Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Zusammenfassung

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Zusammenfassung

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Einleitung

The expression pattern of a specific gene is an important piece of information in determining the potential role for that gene in the development of a specific organ or cell type. Simply put, if it is not expressed at the right time and place it is unlikely to play a key role. In Xenopus, as in most early embryos, the most commonly used assay for detecting the expression of a gene is whole mount in situ hybridization using labeled antisense RNA probes. The use of antibody staining to assess expression of a gene in Xenopus is becoming more common as researchers discover antibodies, usually raised against mammalian proteins, that cross react to the Xenopus homologue or generate their own ^1-3. However, the vast majority of studies on Xenopus organogenesis still utilize antisense RNA probes. When antibodies are used, each individual antibody often requires optimization for the primary antibody concentration or fixation protocols. In contrast, the protocol for in situ hybridizations is essentially invariant for different probes. The basic concept is relatively simple and an excellent standard protocol has been well established ⁴. Our protocol is a streamlined version of the original protocol ⁴ that still provides excellent detection of gene expression patterns in the early embryo. The embryos are fixed and then prepared for hybridization by changing solutions and temperatures such that it allows for high stringency binding of the labeled antisense RNA probe to its target mRNA. The unbound probe is washed away and the embryos are then prepared for binding of an antibody against the label on the RNA probes. Excess antibody is then washed away and an enzymatic color reaction is used to localize where the RNA probe is bound in the embryo. There are now a number of Xenopus transgenic lines that drive expression of fluorescent proteins in specific tissues and these are available at the Xenopus stock centers such as the National Xenopus Resource in Woods Hole. While very useful for many experiments that require examining organogenesis in living embryos, this option requires separate housing for the transgenic lines.

In situ hybridization can clearly delineate where specific organs or cell types will form in the early embryo (Figure 1). The technique is remarkably sensitive given that one can detect gene expression in a small number of cells in a single embryo ⁵. However, in situ hybridization using the intensity of colorimetric staining is not considered quantifiable because the color reaction is not a linear one. Despite difficulty in quantifying staining intensity, changes in expression are often quite noticeable; particularly when the in situ hybridization shows quantifiable increases or decreases in the size of expression domains ^6,7.

The clear advantages of whole mount in situ hybridization make it a critical assay in the study of early development. However, it is a time consuming one that requires many steps over several days. This protocol is a simplified version of the standard protocol that eliminates several steps without reducing the quality of the in situ result. The simplification also eliminates sources of variability, making trouble shooting easier if an in situ hybridization is not optimal. Specifically, we have eliminated the use of proteinase K and RNAse treatments of the embryo, two steps that can depend on reagent quality and can also reduce signal intensity if overdone. The protocol also provides some degree of cost saving due to eliminating the use of several reagents. Finally, this protocol also provides some simple guidelines for improved capturing of images of in situ hybridization results. Although this protocol is optimized for work in Xenopus embryos, it is likely that at least some of the simplifications will be applicable to in situ hybridization work in other embryo systems.

