Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Zusammenfassung

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Zusammenfassung

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Einleitung

Eine der aktuellen Herausforderungen in neuronalen Gewebe-Engineering ist die Schaffung einer Nervenleitung (NC), die die extrazelluläre Matrix, wobei Nerven wachsen natürlich imitiert. Die Forschung hat gezeigt, dass Zellen reagieren auf verschiedene Faktoren in ihrer Umgebung einschließlich der mechanischen, topographisch, Klebstoff und chemische Signale ^1-3. Eine der primären Herausforderungen in diesem Bereich ist die Bestimmung der geeigneten Kombination von Signalen und Herstellung ein System, das Hinweise für einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten kann, das Zellwachstum ⁴ unterstützt. Peripheren Neuronen bekannt sind, um eine weiche Substrat bevorzugen, von ausgerichteten Fasern ausgerichtet werden, und auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) ^5-7. NCs, die chemische Signale für Wochen liefern können, sind gezeigt worden, um eine verbesserte funktionelle Erholung näher an der Allografts, der aktuelle Gold-Standard für die Nervenreparatur ^8,9 bieten.

Zu produzieren mechanische und topographische können verschiedene Materialien und Produktionsmethoden verwendet werdenal Queues ^10-13. Mechanische Signale sind inhärent für das gewählte Material, so dass die Auswahl des geeigneten Materials für die Anwendung kritischen ^1,13. Produktionsmethoden zu kontrollieren topographische Hinweise sind Phasentrennung, die Selbstorganisation und das Elektro ^1,13. Für Mikroanwendungen, Mikrofluidik, Photostrukturierung, Ätzen, Salz Laugen oder Gas Schäume können auch verwendet werden, ^14-17. Elektro hat als beliebteste Weg, um Fasersubstraten für die Gewebekultur-Ingenieur durch seine Flexibilität und Leichtigkeit der Produktion ^13,18-23 entstanden. Elektrogesponnene Nano werden durch Anlegen einer Hochspannung zu einer Polymerlösung so dass es zu sich selbst abzuwehren und erstrecken sich über eine kurze Lücke zu entladen ²⁴ hergestellt. Eine ausgerichtete Stützgerüst kann durch Sammeln der Fasern auf einer geerdeten rotierenden Dorn erzeugt werden und blockfreien Gerüsten sind auf einer stationären Platte ²⁵ gesammelt. Haftung Signalisierung kann durch Beschichtung der Fasergerüst wit erreicht werdenh Fibronectin oder Konjugation eines Haft Peptid, wie RGD, zu dem HA, bevor das Elektro ^26.

Chemische Signale, wie Wachstumsfaktoren, die am schwierigsten über längere Zeiträume aufrecht zu erhalten, weil sie benötigen eine Quelle für die gesteuerte Freisetzung. Viele Systeme wurden versucht, um eine kontrollierte Freisetzung zu elektro faserigen Netzen mit unterschiedlichem Erfolg hinzuzufügen. Diese Methoden umfassen Mischung Elektro, Emulsion Elektro, Kern-Schale-Elektro und Protein-Konjugation ^27. Zusätzlich wird Elektro traditionell in einem flüchtigen Lösungsmittel, das die Lebensfähigkeit des Proteins ²⁸ beeintrachtigt wird daher beibehalten Bioaktivität des Proteins berücksichtigt werden.

