In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Zusammenfassung

Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.

Zusammenfassung

Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.

Einleitung

Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen ^1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen ³ ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) ¹ zu modellieren. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Durchflusskammer-Systeme eingesetzt, um Blutgefäßsystem zu simulieren. Unter Flusskammer-Einheiten wird Parallelplatten-Durchflusskammer (PPFC) in Verbindung mit ECs routinemäßig als in vitro-Modell simuliert in vivo Scherstressbedingungen eingesetzt. HierinVerfahren ECs auf einem 35-mm-Schale gezüchtet und nach Erreichen einer Monoschicht werden ECs zum PPFC befestigt und Scherspannung basierend Experimente durchgeführt werden.

, PPFC und anderen aktuellen Systemen präsentieren jedoch viele Einschränkungen zum Studium adhäsive Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Tumorzellen (CTC) von Patienten und ECs stammen, die vorwiegend, weil CTC sind eine seltene Population von Zellen, aus dem Primärtumor Schuppen, unter den Millionen von zirkulierenden Blutzellen (1 CTC pro 10 ⁹ Blutkörperchen) ^4. Daher, im Gegensatz zu unbegrenzten Vorrat an kultivierten Zelllinien, geringe CTC zählt zu sehr wenigen und seltenen CTC / EC-Interaktionen, erfordern richtige Strömung Kanalbreite, um die Interaktionen für die Wiedergabe Analyse aufzeichnen. Darüber hinaus, da Patienten abgeleitet CTC sind eine unreine Bevölkerung, also eine Identifikationsmarkierung ist erforderlich, um in bestimmten CTC verfolgen. Um dieses Problem zu lösen, ein neues Verfahren, um Prostatakrebs zu identifizieren (PCa) CT entwickelten wirCs unter Ausnutzung der Tatsache, daß praktisch alle diese CTC auszudrücken Prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) auf ihrer Zelloberfläche ^5,6. In diesem Bericht haben wir die Prostatakrebs-Zelllinie, MDA PCa2b (MDA), um den potentiellen Nutzen von unserem neuen System, um Prostatakrebs, CTC Wechselwirkungen mit ECs Studie zeigen, schließlich, um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen.

Unsere Methodik kann für verschiedene Scher basierte Experimente simuliert in vivo Gefäßsystem ^9.7 angewendet werden. Neben der Prüfung PCa CTC / EC-Interaktionen, konnte der Stromfluss-Kammer-System leicht für die Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen oder Wechselwirkungen Tumorzellen 'mit ECs angepasst werden. Die Einfachheit der Demontage und Wiedermontage der Strömungskammer, ein Mikroobjekt III ^(0,1) (nachstehend als Mikroobjekt bezeichnet), ermöglicht die Kultivierung ECs unter Perfusion und Stimulieren ECs mit verschiedenen Zytokinen induzieren protein Ausdruck. Außerdem kultivierten Endothelzellen, rekombinante Proteine, wie E-und P-Selektin auf der Mikroobjekt und Interaktion mit Tumorzellen, beschichtet werden können, unter laminaren Strömungsbedingungen ¹⁰ beobachtet werden.

Protokoll

1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen

1. Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze.
2. Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im Kanal.
3. Perfuse 200 &mgr; l warme (37 ° C) HUVEC-Wachstumsmedium (M199-Medium, 1 M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml Heparin, 100 ug / ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor und L-Glutamin) auf der Mikroobjekt inkubieren 20 min bei RT. Während der Perfusion, bereiten HUVEC Zellsuspension.
4. Spülen HUVECs mit PBS und fügen 0,05% Trypsin-EDTA für 1-2 min bei RT. Zentrifuge HUVECs in 2 ml Wachstumsmedium bei 180 × g für 5 min.
5. Messen Sie die Zellkonzentration mit Hilfe eines neubauer Hämozytometers und bereiten 10 ⁷ HUVEC Zellen/100 ul Wachstumsmedium. Dann vorsichtig aus dem Einlass des Mikroobjekt mit einer 200-ul Pipettenspitze entfernen das Medium.
6. Bringen Sie die Mikroobjekt auf Augenhöhe und mit einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze vorsichtig perfuse 200 ul der vorbereiteten Konzentration von HUVECs in den Kanal. Vorsicht ist bei diesem Schritt erforderlich ist, um Blasenbildung zu verhindern. Wenn die Blasen erscheinen, halten Perfusion für eine etwas längere Zeit, bis sich Blasen geben Sie den Ablaufkanal.
7. Setzen einer gleichen Menge (~ 80 &mgr; l) von HUVEC Medien sowohl dem Einlass und Auslass des Mikroobjekt. Dies verhindert den Fluss von Zellen in jeder Richtung.
8. Decken Sie die Folie und halten Sie es in den Inkubator (37 ° C) für 1,5 Stunden.

