Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Zusammenfassung

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zusammenfassung

In der Säugetier Cortex, Neuronen äußerst kompliziert Netzwerken und den Austausch von Informationen an den Synapsen. Veränderungen in der synaptischen Stärke, sowie Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, treten in einer Erfahrung abhängig und bietet die strukturelle Grundlage der neuronalen Plastizität. Wie postsynaptischen Komponenten der Synapsen in der Großhirnrinde werden dendritische Dornen als eine gute Proxy von Synapsen sein. Unter Vorteile der Mausgenetik und fluoreszierende Markierungstechniken, einzelne Neuronen und ihre synaptischen Strukturen im intakten Gehirn gekennzeichnet werden. Hier haben wir eine transkranielle Bildgebungsprotokoll einzuführen mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur fluoreszenzmarkierten postsynaptischen dendritischen Dornen im Laufe der Zeit in vivo zu folgen. Dieses Protokoll verwendet einen ausgedünnten Schädel Zubereitung, die den Schädel intakt hält und vermeidet inflammatorische Effekte durch die Exposition der Hirnhäute und die Rinde verursacht. Daher können Bilder sofort nach su erworben werdenrgery durchgeführt wird. Das experimentelle Verfahren kann wiederholt über verschiedene Zeitintervalle im Bereich von Stunden bis zu Jahren durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Zubereitung kann auch erweitert werden, um verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten sowie andere Zelltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, werden.

Einleitung

Die Säugetier Kortex beteiligt sich an zahlreichen Hirnfunktionen, von der Sinneswahrnehmung und Bewegungssteuerung, um abstrakte Informationsverarbeitung und Kognition. Verschiedene kortikaler Funktionen bauen auf verschiedenen neuronalen Schaltkreisen, die aus verschiedenen Arten von Neuronen, die Kommunikation und den Austausch von Informationen an einzelnen Synapsen gemacht. Die Struktur und Funktion der Synapsen werden kontinuierlich in Abhängigkeit von Erfahrungen und Pathologien modifiziert. In reifen Gehirn nimmt die Form der synaptischen Plastizität beider Stärke Veränderungen und Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, spielen eine wichtige Rolle in Bildung und Aufrechterhaltung eines funktionellen neuronalen Schaltkreisen. Dendriten sind die postsynaptischen Komponenten der Mehrzahl der Synapsen im Gehirn von Säugetieren. Die Konstante Umsatz-und morphologische Veränderungen von Stacheln dienen wahrscheinlich als ein guter Indikator für Veränderungen in der synaptischen Verbindungen ^1-7 dienen.

Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikropie bietet tiefe Penetration durch dicke, undurchsichtige Vorbereitungen und geringe Phototoxizität, die es für die Live-Darstellung im intakten Gehirn ⁸ geeignet ist. In Kombination mit Fluoreszenzmarkierung, bietet zwei-Photonen-Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug, um in das lebende Gehirn zu spähen und folgen strukturelle Reorganisation an einzelnen Synapsen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um Mäuse für Live-Imaging ^9-13 vorzubereiten. Hier beschreiben wir eine dünnten Schädel Herstellung von in vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung, um die strukturelle Plastizität der postsynaptischen dendritischen Dornen in der Maus Kortex zu untersuchen. Mit diesem Ansatz haben unsere jüngsten Studien ein dynamisches Bild von dendritischen Dorn sich in Reaktion auf motorischen Lern Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Tieren mit fluoreszenzmarkierten neuronalen Teilmengen und schnelle Entwicklung der in-vivo-Markierungstechniken dargestellt, können hier beschriebenen ähnliche Verfahren auch angewendet werden, Untersuchungen zute anderen Zelltypen und kortikalen Regionen, zusammen mit anderen Behandlungen, wie auch in Krankheitsmodellen ^16-23 verwendet.

Protokoll

Genehmigung braucht, um von zu Hause aus Institutionen vor Beginn der Operation und bildgebenden Studie gewonnen werden. In dieser Handschrift beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften von der University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.

