Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Zusammenfassung

Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine ​​exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.

Einleitung

Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren ^{1, 2} Retinsäure und Östrogene ^3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) ^4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch ^5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoreszenz Zebrafisch verlassen sich oft auf teure Spezialgeräte. High-Content-Screening sogenannte bietet den Vorteil hoher Auflösung, quantitative Bildgebung, aber auf Kosten der Verwendung von spezialisierten Plattenleser für die konfokale Mikroskopie ^7,8 ausgestattet. Das Ziel dieser Methode ist es, automatisch Assay gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonenin einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop. Gewebespezifische Fluoreszenz kann mit dieser Technik unterschieden werden und kann ein vernünftiger Ansatz für die Laboratorien, die den Zugang zu spezialisierten Plattenleser oder High-Content-Screening-Geräte fehlt sein.

In diesem Protokoll verwenden wir automatisierte Bildgebung von Gewebe-spezifischen Östrogen-Rezeptor (ER)-Agonisten in lebenden Zebrafisch nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) zu erfassen. Die transgene Linie Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 enthält 5 Tandem Östrogen-Response-Element-DNA-Sequenzen (ERE) stromaufwärts des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) ^3. In der Abwesenheit von Liganden, ERs sind normalerweise inaktiv. Ligandenbindung löst eine Konformationsänderung, wodurch Rezeptoren binden ERE DNA und regulieren die Transkription ^9. 5xERE: GFP Fische verwendet werden, um Substanzbibliotheken für ER-Modulatoren zu screenen und kann verwendet werden, um Umweltwasserproben für östrogene Verunreinigungen zu screenen.

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Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Zebrafisch-Zucht-und Ei-Sammlungen

1. Drei Tage vor Beginn der Einwirkung von Chemikalien, montieren Zuchtbecken mit Unterteilungen, getrennte Männer und Frauen. Füllen Sie jeden Tank zur Hälfte mit Wasser Aquakulturanlage. Mit einem Netz, übertragen Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 Fisch Zuchtbecken, indem zwei Männer und 3 Frauen in jedem Tank durch einen Teiler getrennt. Legen Sie einen Deckel auf jedem Behälter und Etikett mit Datum und Stämme gekreuzt werden.
2. Am folgenden Morgen, entfernen Sie alle Hindernisse und Neigungs verblüfft einen flachen Bereich an einem Ende der Zuchtbecken zu schaffen. Lassen Zebrafisch zu paaren, sammeln Embryonen im 10-Minuten-Intervallen, präzise Inszenierung Entwicklungs gewährleisten. Saubere Eier durch Spülen durch ein Teesieb mit E3B Medium und sanft bündig Embryonen in Petrischalen. Zurück erwachsenen Fischen zu dauerhaftenTanks.
3. Mit einem Binokular, sortieren, zählen, und entfernen Sie alle unbefruchtet, abnormale oder beschädigte Embryonen. Platz Embryonen in Petrischalen in E3B Medium und Haus bei 28,5 ° C mit einer 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Embryo Dichte Entwicklung beeinflussen. Legen nicht mehr als 100 Embryonen in einer 100 x 35 mm-Schale und nicht mehr als 50 Embryonen in einem 60 x 15 mm-Schale.
4. Nach 24 hpf, ersetzen Sie Medien mit E3B, die 200 uM 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU). PTU verhindert Pigmentbildung und hält Zebrafisch-Embryonen und Larven für eine verbesserte Bildqualität transparent. ACHTUNG: konzentriert PTU Lager ist gefährlich; Handschuhe tragen, wenn Sie E3B + PTU Lösung.
5. Am 1. Tag nach der Befruchtung (DPF), manuell das Chorion von jedem Embryo mit feinen Pinzette entfernen. Das Chorion nicht erscheint, um das Eindringen der Östrogene beeinflussen, jedoch die Entfernung verbessert die Bildklarheit. Es gibt keine Notwendigkeit, Chorion aus den Medien zu entfernen. HINWEIS: Als Alternative zur manuellen dechorionation, Chargen von Embryonen che werdenmisch dechorionated mit 1 mg / ml Pronase-Behandlung, wie zuvor beschrieben ^11.

