In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Zusammenfassung

Unmodifizierten und hyperphosphoryliertem Tau-Proteine ​​wurden in zwei In-vitro-Aggregationstests verwendet, um die Hyperphosphorylierung abhängige schnell Aggregationskinetik offenbaren. Diese Assays ebnen den Weg für weitere Bildschirme für Verbindungen, die die Neigung von hyperphosphoryliertem Tau modulieren kann zur Bildung von Fibrillen, die das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit zugrunde bilden.

Zusammenfassung

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine von einer großen Sammlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Tauopathien bekannt. Die Quintessenz der zugrunde liegenden Pathologie Tauopathie um die Neurofibrillen, NFTs, in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia ^1-4. Die NFT Dichte korreliert mit kognitiver Beeinträchtigung ^3,5 und Verlust von Nervenzellen ^6. NFT enthält in erster Linie hyperphosphoryliertem Tau-Protein (im Folgenden als "p-tau" fortan genannt), die direkt oder gepaarten helikalen Filamenten (PHF) ^7,8 bildet. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein vermutlich axonalen Transport, die für neuronale Signalübertragung und den Handel ^9,10 ist zu erleichtern. Jedes tau Molekül 2-3 Phosphate im normalen Gehirn, sondern die Phosphoryl-Gehalt steigt um mehrere Falten in Tauopathie Patienten ^11. Mehrere Kinasen sind wahrscheinlich zu Tau-Hyperphosphorylierung beitragen einschließlich GSK3 & bgr; (Glykogensynthasekinase 3β) und CDK5 (cyclin-dehängig Kinase 5) ^12,13, aber der direkte Auslöser für die pathologischen Phosphorylierung weiter Ferne ^14. Abnormalen Phosphorylierung in oder in der Nähe der Mikrotubulus-Bindungsmotive distanziert tau vom Filament ^15, und bewirkt tau Fehllokalisierung zu der somatodendritischen Faches, p-tau oligomerisiert in gerader oder gepaarte helikale Filamente, die schließlich in NFT Einschlüsse polymerisieren kann. Die enge Verbindung zwischen Tau-Hyperphosphorylierung, NFT-Bildung und Neurodegeneration zu einer vorherrschenden Annahme, dass p-tau Tangles hervorrufen apoptotischen und andere zytotoxische Reaktionen, und damit ist die zugrunde liegende Ursache für Tauopathie Neurodegeneration ^16,17. Drogen-Bildschirme und frühen klinischen Tests, die auf dieser Prämisse wurden eingeleitet ^18. , Gibt es bei diesem Hypothese Herausforderungen ^19,20. Zum Beispiel Santacruz et al. Zeigten, dass die kognitiven Funktionen von transgenen Mäusen kann durch Unterdrücken der Expression eines mutierten verbessernhumanem tau, obwohl NFTs weiterhin von bestehenden tau Moleküle ²¹ bilden. In einem Drosophila Modell NFT wurde gezeigt, dass die toxische zytosolische Tau-Sequestrierung, die zugrunde liegenden Nervenzellen ^22,23 schützen. Offensichtlich ist die Pathogenese Rolle NFT, falls vorhanden, stark beeinflussen die Richtung Tauopathie Therapeutika Entwicklung.

In hohen Konzentrationen rekombinanten oder normale Gehirn tau Protein spontan, sondern langsam polymerisiert in ein PHF-ähnliche Struktur in vitro, wie durch die Bindung mehrerer β-Faltblatt bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffe, elektronenmikroskopischen und Lichtstreuungsspektroskopie ^24-27 angegeben. Hinzufügen von Heparin oder Arachidonsäure, eine reichliche Fettsäuren im menschlichen Gehirn, drastisch beschleunigt PHF-Bildung in tau isoform- und Induktor konzentrationsabhängigen Weise ^28-32. Interessanterweise hyperphosphoryliertem tau gereinigt von AD-Gehirnen oder vollständig in vitro Phosphorylierungsreaktionen a vorbereitetggregates schneller und effizienter ^26,33-35. Diese Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit der pathologischen Rolle von p-tau. Ein in vitro-System auf der Grundlage der Aggregation von p-tau kann somit als ein leistungsfähiges Werkzeug für AD Wirkstoff-Screening dienen.

