Wer ist wer? Nicht-invasive Methoden zur Individuell Sex und Mark Nesthocker Chicks

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine bequeme Reihe von Methoden, die extrem schnelle, einfache, nicht-invasive, sichere und kostengünstige ermöglicht, molekulare Geschlechtsbestimmung der Vögel und ihrer nicht-invasiv, schnell, sicher und leicht erkennbare Kennzeichnung kurz nach dem Schlüpfen. Nur begrenzt Handhabung von Küken erforderlich. Diese praktische Toolbox von Methoden entspricht vollständig den RRR-Richtlinien.

Zusammenfassung

Viele Experimente erfordern frühzeitige Bestimmung der Nachwuchs das Geschlecht sowie frühe Kennzeichnung von Neugeborenen für individuelle Anerkennung. Laut Tierschutz-Richtlinien sollten nicht-invasive Techniken anwendbar, wenn bevorzugt werden. In unserer Gruppe arbeiten wir auf verschiedenen Arten von Singvögel im Labor und auf dem Feld, und wir erfolgreich nicht-invasiven Methoden anwenden, um Sex und individuell markieren Küken. Dieser Beitrag stellt eine umfassende nicht-invasive Tool-Box. Geschlechtsbestimmung Vögel vor dem Ausdruck der sekundären Geschlechtsmerkmale erfordert die Sammlung von DNA-Lagermaterial für die PCR. Wir haben eine schnelle und einfache Methode, um Sex Vögel jeden Alters (post Schraffur) durch Extraktion von DNA aus Mundschleimhautabstrichen. Die Ergebnisse können innerhalb von 3 Stunden erreicht werden. Für Daunenfedern individuellen Kennzeichnung Küken werden in spezifischen Mustern ermöglicht eine schnelle Identifikation innerhalb der Schraffur um getrimmt. Dieser Satz von Methoden ist leicht anwendbar in einem Standard ausgestattetes Labor und besonders geeignet für Workinzur Abtastung und Speicherung g in dem Feld ohne spezielle Ausrüstung erforderlich. Handhabung von Küken minimiert und Markierung und Geschlechtsbestimmung Techniken sind nicht-invasiv, wodurch die RRR-Prinzip der Tierschutz-Richtlinien unterstützen.

Einleitung

Individuelle Anerkennung, Geschlechtsbestimmung und Genotypisierung sind grundlegende Voraussetzungen in einer Vielzahl von experimentellen Studien. Gewinnung von DNA Lagermaterial und Kennzeichnung Themen eindeutig (auch in einem frühen Alter) sollte nur minimale Auswirkungen auf die Physiologie, das Verhalten und Überleben. Wann immer möglich, sollten invasive Verfahren nach dem Prinzip RRR ¹ vermieden werden.

Nicht-invasive Verfahren sind nicht nur nützlich für das Tier, sondern könnte auch die erhaltenen Daten zu verbessern, wie die Tiere weniger von den Behandlungen betroffen.

Bei Vögeln können DNA-Geschlechtsbestimmung von einer Reihe von nicht-invasiv erhältlich Materialien wie Kot ^2, Federn ^3,4 oder Mundschleimhautabstrichen ^3,5,9 durchgeführt werden. Unabhängig von Zustand und Alter Mundschleimhautabstrichen Subjekts sind die Methode der Wahl für die Vogel-Geschlechtsbestimmung, weil sie einfach durchzuführen sind, selten scheitern und die Behandlung ist kurz.

So weit, DNA aus Mundschleimhautabstrichenwurde entweder mit kommerziell erhältlichen Kits ^3,6 oder zeitaufwendig Standard-DNA-Extraktionsprotokolle ^3,6-8 extrahiert. Kits sind nicht nur ziemlich teuer, aber ihre Protokolle können Herausforderungen für die Feldarbeit zu verhängen. Einige Verfahrensdetails, zB Trocknen und Inkubation von Proben, nicht praktikabel sind im Feld. Gerade in einer Umgebung, wo experimentelle Protokolle erfordern Geschlecht abhängig von der Behandlung so früh wie ein paar Minuten nach dem Schlüpfen, gibt es fordern für eine schnelle, nicht-invasive, sichere und einfache Methode, um Ergebnisse zu erhalten.

Auf der Vogelgrippe Taxa eine erhebliche Toolbox zur Markierung Personen entwickelt worden ^10. Die breite Palette an verfügbaren Techniken erklärt die Vielfalt der Forschungsziele, Arten und Budgets. Allerdings Kennzeichnung kleinen Nestlinge hat die Forscher mit weiteren Herausforderungen konfrontiert. Bei einigen Arten (zB Singvögel) Küken sind zu klein, um Beinbänder anzuwenden und erfordern alternative Verfahren, diekeine Eltern-Nachkommen Verhalten zu ändern. Da das Bewusstsein und Interesse an der Verbesserung des Tierschutzes und Techniken in der Feld-und Laborstudien wächst, ist die Verwendung von nicht-invasiven Techniken stark gefördert und bevorzugt.

