Einmal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0,025% DDM waschen.
   4. Einmal in 200 ul 1x Waschpuffer + 0,0125% DDM waschen.
   5. 3 Mal Waschen in 200 ul 100 mM ABC (Ammoniumbicarbonat, NH ₄ CO ₃₎ + 2 M Harnstoff.

7. MS Probenvorbereitung

1. Resuspendieren der Beads (direkt im Deckel) in 20 ul 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M Harnstoff für die Membranfraktion) und Überführung in 1,5-ml-Röhrchen.
2. Nur Membranfraktion: Inkubation bei 60 ° C für 5 min, bei 500 Upm Schütteln.
3. In 0,5 ul 200 mM TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin) und Inkubation bei 60 ° C für 1 h, bei 500 Upm schüttelnd. Abkühlen auf 25 ° C.
4. In 0,5 ul frisch hergestelltes 400 mM Iodacetamid und Inkubation bei 25 ° C für 30 min, Schütteln einT 500 Umdrehungen pro Minute und in der Dunkelheit.
5. Mit 0,5 ul 0,5 M N-Acetyl-Cystein und Inkubieren bei 25 ° C für 10 min, bei 500 Upm Schütteln.
6. Nur Membranfraktion: fügen 1 ul Lys-C und bei 37 ° C, O / N.
7. In 2 ug Trypsin und Inkubation O / N bei 37 ° C, bei 500 Upm (wrap in Parafilm Austrocknen zu verhindern) Schütteln.
   HINWEIS: Die Proben können bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert.
   HINWEIS: Membranfraktion nur: mit 100 mM ABC, um die Harnstoffkonzentration auf <2 M vor der Zugabe von Trypsin anpassen.
8. Kurz Spin-Down der Rohre und sammeln Kügelchen mit dem Magneten.
9. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen (wiederholen Sie diesen Schritt, wenn Perlen gelassen werden).
10. Mit 5 & mgr; l 5% TFA (Trifluoressigsäure) + 1 & mgr; l 2 M HCl (15 & mgr; l 5% TFA + 5 & mgr; l 2 M HCl für die Membranfraktion).
11. Bedingung C18 Microspin-Säulen (The Nest Group, MA, USA) mit 150 & mgr; l Acetonitril (spin 20 sec bei 2400 rpm).
12. Equilibrate der C18-Säulen 2 mal mit 150 ul 0,1% TFA (Spin 20 Sekunden, 2400 rpm).
13. Laden Sie die Probe und Spin 2 min, 2000 Upm.
14. Neuladen des Durchfluss auf die Säule und wiederholen den Spinnschritt (2 min, 2.000 rpm).
15. 3x waschen mit 150 ul 0,1% TFA, 5% Acetonitril (20 sec, 2.400 rpm).
16. Nehmen Sie eine neue Röhre und eluieren zweimal mit 150 ul 0,1% TFA, 50% Acetonitril (2 min, 2.000 rpm).
17. Man trocknet die Peptide in einer Speed-vac.
18. Resuspendieren in 40 & mgr; l 98% H ₂ O, 2% Acetonitril, 0,15% Ameisensäure.
19. Ultraschallbehandlung 20 s (Impulszyklus 0,5, Amplitude 100%, siehe Materialliste) und Spin-down 5 s, 12.000 min (Tischzentrifuge). Vortex 10 Sekunden, und Spin-down 5 s, 12.000 min. Übertragen Sie in einem HPLC-Ampulle für LC-MS / MS-Analyse.
20. Bei -20 ° C.
    HINWEIS: Die Proben können bei -20 ° C zu diesem Zeitpunkt gespeichert.

8. LC-MS / MS-Analyse

1. Führen Sie einen Nano-LC (nano-LC-Systeme) equipped mit einer RP-HPLC-Säule (75 um x 37 cm) mit C18 Harz gepackt (Magic C18 AQ 3 & mgr; m) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 95% Lösungsmittel A (0,15% Ameisensäure, 2% Acetonitril) und 5% Lösungsmittel B ( 98% Acetonitril, 0,15% Ameisensäure) bis 35% Lösungsmittel B über 60 min bei einer Flussrate von 0,2 ul / min.
2. Analyse der Peptide mittels LC-MS / MS (Zweidruck LTQ-Orbitrap Velos Massenspektrometer, mit einem Elektrospray-Ionenquelle verbunden ist).
   HINWEIS: Die Datenaufnahme-Modus wurde eingestellt, um eine hochauflösende MS-Scan in der FT Teil des Massenspektrometers mit einer Auflösung von 60.000 FWHM gefolgt von MS / MS-Scans in der linearen Ionenfalle der 20 intensivsten Ionen zu erhalten. Um die Effizienz der MS / MS-Versuche zu erhöhen, wurde der Ladezustand Screening Modus aktiviert werden, damit nicht zugeordnete auszuschließen und einzeln berechnet Ionen. Collusion induzierte Dissoziation wurde ausgelöst, als der Vorläufer über 100 Ionen zählt. Die dynamische Ausschluss Dauer wurde auf 30 Sekunden eingestellt. Der Ionenakkumulationszeit auf 300 ms (MS) und 50 eingestelltms (MS / MS).