Angesichts der engen Verbindung zwischen Tau-Aggregation und die fortschreitende Neurodegeneration von AD, sowie die letzten Fehler in der Medikamentenentwicklung zur Förderung der Aß-Plaques eine andere Taste histologische Marker der AD ^36-38, das Interesse an der Entdeckung Drogen, die steuern, Tau-Aggregation steigt. In der Tat, einige Gruppen haben bereits Drogen-Bildschirme mit unterschiedlichen Durch begonnen, mit In-vitro-Tau-Aggregation Reaktionen als primäre Assay. Eine Reihe von Chemikalien wurden als hemmend oder Umkehrung Aktivitäten auf Tau-Aggregation in vitro ^39-42 aufweisen. Allerdings werden alle aktuellen Tau-Aggregation Regler Bildschirme verwenden unmodifizierten tau, die den Schlüssel pathologischen Kennzeichen Phosphor vermisstlierung und hob eine Sorge um die Spezifität und Wirksamkeit der Verwendung dieser Verbindungen bei AD-Behandlung.

Eines der Haupthindernisse für die Entwicklung Aggregationsassays zur biochemischen Charakterisierung und AD Wirkstoff-Screening ist die Herstellung von ausreichenden Mengen des pathophysiologisch relevanten hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Verwendung des Zippers Assisted Catalysis System, in dem die 1N4R Isoform von tau und der GSK-3β-Kinase in E. coexprimiert coli als Leucin-Zipper-Fusionsproteine, haben wir diese Herausforderung zu meistern (. Sui et al, eingereicht; siehe Abbildung 1 für die Endprodukte von Tau und p-tau; siehe auch ⁴³ Vorab Massenspektrometrie Charakterisierung von p-tau). Aus einem Panel von für unterschiedliche Phosphorylierungsstellen von Tau neun Antikörper wurden positive Signale in acht Positionen gesehen (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden beschreiben wir, Protokolle und Besetzungen, die die Aggregation kinetische d unterscheiden kannifferences zwischen unmodifizierten tau und p-tau-Arten. Diese Assays wurden aus veröffentlichten Protokollen, die den Anstieg der Fluoreszenz von Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) auf Amyloid (tau Aggregate) Bindung ²⁶ gemessen modifiziert. In der ersten "Endgerät", keine Farbstoffansatz Aggregationsreaktionen werden zusammengebaut und in der Abwesenheit des Amyloid-Farbstoff inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird ein Aliquot jeder Reaktion entnommen und mit einem gleichen Volumen des ThT-haltigen Puffer gemischt, um eine Aggregation schalten und THT tau Aggregate binden. Fluoreszenz wird von einem IAP FluoroMax-2-Fluorometer gemessen. In der zweiten "mit Farbstoff" kontinuierliche Überwachung Assay ThT oder ThS in den Aggregationsreaktionen enthalten. Fluoreszenz kann kontinuierlich während des gesamten Experiments manuell oder unter Verwendung eines Mehrplatten-Lesegeräts gemessen werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen Test, der eine nahezu physiologische Konzentration von Tau und p-tau für die Aggregation in der kontinuierlichen Messung mo verwendetde. Die Wirkung der Phosphorylierung bleibt leicht nachweisbar. Im Folgenden werden wir Schritt-für-Schritt-Betrieb wird beschrieben, und zeigen repräsentative Ergebnisse dieser Tests. Diskussion über einige der Vor-und Nachteile der einzelnen Ansätze sowie potenzielle Wirkstoff-Screening-Anwendungen werden folgen.