Dieser Ansatz befasst sich speziell die Kombination von mechanischen, topographische, chemische und Klebesignale, um eine abstimmbare Gerüst für periphere Nerven Wachstum zu schaffen. Gerüstmechanik genau gesteuert durch Synthetisierenmethacrylierten Hyaluronsäure (HA). Die Methacrylierung Websites verwendet werden, um reaktive Vernetzer Foto anhängen. Das vernetzte Material ist nicht mehr wasserlöslich und wird ausschließlich durch Enzyme ²⁹ gebrochen. Die Menge des Vernetzungs ändert die Abbaurate, Mechanik und anderen physikalischen Eigenschaften des Materials. Verwendung von HA mit 30% Methacrylierung, das einen Zugmodul von ca. 500 Pa hat, erzeugt ein weiches Substrat, das in der Nähe der Mutter Mechanik des Nervengewebe ist, und wird typischerweise durch Neuronen ^26,29 bevorzugt. Elektrospinning auf eine rotierende Spindel wird verwendet, um ausgerichteten Fasern für eine topographische Cue erstellen. Mit Elektro zusammen mit Mikrosphären bietet chemische Signale innerhalb des Gerüsts über längere Zeiträume. Um Neuritenwachstum Mikrokügelchen, die NGF verwendet werden, um das chemische Signal erzeugen unterstützen. Anders als die meisten elektro Materialien HA ist in Wasser löslich, so dass die NGF nicht aggressiven Lösungsmitteln bei der Produktion auftreten. Um eine Haft Signal hinzuzufügen, das SCAffold mit Fibronectin beschichtet ist. Das fertige System enthält alle vier oben beschriebenen Arten von Signalen: soft (mechanisch) ausgerichtet (topographische) Fasern mit NGF freiMikroSphären (chemischen) mit Fibronektin (Klebstoff) beschichtet. Herstellung und Prüfung des Systems wird in diesem Protokoll beschrieben.

Das Verfahren beginnt mit der Herstellung der Mikrokugeln mit einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion. Die Emulsion wird mit einem Tensid, Polyvinylalkohol (PVA) stabilisiert. Die innere Wasserphase enthält das Protein. Wie es zu der Ölphase zugegeben wird, die das in Dichlormethan (DCM) gelöst PLGA Schalenmaterial, erzeugt das Tensid eine Barriere zwischen den Phasen Schutz des Proteins aus der DCM. Diese Emulsion wird als in einem anderen Wasserphase PVA enthält, um die äußere Oberfläche der Mikrokügelchen zu schaffen dispergiert. Die stabile Emulsion wird gerührt, um das DCM verdampft. Nach dem Spülen und Gefriertrocknen Sie mit dem trockenen Mikro Fortsetzung gelassen werdenaining des Proteins.

Nachdem die Mikrosphären abgeschlossen werden, sind sie bereit, in Gerüste versponnen werden. Zuerst wird die Elektro Lösung herzustellen. Die Viskosität der Lösung ist wichtig, um die richtige Faserbildung. Lösungen von reinem HA diese Anforderung nicht zu erfüllen; PEO wird als Trägerpolymer zur Elektro ermöglichen zugegeben. Die Mikrokugeln werden in die Lösung und elektro was eine faserige Gerüst mit Mikrokugeln gleichmäßig verteilt zugegeben.

Sobald die Produktion abgeschlossen ist, sollte das Protein getestet werden, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen. Um dies zu tun, kann eine Primärzelle, die NGF reagiert werden. Dieses Protokoll verwendet Hinterwurzelganglien (DRG) 8-10 Tage alten Hühnerembryonen. Die Zellbündel werden auf das Gerüst Mikrosphären mit NGF oder diejenigen, die leer sind gefüllt ausgesät. Wenn die NGF noch lebensfähig ist, sollten Sie verbesserte Neuritenwachstum auf den NGF enthält Gerüste sehen. Wenn die NGF ist nicht mehr lebensfähig, es wirdNeuriten zu verlängern nicht fördern und sollte ähnlich der Steuerung angezeigt.

Das hierin beschriebene Verfahren wird genau auf neuronale Stütz konzentriert, jedoch mit einfachen Modifikationen der Material, Elektrospinnverfahren und Proteinen kann das System für unterschiedliche Zell-und Gewebetypen optimiert werden.

Protokoll

1. Wasser / Öl / Wasser-Doppelemulsion Microsphere Produktion

1. Erste Herstellung von 2% bzw. 0,5% w / v Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) in entionisiertem Wasser. Rühren Sie die Lösungen bei 50 ° C, bis klar ist, kann dies mehrere Stunden dauern. Eine Lösung aus 2% v / v Isopropylalkohol in entionisiertem Wasser.
2. Bereiten einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Proteins erwünscht. Die folgende Tabelle enthält Beispielformulierungen.