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Protokoll

1. Embryo Vorbereitung

1. Wenn nicht routinemäßig als Teil des Embryokultur, de-Gelee Embryonen mit 2,5% Cystein, pH 8,0 vor der Fixierung ⁸ durchgeführt. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, ist es sinnvoll, dann manuell die Befruchtung Umschlag vor der Fixierung zu entfernen unter Verwendung einer feinen Pinzette.
   1. Verwenden Sie Glas Pasteurpipetten, um die Embryonen zu übertragen. Die Pipette ist nicht breit genug, um zu übertragen Embryonen so verwenden Sie ein Diamant-Stift, um die Glaspipette in einem Punkt weit genug, um holen einen Embryo zu schneiden. Beseitigen Sie die scharfen Kanten der Pipetten nach dem Schneiden durch die schnelle Weitergabe der Schnittspitze durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die scharfen Kanten schmelzen.
      HINWEIS: Es muss dafür genommen werden, da das Glas noch heiß genug ist, um Verbrennungen zu verursachen, auch wenn sie durch eine Sichtprüfung abgekühlt haben wird.
2. Führen Sie den Embryo Fixierung in Etappen. Zuerst bereiten Glasflaschen für den Einsatz in Embryo-Fixierung. Verwenden Sie diese Fläschchen für alle Schritte einschließlich der endgültigenLagerung. Verwenden Fläschchen, die klar mit einer guten Teflon-Dichtung im Deckel gibt, so dass für die Überwachung der Embryonen in allen Phasen des Prozesses. Beschriften Sie die Röhrchen mit entsprechenden experimentellen Daten mit Permanentmarker und dann bedecken Sie das Etikett mit durchsichtigem Klebeband, als auch Permanentmarker werden im Laufe des Verfahrens durch die Verwendung von Alkoholen und anderen Lösungsmitteln verloren.
   1. Verwenden Mempfa, um die Embryonen zu beheben. Einen Vorrat von 8% Paraformaldehyd in Chargen von 50-100 ml auf einmal. Verwenden etwa 75% des erforderlichen H ₂ O und Erhitzen auf 50-60 ° C, die notwendig ist, um das Paraformaldehyd in Lösung zu bekommen.
      ANMERKUNG: Diese Lösung ist etwas anders als die Memfa bei älteren veröffentlichten Protokoll-Versionen verwendet, daß es verwendet Paraformaldehyd anstelle Formaldehyd.
   2. 2-3 Tropfen 10 N NaOH oder bis der pH-Wert ca. 7,5 (Verwendung von pH-Papier einen pH-Wert zu überprüfen). Para ist sehr giftig, daher erzeugen die Stammlösung in einem Abzug. Sobald der paraFormaldehyd liegt in der Lösung, filtriert die Lösung durch Whatman-Papier in einem frischen Gefäß gegeben und mit H ₂ O auf ein Endvolumen. Falls erforderlich, speichern Sie die Paraformaldehydlösung bei 4 ° C für 1-2 Wochen.
   3. Montieren der übrigen Bestandteile des Mempfa Fixierungslösung (Tabelle 1). Dass in der endgültigen Arbeitskonzentration von Paraformaldehyd 4%. Bewahren Sie alle Komponenten der Fixierungslösung bei 4 ° C als Aktien.
   4. Mit einem Schnitt Glaspipette, fixieren die Embryonen aus der Addition der Embryonen an die markierten Glasfläschchen, die mit den etwa 3-4 ml Mempfa Lösung (Tabelle 1) gefüllt wurden. Vermeiden Befestigungs mehr als 20 bis 30 Embryonen pro Fläschchen. Hinzufügen der Embryos mit einem Minimum an Flüssigkeitstransfer vom Embryo Medium. Fix Embryonen Mempfa Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
   5. Bei verspäteter Endoderm Strukturen führen die in Situs manuell isoliert gut und Endoderm-Derivate ^9,10, Die für ein gutes Eindringen der Sonde ermöglicht und vermeidet auch Höhle Färbung.
   6. Speichern eine Lösung von 100% Methanol bei -20 ° C. Nach der Para Fixierung, ersetzen Sie die Mempfa Lösung mit etwa 4 ml der -20 ° C, 100% Methanol für die Lagerung der Embryonen.
   7. Verwirbeln die Fläschchen nach Zusatz des Methanols, um die Embryonen Kleben an der Glas oder anderen Embryos zu verhindern. Stellen Sie außerdem sicher die Fläschchen dicht geschlossen, weil das Methanol kann in den Gefrierschrank im Laufe der Zeit, wenn lose verdampfen.
      HINWEIS: Embryonen für mindestens ein Jahr gelagert werden, und wahrscheinlich länger, in dem Methanol vor ohne Verlust der in-situ-Hybridisierung Qualität der Färbung.