In einer hohen Konzentration, aggregiert tau amyloidartigen Strukturen spontan. Jedoch im Labor tau Fibrillenbildung wird typischerweise durch solche Induktoren wie Heparin (mittleres Molekulargewicht 6000 g / mol) und Arachidonsäure beschleunigt. Beispiele hier gezeigten sind 30 uM Heparin. Die Bildung von Tau Amyloidaggregaten durch die Fluoreszenz von Amyloid-Bindung durch Thioflavin T (ThT) oder Thioflavin S (ThS) resultierenden überwacht. Nach Bindung an Tau-Aggregaten weist ThT eine Rotverschiebung der Fluoreszenz (Anregung: 450 nm; Spitzenemission: 485 nm). ThS andererseits eine schwache Emission bei 510 nm (Anregung bei 450 nm) vor Amyloid-Bindung, aber dies fluorescence steigt signifikant in Gegenwart eines Amyloid Protein wie das aggregierte tau ^44. Beide Farbstoffe funktionieren gut bei der Aufdeckung von Tau und p-Tau-Aggregation. Aufgrund des starken und relativ breite Emissionsspitze von ThT (siehe Abbildung 2), gibt es nur 30% ige Reduktion der Fluoreszenz-Einheit bei 510 nm. Der Bequemlichkeit halber verwenden wir die gleiche Kombination von Anregungs- / Emissionswellenlängen (das heißt, 450 nm / 510 nm), um Tau-Aggregation zu überwachen, wenn entweder Farbstoff.

Tau-Aggregation kann in Gegenwart oder Abwesenheit des Farbstoffs durchgeführt werden, abhängig von dem Zweck des Tests und Verfügbarkeit der Tau-Protein. Beide Arten der Reaktionen sind unten dargestellt. Darüber hinaus zeigen wir, den Betrieb von zwei verschiedenen Instrumenten - eine Einzelprobe Fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) und eine Multi-Plattenlesegerät (SpectraMax M2). Die Leser sollten in der Lage, diese Protokolle anzupassen, um ihre spezifischen Bedürfnisse und Verfügbarkeit Instrument zu entsprechen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Aggregationspuffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Lagern Sie bei RT, über Monate stabil. Supplement 1 mM Dithiothreitol (DTT) vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: a HEPES-basierten Puffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) erzeugt auch ähnliche Ergebnisse in Tau-Aggregation.
2. Bereiten Thioflavin T oder Thioflavin S-Stammlösung (3 mM, in Aggregationspuffer) und Filter von 0,22 um sterile Filtereinheit. Bei -20 ° C in einem Röhrchen mit Aluminiumfolie abgedeckt, über Monate stabil.
3. Bereiten Heparin-Stammlösung (300 & mgr; M in Aggregationspuffer). Lagerung bei -20 ° C, für Monate stabil.
4. Bereiten Dithiothreitol (DTT) Lager (1 M, gelöst in Wasser). Aliquot in 1,5-ml-Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C. Vor Aggregationstests, tauen die 1M Lösung bei RT. Von diesem 1,000x Lager, bereiten eine aliquote Menge von 100 mM Arbeits Lager mit VE-Wasser. Lassen Sie auf dem Eisbis bereit.
5. Entfernen tau von -80 ° C Tiefkühltruhe. Tauwetter auf Eis. Passen tau zu vorbestimmten Konzentration mit der Aggregationspuffer. In einer Mikrozentrifuge bei 20.800 × g für 10 min bei 4 ° C auf vorgeformte große Aggregate zu entfernen. Diese Pre-Spinnschritt erhöht die Konsistenz in der anschließenden Fluoreszenz-Messung von jeder Charge des Proteins prep. Den Überstand in ein anderes Röhrchen; lassen auf Eis, bis bereit, die Aggregationsreaktion zu montieren.