2. Chemische Behandlung von Embryonen

1. Der Tag vor der Behandlung, die Stammlösungen jeder Chemikalie bei 1000-facher Konzentration in DMSO (oder geeigneten Lösungsmittel). Zum Beispiel, um Embryonen zu 10 uM Bisphenol A (BPA) ausgesetzt werden, bereiten eine 10 mM Stammlösung BPA in 100% DMSO. Dies sichert eine gleichmäßige DMSO-Konzentration in jeder Behandlung und ermöglicht eine ungiftige 1:1000 Verdünnung von DMSO als Vehikelkontrolle dienen. Shop-Stammlösungen bei -20 ° C Für dieses Protokoll, wird Embryonen bis 1 um und 10 um BPA, 18,5 nM und 1,85 &mgr; M Genistein, 367 nM Östradiol (positive Kontrolle) und Vehikel (0,1% DMSO, negative Kontrolle) ausgesetzt.
   VORSICHT: Chemikalien wie BPA und Östradiol sind gefährlich und können nachteilige Wirkungen auf den menschlichen Fötus. Griff endokrine Disruptoren mit Sorgfalt und verwenden Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung.
2. Am Tag der Behandlung, Tauwetter vorbereitet Lager chemische Lösungen. 1:1000 verdünnt durch Pipettieren von 1 ml E3B + PTU in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ul Lager chemische Lösung. Vortex kräftig. DMSO verdünnt 1:1000 in E3B + PTU als Fahrzeugkontrolle. Verwenden Sie 1 mL E3B + PTU in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen als unbehandelte Kontrolle.
3. Mit einer großen Bohrung Kunststoff Transferpipette, Transfer-Embryonen aus Petrischalen in jedes Well einer 96-Well-Platte, 3 Embryonen pro Well, 3 Wells pro Zustand. Verdunstung während längerer Behandlung zu verhindern, lassen Embryonen von äußeren Reihen und Spalten der Platte (Zeilen A und E, Spalten 1 und 12). Außenbrunnen mit 300 pl E3B + PTU gefüllt werden. Beschriften Sie die Platte Deckel entsprechend.
4. Entfernen Sie das Medium aus jedem Well mit einem spitzen, dünnen Kunststofftransferpipette. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen zu vermeiden, die Embryonen.
5. Geben Sie 200 ul der Behandlungslösung in entsprechende gut. Setzen Sie den Deckel underneath die Platte als Leitfaden für die Zugabe von Behandlungen in die richtigen Brunnen zu gewährleisten. Vortex jedes Rohr vor dem Pipettieren, um die Chemikalie in Lösung zu verteilen. Optisch bestätigen jeder Embryo ist in der Behandlungslösung. Wenn Embryonen sind auf der Seite der gut mit einem sauberen Transferpipette, um sie in den Brunnen mit der Behandlungslösung zu waschen.
6. Die Platte wird in den Brutschrank bei 28,5 ° C. Die Embryonen werden für die Fluoreszenz bei 72 hpf analysiert werden.