2. Sondenvorbereitung

1. Verwenden 1-2 ug der Ziel-DNA, die mit Digoxigenin markierten Sonden zu machen. Cut Plasmid, das das geeignete DNA-Sequenz am 5'-Ende des Gens von Interesse mit einem Restriktionsenzym für That-Vektor, um Antisense-Sonden erzeugen.
   ANMERKUNG: Das Plasmid sollte einen geeigneten RNA-Polymerase-Bindungsstelle (zB T7, T3 oder SP6) haben.
2. Lassen Sie die DNA, Wasser, NTP mischen und Polymerase-Puffer auf Raumtemperatur erwärmen, sie vor der Montage der Sonde Synthesereaktion. Die Komponenten des RNA-Synthesereaktion in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in der Reihenfolge, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Einstellen der Lautstärke der Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen des Sondensynthesereaktion auf 20 ul zu bringen. Bauen Sie die Reaktion bei Raumtemperatur, weil Komponenten des Polymerase-Puffer können die Matrizen-DNA, wenn sie in hohen Konzentrationen und Kalt auszufällen.
3. Die Transkription über 2 h bei 37 ° C.
   HINWEIS: Die Inkubation von etwas mehr als zwei Stunden, führt zu keinen negativen Auswirkungen, sondern auch zeigen, etwas erhöhte Ausbeute. Wenn für eine Stunde inkubiert, wird die Ausbeute reduziert, aber immer noch ausreichend, um eine gute Probe zu machen.
   1. Während des Wartens auf die Transkriptionsreaktion zu beenden, geben Sie ein Agarose-Gel, die verwendet werden, um die Qualität der Sonde zu testen wird. Schmelze 1 ug Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer (siehe Tabelle 1) durch Erhitzen der Lösung bis zum Siedepunkt. Entfernen Sie die Lösung von der Hitze, wenn die Agarosepulver vollständig gelöst hat.
   2. Add 2 ul Ethidiumbromid-Stammlösung (10 mg / ml) bis ungefähr 100 ml Agarose-Gel, wenn die Agarose wurde auf ca. 60 ° C abgekühlt, um die Visualisierung von RNA unter ultraviolettem (UV) Licht zu ermöglichen.
      Hinweis: Dieses Agarosegel Lösung kann in einem Inkubator von 60ºC gehalten, so dass zukünftige Gele können ohne erneute Schmelzen gegossen werden kann. Achten Sie beim Umgang mit Ethidiumbromid durch potentielle Toxizität.
4. 1 ul DNAseI (RNAse frei grade) zur Transkriptionsreaktion nach der 2-stündigen Inkubation und Inkubieren für weitere 10 min bei 37 ° C, um Matrizen-DNA zu eliminieren.
5. Entfernen 1 ul der Reaktionsmischung aufCheck auf 1% Agarose-TAE-Gel und dem Rest (20 ul) in 80 ul 1% SDS in TE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 ul 5 M NH ₄ Acetate, und 220 & mgr; kaltem Ethanol. Vortex die Mischung kräftig und zur Seite auf Eis gesetzt, bis die Ergebnisse der RNA Qualitätskontrolle bekannt.
   1. Führen Sie die 1 ul RNA vor der Fällung auf dem 1% Agarose-TAE-Gel entfernt. Um das Laden auf das Gel zu erleichtern, fügen Sie 4-5 ul Wasser und 1 ul der Standardladefarbstoff an die RNA. Sehen Sie sich die RNA auf dem Gel mit Hilfe eines UV-Licht-Transilluminator, um die Qualität der Sonde zu überprüfen (siehe Diskussion).
6. Man fällt die verbleibende RNA, die beiseite auf Eis in Schritt 2.5 durch Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei voller Geschwindigkeit für 10 bis 15 min eingestellt wurde. Beziehen Sie den Überstand mit einer Glaspipette herausgezogen und lassen kurz trocknen.
   1. Resuspendieren Fühler mit 1 ml RNA-Hybridisierungspuffer (Tabelle 1) in der Eppendorf-Röhrchen. Vortex und briefly erhitzen das Rohr auf 37 ° C und Wirbel wieder. Übertragen Sie die Sondenlösung auf eine 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen und füllen auf 7-10 ml mit RNA-Hybridisierungspuffer. Hinweis: Die Sonde kann weiter verdünnt werden (eine 10-fach weitere Verdünnung noch funktionieren kann) häufig zu geringe Hintergrundfärbung, aber die Reaktionen auch länger dauern.