2. No-Farbstoff, Terminal Assay

HINWEIS: Der Aggregationsreaktion dieses Assays wird in Abwesenheit des fluoreszierenden Farbstoffs erfolgt. Nach dem Vermischen aller Komponenten wird das Reaktionsgemisch auf vorbestimmten Zeitpunkten fort. Aliquote werden dann aus der Aggregationsreaktion aufgenommen und mit ThT oder ThS für Amyloid Bindung vor Fluoreszenzmess gemischt. Das Anfangsvolumen der Aggregationsreaktion hängt von der Anzahl von Zeitpunkten benötigt. Dieser Ansatz kann require eine große Menge von Tau-Protein, aber schnell, einfach, und kann in einem Fluorometer oder einem Multiwell-Plattenleser (siehe Diskussion) erfolgen. Unten ist die Schritt-für-Schritt-Betrieb mit Hilfe der ISA SPEX FluoroMax-2 Kompakt Spektrofluorometer für Fluoreszenz Quantifizierung.

1. Einrichten des Aggregatmischung in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen, wie in Tabelle 1. Jede Säule repräsentiert die Zutaten für einen 100 & mgr; l-Reaktion, die für einen Zeitpunktmessung ausreichend ist notwendig. Stellen Sie die Anzahl für das Aggregations Mischung auf der Basis der Zeitpunkte für das jeweilige Experiment benötigt. Fügen Sie zusätzliche 10% der einzelnen Komponenten, um Platz für das Pipettieren Fehler geben. Die hier gezeigte typische Reaktion, die Heparin kann durch Arachidonsäure oder Aggregationspuffer ersetzt werden. Hinzufügen DTT 1 mM zu dem Reaktionsgemisch. Wenn die gesamte Reaktion dauert mehr als einen Tag, ergänzen frischem DTT Alltags (1 mM), um eine reduzierende Umgebung zu gewährleisten.
2. Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen. Place jede Reaktion in einem 37 ° C Brutschrank oder Wasserbad. Das Rühren wird für Tau-Aggregation notwendig.
3. Vor der Messung der Fluoreszenz, schalten Sie den Spektrofluorometer (Lampe, dann Computer).
   HINWEIS: Die Xenon-Bogenlampe, die sofort verwendet werden kann. Für die besten Ergebnisse lassen jedoch die Maschine zum Aufwärmen für etwa 10 Minuten vor dem Lesen Fluoreszenz.
4. Starten der Software auf dem Computer.
   1. Wählen Sie Echtzeit-Anzeige-Modus im Instrument Control Center eingestellt Anregungswellenlänge von 450 nm (Schlitz bis 2 nm) und Emissionswellenlänge auf 510 nm (Spalt bis 5 nm). Schließen Echtzeit Anzeigemodus-Fenster, um das Instrument Control Center zurückzukehren.
   2. Wählen Constant Wellenlänge Analyse, drücken Sie auf Hinzufügen >> Taste im oberen Rahmen auf Wellenlängen-Sets hinzuzufügen. Stellen Erfassungsparameter der Standardfehler um 1 und Maximum Trials bis 3, dann auf Hinzufügen. Klicken Sie auf Los! Um die Datenanzeige zu öffnenFenster.
   3. Im Datenanzeigefenster, klicken Sie auf Start, um das Dialog Acq Musterkiste Neu öffnen. Wählen Sie "unbekannt" für die Probentyp.
5. Zu jeder 100 ul Aggregation Mischung, fügen Sie 98 ul Aggregationspuffer und 2 ul 3 mM Thioflavin T. Pipettieren mehrmals, um zu mischen.
6. Übertragen Sie die gesamte Mischung in eine Küvette (FCA3, Außenabmessung, BxLxH = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten.
7. Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette.

3.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Probe mit SpectraMax M2 Plate Reader

Hinweis: Dieses Assay unterscheidet sich von der vorhergehenden dadurch, dass der fluoreszierende Farbstoff ThT oder ThS im aggrega enthaltention Reaktion. Dies ermöglicht eine kontinuierliche Messung der gleiche Satz von Reaktionen. Aufgrund der wiederholten Verwendung der Reaktion ist dieses Verfahren besser mit einem automatischen Multiwell Plattenlesegerät durchgeführt (wie nachfolgend den Betrieb SpectraMax M2 gezeigt). Eine regelmäßige Fluorometer funktioniert auch, aber die Häufigkeit der Messung des schnellen Aggregationsreaktionen etwas begrenzt ist, aufgrund der manuellen Natur des Vorgangs.