2. Vorbereitung der Flusskammer Versammlung für Übernachtung HUVEC Kultur auf einem Microslide

1. Legen Sie eine sterile 20-ml-Spritze, weiblichen und männlichen Luer-Anschlüsse, Schläuche und eine Spritzenpumpe im Inkubator für 15 kmn.
2. Für minimale Totvolumen, verwenden Sie die Schläuche mit Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Kleinere Rohrdurchmesser verhindert Blasenbildung.
3. Füllen die 20-ml-Spritze mit warmem (37 ° C) HUVEC-Medium (12 ml). Befestigen Sie die Schläuche mit den Anschlüssen auf die Spritze. Entfernen Sie die Luftblasen. Verbinden Sie dieses Anordnung an der Mikroobjekt.
4. Vollständig zu füllen den Einlass des Mikroobjekt mit HUVEC Medien. Bringen des gefüllten 20-ml-Spritze an dem Verbinder angebracht neben dem Mikroobjekt. Den Stecker zu befestigen vorsichtig auf die Mikroobjekt.
5. Bringen Sie das Set-up in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Spritzenpumpe, bei 10 ml / min Scherrate eingestellt. Lassen Sie die Zellen O / N im Brutschrank bei 37 ° C
6. Am nächsten Tag, zerlegen den Aufbau durch Entfernen des Verbinders an dem Einlass des Mikroobjektträger befestigt.
7. Um E-Selektin-Expression auf Endothelzellen hochregulieren, bereiten Sie frisches Wachstumsmedium mit IL-1β bei 10 ng / ml in 4 ml Medium. Saugen Sie das Medium in einem 10-ml-Spritze. T entfernener Medium aus dem Einlass des Mikroobjekt und der Spritze zu verbinden, um die Folie.
8. Stellen Sie die Spritzenpumpe mit 10 ul / min Schergeschwindigkeit für 4 Stunden in den Brutschrank.

3. Herstellung von anti-PSMA (J591-488) gekennzeichnet Prostatakrebszellen

1. Während IL-1β Inkubation von HUVECs, bereiten anti-PSMA-J591-Alexa488 PCa-Zellen. Hinzufügen von 0,05% Trypsin-EDTA-MDA-Zellen für 1 min. Nicht die Zellen Trypsin für längere Zeit ausgesetzt werden, da sie die auf der Zelloberfläche vorhanden Glycopeptide beeinflussen. Enzym-freie Zelle Dissoziation Reagenz kann auch anstelle von Trypsin verwendet werden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min.
2. Resuspendieren MDA Zellpellet in 1 ml H / H-Puffer (Hanks balanced salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl _2). In anti-PSMA-J591-Alexa488 Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. Resuspendieren der Zellen während der Inkubation.
3. Nach 30 min Zentrifugation der Zelllösung bei 800 × g für 5 min. AspiRate und das Pellet in 1 ml H / H-Puffer. Zählen Sie die markierten Zellen und MDA bringen die Endkonzentration auf 1x10 ⁶ Zellen / ml. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit J591-488 markierten Zellen MDA und die Bläschen.

4. Vorbereitung der Anti-PSMA (J591-488) beschriftet CTC Enriched von PCa Patienten

1. Sammeln Sie 7,5 ml Blut von Patienten mit Prostatakrebs in einem blauen Kappe Rohr (mit Na-Citrat). Sanft Blut verdünnen 01.01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS.
2. Add 5.3 ml Ficoll-Paque Plus in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht verdünntes Blut auf dem Ficoll-Paque. Zentrifugieren bei 400 g für 30 min.
3. Vorbeschichtung alle Rohre oder Spitzen in Kontakt mit CTC mit 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl _2/4 mM MgCl ₂ (R / S-Puffer) nicht-spezifische Bindung von CTC an den Oberflächen zu verhindern. Aufrechtzuerhalten 4 ° C Temperatur der Medien und Puffer in Kontakt mit CTC.
4. Das Blut peripheren mononuklearen Zellen (PBMCs)-Fraktionenthält CTC von der Schnittstelle in einem anderen 50-ml konischen Röhrchen, enthaltend 30 ml R / S-Puffer. Zentrifugieren bei 400 g für 8 min.
5. Das Pellet und waschen wieder in R / S-Puffer bei 400 g für 8 min. Nach der Zentrifugation das Pellet in H / H-Puffer. In anti-PSMA-J591-488-Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort.
6. Nach 30 min zentrifugieren die PBMCs enthält J591-488 markierten CTC bei 800 g für 5 min. Resuspendieren in H / H-Puffer. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze (mit R / S-Puffer vorgezogen) mit der Probe.