3. In situ-Hybridisierung

1. Nimm die Embryonen, die -20 ° C Methanol gelagert wurden genommen und auf Raumtemperatur erwärmen. Führen Sie den gesamten Vorgang in den Glasfläschchen. Wenn verschiedene Embryonen aus einer Gruppe werden in Zukunft an die von verschiedenen Sonden betrachtet werden, halten sie in einem einzigen Fläschchen bis kurz vor die Sonden werden hinzugefügt, um die Variabilität und Arbeit am ersten Tag zu reduzieren.
   1. Rehydrieren der Embryonen durch eine Methanolreihe, wie in Tabelle 3 (siehe Tabelle 1 für Wasch Rezepturen) in Vorbereitung für das Hinzufügen der Sonde dargestellt. Leichte Kreisbewegungen ausführen embryos nach jeder Änderung, um sicherzustellen, sie werden nicht an den Wänden zu oder voneinander, und Rock die Embryonen durch die Montage der Ampullen auf einem Kolbenpendel. Bei der Übertragung der Flüssigkeiten, überprüfen Sie das Innere der Kappen zu gewährleisten, dass Embryonen nicht dort gefangen.
   2. Einmal in der Sondenlösung, hybridisieren die Embryos über Nacht, wie in Tabelle 3 beschrieben.
2. Nehmen Sie die Sondenlösung. Speichern Sie die verwendete Sonde durch Lagerung in einem 15 ml Schraubkappe Polystyrolröhrchen, mit Datum und wie oft die Sonde verwendet wurde markiert, bei -20 ° C.
   HINWEIS: Die gleiche Sonde kann viele Male für die nachfolgende in situ Hybridisierungen wiederverwendet werden, bis die kolorimetrischen Reaktionen beginnen, eine ungewöhnlich lange Zeit in Anspruch nehmen, um die gewünschte Intensität zu erreichen.
   1. Sobald die Sonde entfernt wird, bereiten die Embryonen für die Antikörperfärbung gegen die Sonde durch die Reihe von Waschvorgängen in der Tabelle 4 dargestellt. Ändern Sie die Temperatur nach Bedarf (Tabelle 4), indem Sie ter Kolbenpendel, mit Fläschchen von Embryonen angebracht, direkt in Hybridisierungs Öfen, die auf die entsprechende Temperatur eingestellt sind.
   2. Bilden das entsprechende Volumen des MAB + HTSS + BR + anti-Dig-Antikörper (Tabelle 4) zu der Zeit, daß die Embryonen in der MAB inkubiert + HTSS + BR Blockierungslösung, so dass der Antikörper vor der Zugabe zu dem blockierten Embryonen. Stellen Sie die Sperr Lösungen frisch am Tag der Nutzung.
3. Entfernen der Antikörperlösung und beginnen wäscht wie in Tabelle 5 nach Inkubation über Nacht mit Antikörper beschrieben. Führen mindestens zwölf 30minütigen Spülungen, um für die Färbung mit der alkalischen Phosphatase-Substrats herzustellen und reduzieren den Hintergrund, so viel wie möglich. Entweder MAB Puffer oder TBT-Lösung (Tabelle 1) für die Waschschritte.
   HINWEIS: TBT Lösung TTW die 2 mg hat / ml BSA zugegeben.
   1. Ersetzen Sie die letzte Waschlösung mit dem BM Lila alkalische Phosphatase-Substrat. Führen Sie die Färbung reaction entweder bei Raumtemperatur oder 37 ° C.
      HINWEIS: Die Färbung wird bei 37 ° C schneller, aber wenn über Nacht stehen gelassen, unannehmbare Hintergrundfärbung oft eine Folge sein. Die Färbung Reaktionen erfordert häufig über Nacht-Färbung und Raumtemperatur ist am sichersten für diese.
   2. Wenn weitere Färbung erforderlich ist und die BM purple Lösung nimmt eine blaue Farbe, ersetzen Sie die Farblösung mit frischen BM Lila und setzen Sie die Rohre in 37 ° C. Wenn die Ziel-mRNA ist sehr reichlich, legen Sie die Embryonen in der Färbelösung bei 4 ° C über Nacht und verschieben Sie die Embryonen auf Raumtemperatur oder 37 ° C, um eine bessere Überwachung der Farbreaktion zu ermöglichen.
   3. Günstige Mietwagen finden Reaktionen sorgfältig, da die Zeit, um endgültige Ergebnis variiert beträchtlich zwischen den verschiedenen Ziel-RNAs. Aus Gründen der Einheitlichkeit, stoppen Sie die Farbreaktion (siehe 3.4), wenn es keine neuen Seiten des Ausdrucks, die sich mit längeren Inkubationszeiten. Wichtig ist, dass, wenn in situ-Hybridisierung wird nach einer Untersuchung verwendetfür Experimente eine Betrachtung der verschiedenen Behandlungsgruppen, die gleiche Zeit für die Farbreaktionen zwischen Behandlung und Kontrolle Embryonen.
4. Stoppen Sie die Farbreaktion und Vorbereitung der Embryonen für die Lagerung und die Bildaufzeichnung, indem Sie die Flüssigkeiten, wie in Tabelle 6 dargestellt. Die Embryonen rocken Sie zu diesem Zeitpunkt nicht, weil die Entfernung von Flecken kann als lila Färbung des Methanols um die Embryos visualisiert werden.
   HINWEIS: Oft Embryonen haben eine leichte Blaufärbung von der Färbelösung und kaltem Methanol zumindest teilweise zu entfernen, dass, obwohl dies nicht ausreichend ist, um schwere Hintergrund oder Hohlraum Färbung zu entfernen. Kaltem Methanol bezieht sich auf Methanol, das in einem -20ºC Gefrierschrank gehalten wird.
   1. Rehydrieren die Embryonen und befestigen Sie den Fleck mit Mempfa (Tabelle 6). Einmal befestigt, entfernen Sie die Mempfa und waschen Sie die Embryonen mit 25% Methanol.
   2. Nehmen Sie die 25% Methanol und fügen Sie die Bleichlösung, wenn die Entfernung von endogenen Pigmenterforderlich. Achten Sie beim Umgang mit der Bleichlösung, wie es kann zu Verbrennungen führen. Beachten Sie die Bleich eng wie es geschieht relativ schnell, und die Bleichgrad für verschiedene Effekte (2) variiert werden.
   3. Dehydratisieren Embryonen durch eine Methanolreihe bis 100% Methanol für die Langzeitlagerung nach der Aufhellung oder übertragen zu PBS für die kurzzeitige Lagerung und nachfolgende Abbildungs ​​(siehe Tabelle 6).