Tabelle 1:. Beispiel Proteinlösungen Die folgenden Proteinlösungen wurden erfolgreich gekapselt und elektro mit diesem Protokoll. Andere hydrophile Proteinlösungen können nach Bedarf verwendet werden.

3. Die 40 ml der 0,5% igen PVA-Lösung in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen.
4. In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen lösen 300 mg 65:35Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) in 3 ml Dichlormethan. Einem Vortex-Mischer können verwendet werden, um PLGA Auflösung zu beschleunigen.
5. Kombinieren Sie 200 ul der Proteinlösung und 4 ul 2% PVA-Lösung. Gießen Sie die Mischung in die Protein-PLGA-Lösung (Schritt 1.4). Die Lösungen werden meist getrennt bleiben.
6. Das Röhrchen wird in ein Becherglas mit Eiswasser. Mit Hilfe eines Ultraschallgeräts Zauberstab bei ~ 10 Watt (RMS), rühren Sie die Lösung für ein paar Sekunden (5-10), bis eine gleichmäßige Emulsion creme-weiß erstellt wird.
7. Gießen Sie die Emulsion in der 50-ml-Tube, die 0,5% PVA (Schritt 1.3). Mische die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für ungefähr 20 Sekunden. Die Lösung wird ein trübes Aussehen zu entwickeln.
8. Die Emulsion wird in einem 200 ml-Becherglas und auf einer Rührplatte bei 350 rpm für 2 min. 50 ml 2% Isopropylalkohol in das Becherglas auf der Rührplatte. Lassen Sie die Mischung weiterhin Rühren mindestens 1 Stunde auf dem DCM erlauben, zu verdampfen und das PLGA zu härten.
9. Transfer ter MICROSPHERE Lösung in Zentrifugenröhrchen.
10. Zentrifuge bei 425 xg für 3 min. Die Mikrosphären werden am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln und weiß erscheinen. Den Überstand vorsichtig aus dem Rohr, über den Mikrokügelchen, und speichern Sie in einem 500-ml-Flasche.
11. Spülen Sie die Mikrosphären mit VE-Wasser durch das Rohr füllt drei Viertel voll und schüttelte es, die Mikrokügelchen in der Flüssigkeit zu verteilen.
12. Wiederholen Sie die Schritte 1.10 & 1.11 viermal.
13. Nach dem letzten Spülgang, den Überstand wieder und in der 500 ml-Flasche mit den anderen Proben. Einfrieren der in dem Zentrifugenröhrchen gesammelt Mikrokugeln, dann für mindestens 24 Stunden lyophilisiert.
14. Visualisieren Sie die Mikrokugeln unter einem Lichtmikroskop oder mit einem Rasterelektronenmikroskop. Mikrosphären, die nicht größer als 60 um sind für eine effektive Elektro. Wenn Mikrokügelchen zu groß sind, können länger Beschallen oder Vortexen mal im Schritt 1.6 oder 1.7 benötigt.
15. Bewahren Sie die getrockneten Mikrokügelchen in einem -20 ° C Gefrierschrank.
16. Optional: Verwenden Sie ein Protein-Test, nach den Herstelleranweisungen, um die Menge an Protein in der 500-ml-Flasche von 1,10 Schritt ³⁰ zu testen. Dies wird verwendet, um den Prozentsatz an Protein in den Mikrokügelchen eingekapselt ist, die durch Subtrahieren der Menge der Lösung ab, was in der Produktion verwendet zu berechnen.

Hinweis: Um das Protein sichtbar zu Lage in der Mikro hinzuzufügen Rhodamin 2 ug / ml zu dem PLGA-Lösung ³¹ und kapseln einen FITC-konjugierten Proteins Figur 1 zeigt ein Beispiel..