1. Richten Sie die Aggregation Mischung in einer 96-Well-Platte (96-Loch-schwarzen Festplatte, gut Volumen 360 ul, flacher Boden), wie in Tabelle 2. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine ausreichend ist erforderlich Zeit-Punkt-Messung. Gut mischen durch Pipettieren mehrmals. Ergänzen frischer 1 mM DTT jeden Tag im Verlauf der Experimente.
2. Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 37 ° C.
3. Zu jedem Zeitpunkt vor der Fluoreszenzmessung, schalten Sie den Multimode-Mikroplatten-Reader und den Computer ein. Lassen Sie ausreichend Zeit für die maschine zu stabilisieren, ca. 10 min.
4. Starten der Software auf dem Computer. Temperatur auf 37 ° C und wählen Fluoreszenzintensität (FI-Top Read) Modus eingestellt Anregungswellenlänge bei 450 nm und Emissionswellenlänge bei 510 nm.
5. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in die Schublade und drücken Sie die READ-Taste, um die Messung zu starten.
6. Nach der Lektüre, entfernen Sie die Platte aus und senden es zurück zu der 37 ° C-Inkubator. Kopieren Sie die Daten und fügen Sie ihn in eine Excel-Tabelle für die Datenanalyse und Plotten.

4.-Farbstoff, kontinuierliche Modus Assay auf einer Compact Spectrofluorometer

1. Richten Sie die Aggregation Mischung in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wie in Tabelle 3. Jede Spalte steht die Zutaten für eine 200 ul-Reaktion, die für eine Zeit-Punkt-Messung genug ist notwendig.
2. Das Röhrchen ein paar Mal, um zu mischen.
3. Schalten Sie die Spektrofluorometer und stellen Sie die Software wie in den Schritten 2.3 und 2.4.
4. Übertragen Sie die gesamte Mischung toa Küvetten. Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter in den Probenraum und den Deckel schließen. Klicken Sie auf Ausführen, um die Fluoreszenz-Daten zu sammeln. Notieren Sie die Daten.
5. Lesen in angemessenen Abständen, indem Sie auf Ausführen und Aufzeichnen der Daten auf Weiter. Wenn die Aggregation bei einer hohen Frequenz (beispielsweise alle 30 oder 60 Sekunden) überwacht werden soll, lassen die Reaktion in der Küvette und in der Maschine, bis entweder die Messung beendet ist, oder, wenn genügend Zeit vorhanden ist, um Reaktionen oder Küvetten vertauschen.
6. Entfernen Sie die Küvette und dekantiert die Lösung. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser 3-mal. Trocken durch Einblasen von Luft in und außerhalb der Küvette.

Ergebnisse

Unter Verwendung rekombinanter tau und p-tau (Abbildung 1), haben wir zwei verschiedene Protokolle, die Kinetik der Aggregation von Tau und p-tau zu vergleichen, unter Ausnutzung der starken Fluoreszenzemission ThT THS bei Bindung an amyloide Protein-Aggregate, einschließlich tau und p-tau (Abbildung 2). Mit oder ohne dem Fluoreszenzfarbstoff in der Aggregationsreaktion beobachteten wir konsequente Weiterentwicklung der Tau-Aggregation durch Hyperphosphorylierung (Figuren 3-5)....

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt unterschiedliche Assaybedingungen und Instrumente, die phosphorylierungsabhängige schnell tau Aggregationskinetik erkennen. Im Terminal Assay wird der Fluoreszenzfarbstoff ThT zu einem Teil der Reaktionsmischung aus dem Master zu jedem Zeitpunkt entfernt, hinzugefügt. Amyloid-bindende-induzierte Fluoreszenz wird gemessen ^26. In der zweiten, mit Farbstoff Modus Tau-Aggregation in Gegenwart von ThT oder ThS geführt, wodurch diese Art von Reaktion geeignet für automatischen Echtzeit-Be...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4 °C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80 °C