4. Imaging Embryonen

1. Sobald ein Embryo hat die Färbung abgeschlossen, Bild der Embryo, so dass die Informationen darüber, wo das Gen von Interesse exprimiert wird für ein breiteres Publikum erobert. Verwenden Sie 1% Agarose als Hintergrund zu ungeklärten Embryonen zu sehen.
   HINWEIS: Die Agarose gibt einen blau / grauen Hintergrund, die gut mit dem Embryo und dem Blau des Farbreaktion kontrastiert. Es hilft auch, diffundieren störende Schatten und Reflexionen, die Aufmerksamkeit von der Embryo abzulenken.
   1. Fügen Agarose zu Wasser und dann zum Kochen bringen, bis die Agarose in Lösung und vor dem Einfüllen in die Petrischale abkühlen lassen 50. Wie bei der TAE-Gel-Lösung, speichern Sie die Agarose-Lösung in 55 ° C Inkubator für verschiedene Zwecke verwendet werden. Gießen der Agarose zu einer Tiefe von etwa 2 mm in die Petrischale. Falls erforderlich, stellen Sie die Tiefe von Agarose, ein wenig anders Schatten der Hintergrund ergeben.
   2. Nach der Rehydratisierung durch die Lagerung in Methanol zu einer wässrigen Lösung (PBS oder TTW), unter Verwendung eines Methanol-Reihe, legen die Embryos in einer Petrischale mit dem Agarose-Basis (siehe Tabelle 6). Bewahren Sie die Lösung sauber und, falls erforderlich, verwenden Sie einfache Filterung, um kleine Partikel, die den sauberen Hintergrund der guten Bilder stören können, zu beseitigen.
   3. Um die Bild die Embryonen aus alternative Ansichten, beispielsweise von der Bauchseite, schneiden dünne Kanäle in der Agarose, um den Embryo zu passen mit feinen Pinzette und legen Sie die Embryonen in die Kanäle, für Orientierung (Abbildung 3 ). Achten Sie darauf, in die Manipulation der Embryonen, da sie leicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Die meisten Stadien haben eine charakteristische Position, dass sie, wenn sie in Lösung gebracht zu übernehmen. Zum Beispiel neigen Blastula-Embryonen zu Tier Seite nach oben zu sitzen. Sobald die Embryonen beginnen zu verlängern, lagen sie auf ihrer Seite.
2. Verwenden des Faseroptik-Lichtquelle, um das Embryo aus einem flachen Winkel zu beleuchten, wodurch Schatten auf dem Embryo, der Tiefe, um das Bild und helfen erkennen Oberflächenstrukturen. Da Bleich kann Pigment, das nützlich Sehenswürdigkeiten bietet, zu beseitigen verwenden Shadowing für stark gebleicht Embryonen.
3. Deaktivieren der Embryonen zur Bildfärbung, die tief innerhalb des Embryos ist, wie im Notochord, Lunge oder Gehirnregionen, (Figur 4). Um dies zu erreichen, setzen Sie die Embryonen durch eine Methanol-Serie bis in 100% Methanol.
   1. Nach vollständigem Eintauchen in Methanol, Transfer der Embryonen zu einer Lösung aus einem Teil Benzylalkohol und zwei Teile Benzylnzoate (BABB). Die Embryonen werden zunächst auf der Oberfläche schwimmen, sondern als das Methanol vermischt sich mit dem BABB, werden sie in die BABB sinken. Führen Sie jeden Schritt den Umgang mit BABB in Glasfläschchen oder Gerichte; BABB wird jeden Kunststoff oder Lack zu schmelzen.
   2. Einmal gelöscht, zeigen Sie die Embryonen mit Durchlicht von unten kommend den Embryo. Stellen Sie die Intensität des Lichtes als auch die schräg von unten, um den Kontrast zu verbessern und die beste Farbe.
   3. Bei der Anzeige gelöscht Embryonen erhöhen die Glas-Petrischale aus der Basis. Tun Sie dies, indem Sie einfach mit zwei anderen Petrischale Deckel um sie zu erhöhen, so dass die Region der Schale mit Embryonen erhöht ist.
      HINWEIS: Dies hat den Vorteil der Einnahme des Basis unscharf und die Beseitigung der störenden Effekte von Fehlstellen oder Flecken auf dem Mikroskopbasis, die mit dem Bild stören können.