2. Das Elektro mit Mikrosphären

1. Vor der Herstellung von Elektro Lösung, schaffen eine 0,5% w / v-Lösung des Photoinitiators in entionisiertem Wasser durch Lösen von 37 ° C. Dieser Prozess kann mehrere Stunden dauern.
2. Erstellen Sie eine 2% w / v methacrylierte Hyaluronsäure (Meha) (siehe Burdick et al. Zur Synthese) ^29, 3%w / v 900 kD Poly (ethylenoxid) (PEO) und 0,05% w / v Fotoinitiatorlösung in entionisiertem Wasser.
   1. Berechnen Sie die korrekte Menge von Meha und PEO für die gewünschte Lautstärke. B. 10 ml Lösung benötigt das Elektro 200 mg MEHA und 300 mg PEO.
   2. Auflösen des PEO in entionisiertem Wasser bei 90% des gewünschten Endvolumens (9 ml für dieses Beispiel). Dies kann mehrere Stunden dauern, können eine beheizte Platte rühren oder Wasserbad bei 37 ° C verwendet werden, um den Prozess zu beschleunigen.
   3. Nächstes fügen Sie den Meha und verwenden Sie einen Wirbelmischer auf der Lösung, bis klar rühren. Das dauert nur ein paar Minuten dauern.
   4. Schließlich fügen Sie die 0,5% Photoinitiator Lösung, um die restlichen 10% Volumen (1 ml für dieses Beispiel) zu füllen.
3. Fügen Mikrokugeln bei der gewünschten Konzentration bis zu 400 mg / ml. Mischen Sie die Lösung auf einem Vortex-Mischer, bis die Mikrokugeln gleichmäßig in der Lösung verteilt.
4. Die Lösung wird in einer Spritze und fügen Sie eine 6-Zoll-18-Gauge-blunt Spitze Nadel.
5. Legen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und legen Sie es auf 1,2 ml / h zu verzichten.
6. Kleben Sie eine Schicht Aluminiumfolie auf der Sammelplatte oder Dorn. Dies ermöglicht eine einfache Reinigung und Lagerung des fertigen Gerüst. Einen rotierenden Dorn verwendet wird, um ausgerichteten Fasern zu schaffen. Eine flache Platte oder stationären Dorn resultieren in zufällig angeordneten Fasern.
7. Schließen Sie das Erdungskabel von einer Hochspannungsquelle an die Auffangvorrichtung. Schließen Sie das Pluskabel an der Nadel.
8. Stellen Sie die Spritzenpumpe und Auffangfläche, so dass es 15 cm zwischen der Nadelspitze und Sammelfläche.
9. Starten Sie das Polymer Pumpen, wenn die Lösung am Ende der Spritze sichtbar ist, schalten Sie die Spannungsquelle und stellen Sie die Spannung auf 24 kV. VORSICHT: Sobald die Spannung eingeschaltet ist keine Metallteil des Systems berühren. Ladung kann auch springen kurzen Entfernungen von elektrifizierten Teile die Haut.
10. Führen Sie die Lösung bis desired Gerüstdicke erreicht ist. Wenn komplett auszuschalten Spannungsquelle und Spritzenpumpe.
11. Folie entfernen mit Gerüst befestigt. Abgeschlossen Gerüste Protein enthalten, werden in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert.