Dieses Protokoll bietet eine nicht-invasive, schnell, leicht erkennbar und anhaltende Methode, um individuell zu kennzeichnen sehr jungen Nestlinge vor der Anwendung Beinbänder möglich ist. Diese Markierungsmethode ist auf einer der wichtigsten Vogel-Labormodell Arten, die Zebra-Fink (Taeniopygia guttata) ^11-13 eingeführt. Das Protokoll entspricht allen bisher veröffentlichten Ziele für die einzelnen Markierungstechniken ¹⁰ und wurde bereits erfolgreich angewendet ^14,15.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz (TierSchG) durchgeführt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Verbrauchsmaterial

1. Eine 5% (w / w) Chelex-100-Lösung in der molekularen Grad Wasser. Aliquots von 200 ul in Standard 1,5 ml Reaktionsgefäße. Da die Chelex-Harz fällt schnell aus der Suspension ist es notwendig, erneut homogenisiert die Suspension ständig während der Herstellung der Teilmengen. Es ist ratsam, 50 ml oder mehr in einer Charge vorbereiten und halten die homogenisiert mit einem Magnetrührer Federung. Die Chelex-Lösung kann über Jahre bei Umgebungsbedingungen gelagert werden.
2. Schnitten Stücke Whatman-Papier mit einer Breite kleiner als die Breite der Schnabel des Vogels zu prüfen. Die Länge des Papiers hängt von der Methode, die Probe zu nehmen:
   1. Mit einer Pinzette, sollte das Stück lange genug, um Probenentnahme ohne die Zange in die Schnabel des Vogels eingeführt ermöglichen. Alsgrobe Schätzung, für eine Schnabellänge von 0,5 cm ein Stück Papier mit der Länge von 1 cm sollte in Ordnung sein.
   2. Wenn nicht mit einer Pinzette, muss das Stück länger sein, aber die Steifigkeit des Teils sollte noch Probenahme von Epithelzellen zu ermöglichen.
3. Vorbereitung eines Aliquots der PCR-Vormischung für jede zu analysierende Probe. Für eine PCR in einem Gesamtvolumen von 25 &mgr; l der Mischung enthält 0,18 mM dNTPs, 2 mM MgCl _2, 70 mM Tris-HCl, 17,25 mM Ammoniumsulfat, 0,1% Tween-20, 0,32 &mgr; M Primer P2 (TCTGCATCGCTAAATCCTTT), 0,32 uM P8 Primer (CTCCCAAGGATGAGRAAYTG) ¹⁶ und 2 Einheiten Taq-Polymerase. Hausgemachte Taq-Polymerase ¹⁷ verwendet werden. Zusätzlich zu der maximalen Menge der DNA-Lösung zu ermöglichen, kann ein 6 &mgr; l Premix hergestellt und bei -20 ° C gelagert werden, für mehrere Wochen.

2. Probenentnahme

Das Tragen von Handschuhen ist nicht notwendig für die Aviäre Geschlechtsbestimmung, wie die PCR-Primer können nicht auf menschliche DNA anlagern. FürGenotypisierung andere Zwecke könnte es sinnvoll sein.

1. Nehmen Sie den Vogel von Interesse und sanft halten sie in einer Hand, zB mit dem "Ringergriff" ^18. Achten Sie darauf, den Vogel nicht zu drücken.
2. Halten Sie ein Stück Whatman-Papier mit einer Pinzette und streichen Sie es mehrmals über die Innenseite der Wangen, der Zunge und der Choane. Proben werden in der Regel in weniger als 30 Sekunden erreicht.
   1. Erwachsene Tiere: abhängig von der Art könnte es schwierig sein, den Vogel auf seinem Schnabel öffnen zu bekommen. Normalerweise berühren die Seite der Schnabel und mit leichtem Druck arbeiten.
   2. Nestlings: Probenahme aus Jungtiere oder Nestlinge ist besonders einfach mit dieser Technik, da ihre Bettelverhalten bietet einfachen Zugang zum Inneren des Schnabels. Es könnte sogar möglich sein, die Probe ohne mit ihnen überhaupt zu erhalten, wie sie z. B. leicht zu bitten, wenn ihre Nistkasten geöffnet.
3. Das Papier in einer vorbereiteten Reaktionsrohr Contai sofort speichernNing 200 ul 5% (w / w) Chelex-100-Lösung.