1. Chirurgie

1. Autoklav alle chirurgischen Instrumenten und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Alkohol gründlich vor der Operation.
2. Anesthetize die Maus durch intraperitoneale (IP) Injektion von KX Anästhesielösung (200 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin) nach der Mauskörpergewicht. Hinweis: KX Dosierung kann je nach Stamm, Alter angepasst und Gesundheitsstatus der Mäuse. Veterinär Beratung, die optimale Dosis zu bestimmen ist ebenfalls empfehlenswert.
3. Führen Sie eine Zehe-Pinch-Test in regelmäßigen Abständen durch Drücken der Maus die Zehen und die Überprüfung für eine reflexive Reaktion auf die Anästhesie-Status überwachen.Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig vor Beginn der Operation betäubt. Hinweis: Bei längerer Imaging-Sitzungen, überprüfen Sie den Status der Anästhesie Maus regelmäßig, verwalten zusätzlichen KX wenn nötig.
4. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten.
5. Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einer Rasierklinge die Kopfhaut aus.
6. Sterilisieren Sie die rasierte Fläche durch Abwischen der Haut mit Alkohol-Pads und Wechsel betadine. Entfernen Sie alle Resthaarabschnitten.
7. Augensalbe, beide Augen zu schmieren vorsichtig anwenden, damit verhindert bleibende Schäden durch Austrocknung während des Experiments verursacht.
8. Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut, und bewegen Sie die Haut seitlich zu den Rändern des Schädels.
9. Entfernen Sie das Bindegewebe am Schädel befestigt.

2. Verdünnt Schädel-Vorbereitung

1. Identifizieren Sie den Abbildungsbereich auf Basis von ster. eotaxic Koordinaten Hinweis: Versuchen Sie, große Blutgefäße, die Blocklichteinfall zu vermeiden und verwischen die abgebildeten Strukturen. Gefäßsystem lässt sich am besten beobachten, wenn der Schädel ist feucht mit steriler Kochsalzlösung.
2. Verwenden Sie den High-Speed-Mikrobohrer dünne einem kreisförmigen Bereich von Schädel (0,5 bis 1,0 mm Durchmesser). Bewegen Sie den Bohrer parallel zur Schädeloberfläche, anstatt hielt es gegen den Schädel und nach unten drücken. Drill, bis sowohl die äußere kompakte Knochenschicht und der Mittel spongiösen Knochenschicht entfernt werden. Hinweis: Um Schäden durch Überhitzung zu vermeiden, sollten längeren Kontakt zwischen dem Bohrmeißel und dem Schädel.
3. Weiterhin Verdünnen des inneren kompakten Knochenschicht mit einer mikrochirurgischen Klinge in der Mitte der Drill verdünnten Bereich. Halten Sie die mikro Klinge in einem Winkel von etwa 45 ° um den Schädel ohne Niederdrücken gegen den Schädel, bis eine gleichmäßig verdünnte kleinen Bereich (200-300 &mgr; m Durchmesser) mit einer Dicke von ungefähr kratzenly 20-30 &mgr; m erhalten wird. . Aufgrund der Eigenfluoreszenz des Schädels, kann die Dicke durch Abtasten des Abstandes zwischen der oberen und unteren Oberfläche des Schädels unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop gemessen werden Hinweis: Obwohl ein Schädel Dicke von weniger als 20 um eine gute Bildqualität, es wird nicht empfohlen, weil es die Ausdünnungsprozess in nachfolgenden Re-Imaging-Sitzungen schwierig. Eine Überverdünnung zu verhindern, die Dicke des Schädels muß während der Operation periodisch überprüft werden (siehe Diskussion).