3. Protein Bioaktivität Testing

1. Vorbereitung der Zellkultur-Medien. Werden 10% v / v fötales Rinderserum, 1% v / v L-Glutamin und 1% v / v Penicillin-Streptomycin, um Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium.
2. Wählen Deckgläser, die vollständig in eine Well-Platte passen.
3. Verwenden 3 (Trimethoxysilyl) propyl-methacrylat, die Deckgläser zu behandeln, wie vom Hersteller beschrieben. Methacrylierung verbessert Gerüst Einhaltung der Deckgläser.
4. Bringen methacrylierte Deckgläser an den Sammelbereich der Electro mit abnehmbarem doppelseitiges Klebeband, bevor das Elektro. Spinnen auf die Deckgläser erleichtert Handhabung und Betrachtung.
5. Elektrospinnen, um die gewünschte Dicke, wie oben beschrieben.
6. EinN ach Elektro vorsichtig Deckgläser von Dorn. Legen Sie das Gerüst beschichtete Deckgläser in eine klare Stickstoffkammer und sicherzustellen, dass alle Sauerstoff gespült.
7. Legen Sie die Kammer und Gerüst unter 10 mW / cm ² 365-nm-Licht für 15 min. Nach der Vernetzung Ort in geeigneter Größe Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Gerüst nach oben zeigt.
8. Ort Gerüste unter einer keimtötenden Lampe 30 min sterilisiert. Falls gewünscht Fibronektin oder anderen Protein als eine Beschichtung verwendet, um die Zellhaftung zu verbessern. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zu beschichten Gerüste.
9. Ernte Hinterwurzelganglien (DRG), wie zuvor von Hollenbeck ³² beschrieben. Einer DRG für jeden Gerüst bedeckt Deck getestet benötigt.
10. Zeigen 100-200 ul Medium auf jedem Gerüst in der Well-Platte. Vorsichtig eine DRG auf jedem Gerüst in den Medien Tropfen. Für dicke Gerüst mehr Medien erforderlich sein; DRG müssen vollständig eingetaucht werden und nicht FLOAting.
11. Inkubieren des Gerüstes und DRG bei 37 ° C für 4 Stunden, damit die Zelle auf dem Gerüst haften.
12. Füllen Sie die Medien auf der geeigneten Ebene für das Wohl und legen Sie wieder in den Inkubator. Weiter Inkubation für 4-6 Tage.
13. Nach der Inkubationszeit vorsichtig die Medien von jedem gut und sanft einmal zu waschen mit PBS. Fix Zellen 30 min mit 4% w / v Paraformaldehyd.
14. Fleck-Zellen mit einem Antikörper-Färbung für Neurofilament. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuritenwachstum für die Quantifizierung. DAPI kann auch verwendet werden, um Zellkerne zu schauen. Ein Beispiel Färbungsprotokoll wurde von Sundararaghavan und Kollegen ¹⁴ beschrieben.
15. Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.
    1. Zeigen Well-Platte auf der Bühne des Mikroskops.
    2. Suchen Sie den Zellmasse mit Hilfe der Filter und Anregung Einstellungen für DAPI.
    3. Sobald die Zelle wechseln Sie den Filter auf FITC, um die erweiterten Neuriten zu visualisieren. Usingen die Stichfunktion am Mikroskop zu sammeln und kombinieren so viele Bilder wie nötig, um die gesamte Struktur zu sehen. Wiederholen Sie für DAPI, FITC und Hellfeld.

Ergebnisse

Mikrokugeln 50 ± 14 um im Durchmesser mit einer über 85% Protein Kapselung wurden konsequent produziert und elektro in Gerüsten. Größe wurde durch bildgebende Proben von Mikrosphären aus drei verschiedenen Produktionschargen bestimmt. Die Bilder, in denen auf einem optischen Mikroskop und Längen, wo gemessen mit handelsüblichen Labor-Software erfasst. Figur 1 zeigt ein Histogramm der Größenverteilung. Verkapselung Rate wurde ebenfalls aus drei separaten Mikrosphärenansätzen getestet, durch d...

Diskussion

Viele Studien haben gezeigt, dass Nervenzellen durch topographische Cues (Faserausrichtung) und chemische Signale (Wachstumsfaktoren) ^1,2,10,11,35 gerichtet werden. Elektro ist ein einfaches Verfahren, um Fasern ausgerichtet erstellen. Wachstumsfaktoren fördern Nervenwachstums aber, um sie in die Nervenleitungen (NC) gehören, wird ein Verfahren zur verzögerten Freisetzung erforderlich. Um ein robustes System mit beiden Signale zu erzeugen, sollten diese beiden Signale kombiniert werden. Mehrere Verfahren w...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313