5. Doppelklicken Sie in situ Hybridisierung

1. Um gleichzeitig zu betrachten das Expressionsmuster von two verschiedener Gene in einem einzigen Embryo synthetisieren zwei Sonden, eine für jede der verschiedenen Gene. Synthetisieren einer Sonde mit DIG-11-UTP als Etikett wie oben beschrieben. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
   1. Synthetisieren die andere Sonde von Interesse mit dem gleichen Protokoll wie für DIG markiertem außer dass Fluorescein-12-UTP sondiert muss für DIG-11-UTP ersetzt werden. Verdünnen Sie das Produkt aus der Transkriptionsreaktion in RNA-Hybridisierungspuffer, um eine 3x konzentrierter Sonde ergeben als für einzelne in situ-Hybridisierungen verwendet.
   2. Mischen Sie die beiden konzentrierten Proben in einem Verhältnis 1: 1. Die besten Ergebnisse erzielen, verwenden Sie die fluoreszenzmarkierte Sonde für das Gen, das den stärksten Ausdruck in der einzigen in-situ-Hybridisierung Protokoll zeigt.
2. Verwenden Sie dasselbe in situ Hybridisierung Protokoll beschrieben für Einzel in situ </ Em> Hybridisierungen mit Ausnahme der doppelte Sonde (Sonde, die die 1,5-fach konzentrierten Mischung aus Digoxigenin-markierte und Fluorescein-markierten Sonden) am Ende des ersten Tages an Stelle eines einzigen in situ Hybridisierungssonde.
   1. Folgen der einzigen Hybridisierungsprotokoll am zweiten Tag des Doppel in situ Hybridisierungsprotokoll, mit der Ausnahme, Anti-Fluorescein-AP Fab-Fragmenten bei einer 1: 4.000-Verdünnung anstelle von Anti-DIG-AP Fab-Fragmenten. Waschen Sie die überschüssige Antikörper aus dem Embryo, wie im einzelnen in situ-Protokoll und die Durchführung der ersten Farbreaktion unter Verwendung des BM-Purpur AP-Substrat.
3. Nach der ersten Farbreaktion, inaktivieren die Fluorescein-Antikörper in 0,1 M Glycin, pH 2,0 für 40 Minuten, gefolgt von fünf zehn min Waschen in MAB. Blockieren Sie die Embryonen in MAB + HTSS + BR 90 min. Hinzufügen des Anti-DIG-Antikörper in einer 1: 2.000-Verdünnung in MAB + HTSS + BR und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht.
   1. Am folgenden Tag, waschen Sie die Embryonen thoroughly in MAB (12 Wäschen von 30 min), um den überschüssigen Antikörper zu entfernen.
   2. Waschen der Embryos für 10 min in AP-Puffer (Tabelle 1) und dann mit BCIP (0,5 mg / ml in AP-Puffer) zu färben.
      ANMERKUNG: Die in situ-Kombination sollte einen dunklen blau-violett-Färbung für die erste Farbreaktion und eine hellblaue Farbreaktion für die zweite (5) zu ergeben.
   3. Stoppen Sie die letzte Farbreaktion durch Entfernen der AP-Puffer und spülen dreimal mit MAB. Befestigen Sie die Embryonen mit Mempfa 10 min. Mit 5 schnelle Waschungen in MAB oder TBT waschen Embryonen.
   4. Mit dieser Farbkombination, ist die Verwendung von Methanol in den post Färbung Behandlungen nicht mehr möglich ist, da es die BCIP allein Farbe zu beseitigen. Speichern der Embryonen nach dem Färben und Fixieren in PBS mit 0,02% Natriumazid. Färbeintensität kann schwach mit Doppel in Situs sein. Wenn dies ein Problem ist, reduzieren die Wäschen auf vier, die jeweils 2 Stunden Dauer.