3. Immobilisierung

1. Knochentrümmer vorsichtig entfernen.
2. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an jeder Kante der Mittelöffnung der sterilen Kopfplatte, die seit autoklaviert hat (siehe Abbildung 1). Halten Sie die Kopfplatte fest gegen den Schädel mit dem verdünnten Bereich in der Mitte der Öffnung befindet Hinweis:. Wenn der Kleber verunreinigt die ausgedünnten region durch Unfall, entfernen Sie ihn vorsichtig mit der mikrochirurgischen Klinge.
3. Ziehen Sie die Haut von den Seiten des Schädels, um die Kanten der Mittelöffnung der Kopfplatte.
4. Warten Sie etwa 10 Minuten, bis die Kopfplatte ist gut mit dem Schädel befestigt.
5. Legen Sie die Kopfplatte auf zwei Seitenblöcke der Halteplatte und die Schrauben über die Kanten der Kopfplatte festziehen, um die Maus auf der Halteplatte zu immobilisieren (siehe Abbildung 1). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es keine Haut-oder Schnurrhaare zwischen die Kopfplatte und die Blöcke vor dem Anziehen der Schrauben. Eine gute Vorbereitung sollte immobilisierten keine beobachtbare Bewegung des Schädels unter dem Binokular zu zeigen, wenn der Rücken des Tieres streichelte sanft ist.
6. . Spülen ausgesetzt Schädel mit Kochsalzlösung, um nicht polymerisierte Klebstoff entfernen Hinweis: Es ist wichtig, um alle verbleibenden Klebstoff zu entfernen, wie nichtpolymerisierten Leim verwischt Bilder und Schäden Mikroskopobjektive <./ Li>

4. Imaging

1. Nehmen Sie ein Foto von dem Gefäßsystem des Schädels ausgesetzt mit der verdünnten Bereich als Karte ein, die verwendet wird, um die abgebildeten Region in den folgenden Imaging-Sitzungen zu verlegen (siehe Abbildung 2).
2. Platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop Bildgebung. Suchen Sie den verdünnten Bereich unter einem 10X Luftziel mit Epi-Fluoreszenz und bewegen Sie den dünnsten Bereich in den Mittelpunkt der Ansicht.
3. Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf der Oberseite des Schädels und wechseln Sie in das 60X Objektiv, das mit sterilem Wasser gespült wurde. Wählen Sie eine Region, wo einzelne dendritische Dornen sind klar entlang Dendriten visualisiert. Identifizieren und beschriften Sie die entsprechende Region auf der Karte 1 durch den Vergleich zwischen der Gefäß epifluoreszenten Ansicht und der Gefäß Foto.
4. Tune die Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge nach der Fluorophore. Zum Beispiel 920 nm für YFP; 890 nm für GFP; 1000 nm für DsRed und tdTomato ^24.
5. Erwerben Bildstapeln mit 2um Schritte auf Verwendung des 60X Ziel der z-Achse. Dieses Bild Stapel umfasst eine ca. 200 um x 200 um Bereich (512 x 512 Pixel) und wird als Karte 2 für die Verlagerung bei der anschließenden Imaging-Sitzungen verwendet wird (siehe Abbildung 2).
6. Erwerben neun Bildstapel in Karte 2 mit 3fach digitalem Zoom. Jeder Bildstapel umfasst eine Fläche von ungefähr 70 um x 70 um (512 x 512 Pixel), mit 0,7 &mgr; m Schritten längs der z-Achse. Hinweis: Die Intensität des Lasers sollte unter 40 mW, wenn an Proben gemessen, um Phototoxizität zu minimieren.