3. Mated Imaging von Embryonen in 96-Well-Platten

1. Betäuben Embryonen durch Zugabe von 10 ul von 4 mg / ml in jede Vertiefung Tricaine.
   HINWEIS: Anesthetize Embryonen vor der Bilderzeugung. Bei 24-96 hpf, Zebrafisch zeigen spontane Bewegung und eine Schreckreaktion auf die veränderte Lichtquelle während der Bildaufnahme. Anästhesie Embryonen reduziert Bewegung während der Bildgebung.
2. Legen Sie die 96-Well-Platte in der Motortisch und kalibrieren die Bühne. Mit Zeiss Zen Blau-2011-Software automatisch für die Mikroskopieauf und Kontrolle, wählen Sie den Probenträger Option und Multiwell-96. Wählen Sie Kalibrieren. Folgen Sie den schrittweisen Anweisungen auf die Bühne zu kalibrieren.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt deaktivieren Sie das Fliesen-Taste. Wenn die Fliesen-Taste deaktiviert ist, können Kalibrierungseinstellungen verloren gehen und die 96-Well-Platte muss neu kalibriert werden.
3. Mit einem 10-fach Objektiv und die Hell (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen entsprechend für BF-und GFP-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. Konzentrieren Sie sich auf einen einzigen Embryo und programmieren das Mikroskop bis 3 Gesamt Z-Profile, ein Bild um 50 oben und 50 um unter der aktuellen Brennebene zu erwerben.
   HINWEIS: Da die verschiedenen Gewebe besetzen unterschiedliche Brennebenen, wird dadurch sichergestellt, dass für jeden Zebrafisch-Bilder sind mit Herz und Leber im Fokus gefangen genommen.
4. Stellen Sie die Software-Parameter, um ein Bild mit Fliesen GFP und BF channe erwerbenls. Unter der Registerkarte Erwerb, wählen Sie Advanced Setup. Wählen Fliesen Regionen, dann Fliesen. Wählen Sie die Option Kreis auch.
   HINWEIS: Fliesen verwendet wird, um ein zusammengesetztes Bild von jeder Vertiefung zu schaffen. Ein einzelnes Feld-of-view erfasst nur einen kleinen Teil der Vertiefungen. Die Fliesen-Funktion kann automatisch zu erfassen mehrere benachbarte Felder-of-view aus jeder Vertiefung, wodurch ein zusammengesetztes Bild des gesamten gut. Es ist daher möglich, automatisch zu erfassen 96 zusammengesetzte Bilder pro Platte, wobei jede zusammengesetzte Bild enthält mehrere Dutzend Einzelbilder aus einem einzigen gut.
5. Wählen Träger und Füllfaktor 90%. Auswählen einen Füllfaktor von 90% werden zu erfassen mehrere Bilder der ausgewählten Vertiefungen, so dass 90% der Fläche von jeder Vertiefung in dem zusammengesetzten Bild sichtbar sein.
   HINWEIS: Bei der Auswahl der Füllfaktor wird ein Diagramm angezeigt werden, die den abzubildenden Bereich. Wählen Sie einen Prozentsatz, der den Bereich der gut umfassen wirddas ist für den Versuch geeignet.
6. Unter Optionen, wählen Sie die gewünschte Menge an Überschneidungen.
   HINWEIS: Beim Zusammennähen Fliesen für ein einzelnes repräsentatives Bild, eine Überdeckung von 5-10% ermöglicht eine glatte Naht zwischen den Bildern. Allerdings, wenn Stitching ist unnötig, mit einer Überlappung 0% wird Belichtungszeit zu reduzieren. Unter Verwendung von 90% Füllfaktor und 5% überlappen, ein zusammengesetztes Bild von einem einzigen Bohrloch besteht aus 59 Einzelbildern.
7. Starten Bildgebung. Das Mikroskop wird automatisch Bilder zu erwerben.
8. Manuell inspizieren zusammengesetzte Bilder von jeder Vertiefung zur gewebespezifischen Fluoreszenz (Abb. 1).
9. HINWEIS: Es ist am besten, mit der positiven Kontrolle beginnen, um zu bestätigen, dass die chemische Exposition vor Beobachtung experimentelle Behandlung Brunnen gearbeitet.

4. Manuelle Bildaufnahme von Embryonen in 96-Well-Platte

HINWEIS: Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie ein 20x Arbeitsabstand Ziel, acerfordern detaillierte Bilder manuell (Bild 2).

1. Mit einem 20x-Objektiv und das Hellfeld (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen für BF und GFP Kanäle richtig, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera.
2. Identifizieren einzelner Embryonen und die Aufnahmen manuell.
   HINWEIS: Wenn die Belichtungseinstellungen für die positive Kontrolle Embryo ausgewählt wurde, werden die Einstellungen nicht verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich der Fluoreszenzintensität jedes Bild unter einheitlichen Bedingungen erfasst.

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Ergebnisse

Fig. 1 zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Jedes zusammengesetzte Bild wird von 59 Einzelbildern mit 5% Bildüberlappung besteht. Beachten Sie, dass die Live-Zebrafisch sind zufällig in jedem gut orientiert, aber wir sind in der Lage, um die Fluoreszenz im Herzen von der Leber zu unterscheiden. Hell Bilder sind als Verweise auf Zebrafisch-Orientierung zu beurteilen und zu visualisieren, morphologische Veränderungen (1A und 1C). Automated Imaging mi...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alte...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water