5. Herstellung von Mikroskop, Spritzenpumpe und Durchflusskammerversammlung

1. Schalten Sie den umgekehrten Mikroskop und stellen Sie die Beleuchtung bei Kohler 10X-Objektiv. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf dem gleichen Niveau wie der Probentisch des Mikroskops und setzen Sie ihn auf 1 dyn / cm ² Schubspannung (~ 10 ml / min).
2. Öffnen Sie die Zeiss Axiovision Software. Wählen Sie das Ziel auf dem Computer-Bildschirm. Erstellen Sie eine neueOrdner unter der Option-Tools in der Software.
3. Öffnen Sie die Option Smart-Experimente in Axiovision und die Einstellungen zu kurzen 30 Sekunden Videos für 30 Minuten aufzeichnen.
4. Für die Live-Videofluoreszenz, stellen Sie die Bildoptionen-12 ms Belichtungs, 2 x 2 bin, 5 zu gewinnen. Diese Parameter helfen bei der Erreichung Videos der Nähe des Video-Bildrate (~ 23 Bildern pro Sekunde) mit der Zeiss MRM-Kamera.
5. Um die volle Breite des Strömungskanals bei 10 X Ziel auf dem Bildschirm sichtbar zu machen, mit einem C-Mount-Adapter (0,63 mm xf/60 Interface).
6. Schalten Sie den Quecksilberlampe.
7. Legen Sie die Spritze und den Stecker mit den Zellen auf den Spritzenpumpe.
8. Bringen IL-1β stimulierten HUVECs aus dem Inkubator. Befestigen Sie den Stecker mit dem gefüllt Einlasskanal des Mikroobjekt enthält HUVECs.
9. Verbinden der Austrittskanal mit dem Anschluss an die Rohrleitung angebracht ist. Setzen Sie den Schlauch in eine Schale oder 15 ml konischen Röhrchen, um die Strömung durch sammeln.
10. Starten Sie den infusiauf durch die Mikroobjekt bei 10 ul / min. Beachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Zellen der Bezeichnung MDA oder markierte CTC von Patienten unter 488-nm-Filter auf der Epifluoreszenzmikroskop abgeleitet.
11. Starten Sie die Aufnahme des Experiments als 30 Sekunden kurze Videos. Während der Wiedergabe Analyse, messen die Walzgeschwindigkeit. Walzgeschwindigkeit wird durch Division des Abstandes von den Zellen über die Zeit zurück gemessen.

6. Immunfärbung des Microslide

1. Druckmaterial aus dem Einlaß und Auslaß der Mikroobjekt nach Perfusion MDA-Zellen auf IL-1β-stimulierten HUVEC-Zellen für 10 min.
2. Verwendung einer 200 ul-Spitze, setzen warm (37 ° C) PBS, das Calcium und Magnesium in den Einlass des Mikroobjektträger für 5 min. Neigen Sie den Mikroobjekt mit seinem Deckel als Stütze auf der Bank. Halten Sie die Mikroobjekt in einer gekippten Position für alle Inkubationen während Immunfärbung.
3. Fix HUVECs durch Perfusion warmen 2% Formaldehyd in den Einlass
4. Inkubieren für 20 min bei RT. Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min.
5. Hinzufügen Triton-X 100 (0.1%) in 5% BSA in PBS für 10 min bei RT.
6. Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min.
7. Inkubieren mit primärem Antikörper Ziege-anti-VE-Cadherin (1:100) in 2,5% BSA O / N bei 4 ° C.
8. Am nächsten Tag, zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In Sekundär Esel-anti-Ziege-647-Antikörper für 45 min. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min.
9. Inkubation bei RT mit humanisierten J591-Alexa488 konjugierte Antikörper für 1 Stunde.
10. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In DAPI für 5 min. Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min.
11. In PBS (Mowiol oder für langfristige Lagerung). Visualisieren Sie die Mikroobjekt unter dem konfokalen Mikroskop.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst die...

Diskussion

Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen.

Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02