9. Datenbanksuche

1. Laden Sie die P. aeruginosa NCBI-Datenbank über die NCBI-Homepage ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. Konvertieren Sie die MS Rohspektren in Maskottchen Generika-Dateien (mp) mit dem MassMatrix Konvertierungstool ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. Suche auf der mp-Datei mit MASCOT Version 2.3 gegen die P. aeruginosa NCBI-Datenbank, die vorwärts und rückwärts-Köder-Protein-Einträge.
4. Führen Sie ein in silico Trypsinverdau nach Lysin und Arginin (es sei denn, durch Prolin gefolgt) tolerieren zwei verpasst Spaltungen in voll tryptischen Peptide.
5. Stellen Sie die Datenbanksuchparameter, um oxidierte Methionine (15,99491 Da) als variable Änderungen und Carboxyamidomethylierung (57,021464 Da) von Cysteinresten als feste Modifikation kann. Für MASCOT sucht unsing hochauflösende Scans, stellen Sie den Vorläufer Massentoleranz bis 15 ppm und stellen Sie die Fragmentmassentoleranz von 0,6 Da. Schließlich, stellen Sie den Protein FDR auf 1%.
6. Importieren Sie die Maskottchen-Durchsuchungen von P. aeruginosa CCMS Experimente in Scaffold (Proteomesoftware, Version 3), stellen Sie die Parameter, um ein Protein FDR knapp 1% zu erhalten, und extrahieren Sie die gesamte spektrale zählt.
7. Für in diesem Papier die repräsentativen Ergebnisse präsentiert, haben wir eine gepaarte T-Test, den Versuch mit der Wettbewerbskontrolle zu vergleichen und nur dann als Treffer mit einem p-Wert von weniger als 0,1 und einer spektralen Zahlverhältnis über 2 (experimentieren spektrale counts / Wettbewerbskontrolle Spektralbereich Aktivität).
8. Die Daten können in jedem Tabellenkalkulations-Software zur weiteren Analyse exportiert werden.

10. Markierungsfreie Quantifizierung

1. Importieren Sie die Raw-Dateien in Progenesis LC-MS-Software (Nichtlineare Dynamik, Version 4.0).
2. Führen LC-MS Ausrichtung und Feature-Erkennung in Verzug settings.
3. Exportieren Sie die Daten in mgf Format von Progenesis LC-MS.
4. Durchsuchen Sie die MS / MS-Spektren mit Hilfe des MASCOT gegen die NCBI P. aeruginosa Datenbank, die vorwärts und rückwärts-Köder-Protein-Einträge.
5. Importieren Sie die Datenbanksuchergebnissen in Progenesis LC-MS und Karte der Peptide Identifikationen zu MS1 Funktionen.
6. Für die Datenauswertung (Berechnung der Signifikanzniveaus, klappbar Änderungsverhältnisse) die ProteinSQAnalysis Skript SafeQuant verwendet (Schwelle: q-Wert unter 0,1, spektrale Zahlverhältnis über 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Um neue c-di-GMP-Effektoren in P. identifizieren aeruginosa wir systematisch genutzt CCMS die löslichen und Membranfraktionen P. analysieren aeruginosa Stamm PAO1 aus einer log-Phase Kultur (OD ₆₀₀ = 0,5). Hier werden wir zusammenfassen und diskutieren Vertreter Ergebnisse dieser Angelausflug. Vier unabhängige biologischen Replikate wurden verwendet. Für jeden Versuch zwei verschiedenen CDG-CC-Konzentrationen wurden verwendet (5 uM und 10 uM). Um die Spezifität zu unter...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Besondere Sorgfalt sollte bei verschiedenen Stufen des Protokolls gefaßt. Die Proteinkonzentration ist ein kritischer Parameter bei einer Konzentration von 10 mg / ml, schwierig zu erreichen, wenn die Zellen unter bestimmten Wachstumsbedingungen (zB Biofilmen oder kleine Kolonie Varianten) gezüchtet. Somit sollte das Pellet resuspendiert in einem niedrigen Volumen Lysepuffer geführt werden. Proteinkonzentrationen können bis zu 8 mg / ml reduziert werden. Im Vergleich zu der durch Nespers et al. Ver...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003