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Ergebnisse

Die Verwendung von gewebespezifischen Sonden können hervorragende Informationen in Bezug auf den Stand der Entwicklung für spezifische Organe bereitzustellen. In den folgenden Beispielen wird die Stufe des Embryos auf der Nieuwkoop und Faber Staging-Tabelle ¹¹ basieren. Wenn man Sonden Form Gene nach der Differenzierung zum Ausdruck, Troponin I in der ersten Stufe 28 bis 30, zum Beispiel (1C), die Anwesenheit oder die Größe eines differenzierten Organs verwendet, kann zu jedem Ze...

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Diskussion

Die Fähigkeit, in situ Hybridisierung verwendet werden, um die Expressionsmuster von spezifischen Genen sichtbar bleibt das am häufigsten verwendete Verfahren zur spezifischen Organen oder Zelltypen in Xenopus Embryo identifizieren. Dies ist wegen der verschiedenen Vorteile, die diese Technik bietet. Die Expression eines Gens spezifischen Strukturen und vor jedem histologischen Zeichen der Differenzierung zu identifizieren, wie die Hülle für Nkx2.5-Expression in den Herz Progenitoren vor e...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labguake Tube Shakers	VWR	17-08-2011
VWR Vials	VWR	10-07-2012
L-Cysteine	BioShop	CYS342.500
Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM	Roche	11277057001
Digoxigenin-11-UTP	Roche	11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)	Invitrogen	10777-019
T7 RNA Polymerase	Fermentas	EPO111
T3 RNA Polymerase	Fermentas	EPO101
SP6 RNA Polymerase	Fermentas	EPO131
Dnase 1	Invitrogen	18047-019
Sheep Serum	Wisent	31150
Blocking reagent	Roche	11096176001
BM purple Ap Substrate	Roche	11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments	Roche	11093274910
Methanol	VWR	CAMX0485-7
NaCl	BioShop	SOD002.10
SDS	EM	7910
EDTA	BioShop	EDT001.500
Tris	BioShop	TRS003.5
Tween-20	EM	9480
MgSO4	Sigma	M-2643
Mops	BioShop	MOP001.250
EGTA	Sigma	E-3889-25G
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.500
Formamide	VWR	CAFX0420-4
RNA	Roche	10109223001
Maleic Acid	VWR	CAMX0100-3
tri-Sodium Citrate	BioShop	CIT001
Hydrogen Peroxide (30% Solution)	EM	HX0635-2
BSA	BioShop	ALB001.100
PVP-40	ICN	195451
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10
Benzyl Alcohol	Sigma	B-1042
Benzyl Benzoate	Sigma	B-6630
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500