5. Rettung

1. Nach der Bebilderung, sanft lösen Sie die Kopfplatte aus dem Schädel.
2. Den Schädel und die Haut den ganzen restlichen Kleber entfernen, gründlich reinigen. Hinweis: Alle restlichen Kleber auf der Haut Reizungen verursachen und verlangsamen die Heilung der Haut, während der verbleibende Kleber auf dem Schädel wird die Erosion der Schädel und verursachen einengiogenesis in der neu gewachsenen Knochenschicht, so dass anschließende Umzug und Re-Imaging schwierig.
3. Spülen Sie den Schädel und die Haut mit Kochsalzlösung mehrmals.
4. Nähen Sie die Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Naht.
5. Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen in einem separaten Käfig. Verwalten Analgetikum Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan an postoperativen Schmerzen zu mildern. Bringen Sie das Tier zum eigenen Käfig nach vollständiger Genesung. Überwachen Sie die Tier eng (mindestens einmal täglich kontrollieren), bis der Schnitt verheilt und Nähte entfernt werden. Verwalten folgenden Injektionen von Buprenorphin analgetisch, wenn nötig.

6. Reimaging

1. Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,8.
2. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6
3. Suchen Sie zuvor abgebildeten Region durch den Vergleich der Gefäßmuster auf Karte 1 und die dendritische Verzweigungsmuster zu Karte 2.
4. Wenn Re-Imaging wird innerhalb von 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie Schritt 2.3, um die dünne Schicht der neu gewachsenen Knochen auf dem ausgedünnten wieder entfernenRegion mit Hilfe der mikrochirurgischen Klinge. Wenn Re-Imaging wird nach mehr als 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie die Schritte sowohl 2.2 und 2.3. Hinweis: Die neu gewachsenen Knochenschicht besteht aus einem weniger kondensierten Struktur im Vergleich zum ursprünglichen kompakte Knochenschicht, was zu einer reduzierten Bildqualität. Deshalb, um die gleiche Qualität zu erwerben, ist es notwendig, dünne Schädel etwas mehr als der bisherige Bildgebungssitzung.
5. Stellen Sie die Position und Ausrichtung zu Bildstapeln, die zuvor unter dem Bildstapel Zwei-Photonen-Mikroskop übereinstimmen erhalten.
6. Bilder zu erfassen, wie in Schritt 4.6.
7. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5 nach der Abbildung.

Ergebnisse

In YFP-H Linie Mäusen ²⁵ drückt gelb fluoreszierenden Proteins in einer Teilmenge der Schicht V pyramidalen Neuronen, die ihren apikalen Dendriten auf den oberflächlichen Schichten des Cortex projizieren. Durch den ausgedünnten Schädel Herstellung die fluoreszierend markierten dendritischen Segmente wiederholt unter Zwei-Photonen-Mikroskop über verschiedene Abbildungsintervalle abgebildet werden, im Bereich von Stunden bis Monaten. Hier zeigen wir ein Beispiel eines Vier-Zeitabbildung der gleichen Dendr...

Diskussion

Um eine erfolgreiche dünnten Schädel Präparat zu erhalten, sind mehrere Schritte in diesem Protokoll entscheidend. 1) Die Dicke des Schädels. Die Schädelknochen hat eine Sandwich-Struktur mit zwei Schichten aus kompaktem Knochen mit hoher Dichte und einer Mittelschicht aus Low-Density-spongiösen Knochen. Während der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer ist geeignet zum Entfernen der äußeren Schichten der kompakte Knochen und spongiösen Knochen, ist die mikrochirurgische Klinge ideal zum Verdünnen des inneren Schi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Bioniche Pharma	67457-034-10	Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	Mixed with ketamine for anesthesia
Saline	Hospira	0409-7983-09	0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades	Electron microscopy sciences	72000	Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads	Fisher Scientific	06-669-62	Sterile alcohol prep pads
Eye ointment	Henry Schein	102-9470	Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs	Fine Science Tools	19007-14	1.4 mm diameter
Microsurgical blade	Surgistar	6961	The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue	Fisher Scientific	NC9062131	Fix the head plate onto the skull
Suture	Havard Apparatus	510461	Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope	Olympus		SZ61
CCD camera	Infinity
Two-photon microscope	Prairie Technologies		Ultima IV
10X objective	Olympus		NA 0.30, air
60X objective	Olympus		NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser	Spectra-Physics		Mai Tai HP