Wenn Sie beabsichtigen auch / müssen, um die Küken zu kennzeichnen, tun Sie es jetzt, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

3. Lagerung der Proben vor der DNA-Extraktion

1. Wenn im Labor arbeiten, Lagerung von Proben bei -20 ° C Wenn dies bei Umgebungstemperaturen nicht möglich oder schwierig (z. B. auf dem Gebiet) Proben.
2. Proben für mehr als 3 Jahre bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis -20 ° C gelagert werden

4. DNA-Extraktion

1. Wenn die Probe eingefroren, aufgetaut bei Raumtemperatur.
2. Sicherzustellen, dass das Stück Papier, auf dem Boden des Rohrs in der Chelex-100-Lösung eingetaucht.
3. Proben für 15 min Inkubation bei 56 ° C.
4. Vortex kurz auf und drehen Sie den Inhalt des Rohres.
5. Die Proben für 8 min bei 100 ° C inkubieren
6. Drehen Sie die Proben bei 15.000 g für 3 min.
7. Verwenden Sie die supernatant für spätere Genotypisierung.

5. Molekulare Geschlechtsbestimmung

1. Bereiten Sie ein PCR-Röhrchen mit 6 ul Vormischung pro Probe sowie zwei zusätzliche Rohre für die negative (obligatorisch) und Positivkontrolle (optional). Für Routinegeschlechtsbestimmung gehören eine Probe aus dem letzten erfolgreichen Geschlechtsbestimmung als positive Kontrolle.
2. Add 19 ul des Überstands aus der DNA-Extraktion zu dem PCR-Vormischung. Achten Sie darauf, von der Oberfläche der Lösung pipettieren, um Verschleppung von Chelex Perlen zu vermeiden. Dies ist entscheidend, wie Chelex ein Kationenaustauscher ist und somit alle enzymatischen Reaktionen stark hemmt.
3. Den folgenden PCR-Programm: Die Inkubation bei 94 ° C für 3 min, 45 Zyklen mit jeweils 30 sec Schmelzschritt 94 ° C, gefolgt von einem 30 Sekunden Annealing-Schritt bei 55 ° C, gefolgt von einem 45 Sekunden Verlängerung bei 72 ° C. In einem letzten Schritt vertreiben, werden die Reaktionen für 5 min bei 72 ° C inkubiert,
4. Bereiten Sie eine 2%-Standard TBE oder TAE agaro se Gel auf der PCR-Produkte zu trennen.
5. Führen Sie die Agarose-Gel mit entsprechenden Spannungseinstellungen.
6. Visualisieren Sie die Banden unter UV-Licht und ein Bild. Stellen Sie sicher, dass die beiden Bands in den Proben von Frauen stammen, sind gut voneinander getrennt.
7. Unterscheiden männlichen von den weiblichen Proben durch die Anwesenheit von einem (männlichen) oder zwei (weiblich) Bands.

6. Kennzeichnung Nestlings

1. Überprüfen Nester für neu geschlüpften Küken auf einen Zeitplan für die entsprechenden Arten / Studie (zB tägliche Kontrollen in den Morgen wird empfohlen, da die meisten Küken schlüpfen dann).
2. Schneiden Sie die Daunenfedern jedes Küken in einem Nest an einem anderen charakteristischen Lage. In Zebrafinken Büschel Tiefen wachsen vier charakteristischen und unterschiedlichen Gebieten in der Nestlings Körper (Abbildung 4A). Für jedes Küken schneiden einem Bereich (4B). Wenn es mehr als vier Küken in einem Nest, die einzigartigen vier "Haircuts" können kombiniert werden.

ove_content "> Für Zebrafinken: Bewerben Beinbänder um zehn Tage nach dem Schlüpfen, wenn Daunenfedern zu schwer zu erkennen und Nestlings Größe ermöglicht es klingelt.

Ergebnisse

Abstrichmaterial kann in einer Vielzahl von kleinen Vögeln verwendet, um DNA für die Geschlechtsbestimmung zu erhalten

Kanaren (Serinus canaria), Bengalen Finken (Lonchura striata), Nachtigallen (Luscinia megarhynchos), Kohlmeisen (Parus major) und Amseln (Turdus - Proben wurden von Zebrafinken (5 Jahre Taeniopygia guttata, 99 Personen, Alter 0 Tage) gesammelt Merula) (für alle anderen Arten: Stichprobengröße 1-3, Alter u...

Diskussion

Geschlechtsbestimmung von Mundschleimhautabstrichen mit Chelex zeigten eine extrem hohe Erfolgsquote. Daunenfedern Schneidjungtier ermöglichte Differenzierung zwischen Nestlinge, bis Bein Streifenbildung möglich war.

Chelex-DNA-Extraktion aus Wangenschleimhautabstrichen ergab genug, um molekulare DNA Geschlechtsbestimmung erfolgreich durchzuführen. Geschlechtsbestimmung war 100% richtig, wie geschlechtsdimorphischen Gefieder validiert. Die Erfolgsrate hier berichtet wird, ist deutlich hö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn