In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Belichtungsverfahren von Zellkulturen zu inhalierenden toxischen Chemikalien zeigen. Exposition der differenzierten Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Kulturen von Epithelzellen der Luftwege bietet eine einzigartige Modell von Atemwegs Exposition gegenüber toxischen Gasen, wie Chlor. In dieser Handschrift beschreiben wir Wirkung von Chlor-Exposition auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzkulturen von Epithelzellen und Tauchkultur der Herzmuskelzellen. In-vitro-Belichtungssysteme erlauben wichtige mechanistische Studien, um Wege, die dann genutzt werden, um neue therapeutische Mittel zu entwickeln beurteilen.

Zusammenfassung

Zellkulturen sind unverzichtbar für die Entwicklung und Studie die Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln, vor ihrem Einsatz in Tiermodellen. Wir haben die einzigartige Fähigkeit, gut differenzierten humanen Atemwegsepithel und Herzmuskelzellen zu modellieren. Dies könnte ein wertvolles Werkzeug, um die schädlichen Wirkungen toxischer inhalierten Chemikalien wie Chlor, die normalerweise mit der Zelloberfläche interagieren, und bilden verschiedene Nebenprodukte bei der Reaktion mit Wasser, und ihren Effekten in Submerskulturen zu studieren. Unser Modell mit gut differenzierten menschlichen Atemwege epithelialen Zellkulturen bei Luft-liqiuid Schnittstelle umgeht diese Beschränkung auf und bietet die Möglichkeit, kritische Mechanismen der Toxizität von möglichen giftigen Chemikalien inhalativen beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Verlust der Membranintegrität, Caspase Mitteilung und Tod auf toxische chemische inhalativen Exposition wie Chlor. In diesem Artikel schlagen wir Methoden, um Chlor Exposition in Säugetier-Herz und Atemwegsepithelzellen c modellierenEllen in Kultur und einfache Tests, um ihre Wirkung auf diese Zelltypen zu evaluieren.

Einleitung

Inhalativen Exposition gegenüber toxischen Chemikalien (TIC) / Gase wie Chlor (Cl ₂₎ bleibt eine laufende Gesundheitsproblem in zufälligen Positionen als auch in ihren möglichen Einsatz als chemische Bedrohung Mittel. Obwohl die Lunge das primäre Ziel sind Organe wie Herz und Gehirn betroffen ^1-3. In vivo-Modelle sind in der Regel für die Prüfung Toxizität von TIC verwendet, aber in vitro-Assays zur Beurteilung Toxizität sind einfacher, schneller und kostengünstiger. In vitro-Modellen auch für die umfangreiche Untersuchung von Mittel-Zell-Interaktionen, die schwer zu in vivo zu beurteilen sein kann zu ermöglichen. Wie in vitro-Belichtungssysteme sind selten und außerdem in einigen herkömmlichen Modellen, bei denen giftige Substanzen werden dem Kulturmedium der Zellen hinzugefügt taucht, die Eigenschaften der Mittel kann aufgrund von Wechselwirkungen und die Bindung an Komponenten in dem Medium ändern. In solchen Szenarien Zellkultursystemen, wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) Kulturen von primären humanen Epithelzellen der Atemwege, hier vorgeschlagen, die direkt in den gasförmigen Mittel ausgesetzt werden könnte vielversprechend.

Epithelzellen der Atemwege sind die ersten Verteidigungslinien gegen giftige Chemikalien eingeatmet. Der menschliche Luftwegsepithel bildet eine physikalische Barriere zwischen dem Lumen und den darunterliegenden Zellen in der Lunge und nimmt an der Reaktion der Lunge. Es produziert eine Anzahl von Cytokinen und anderen pro-und anti-inflammatorische Mittel sowie Schleim sekretiert / Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL), die das Epithel. Eine der Einschränkungen bei herkömmlichen in vitro-Kultursystemen untergetaucht ist auch, dass die ASL und Schleim, die Epitheloberfläche Abdeckung entfernt oder verdünnt. Dies entspricht nicht den physiologischen Zustand der Lungen Epithelzellen, die der Luft ausgesetzt sind. Daher sollte ein ideales in vitro-System für die TIC Toxizität dieser Architektur repliziert werden. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung schnelle Screening methoden, die in vivo-Toxizität vorherzusagen. Epithelzellen an der ALI gewachsen zu differenzieren und haben gut differenzierten Strukturen und Funktionen im Vergleich zu Zellen gewachsen untergetaucht und servieren ein überlegenes Modell der Atemwege.

In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz von Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kultur der Menschenatemwege (tracheobronchiale) Epithelzellen zum Testen eingeatmeten Giftgastoxizität und vergleichen Sie sie mit einem untergetauchten Zellkultur von Kardiomyozyten, damit das Studium ein weiteres wichtiges Ziel der Toxizität.

Protokoll

1. Rat Cardiomyocyte Kulturen

1. Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss genehmigt IACUC durchgeführt.
2. Erhalten Rattenherzmuskelzellen aus den Herzen (Ventrikel) der männlichen Ratten (240-260 g) unter Verwendung zuvor ⁴ beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, Tiere anästhesiert unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (100 mg / kg; bestätigen Anästhesie durch Zehenklemmverfahren) und dann Herzen in 10,0 ml, 1 mM Ca ^{2 +} enthält, Krebs-Ringer-Puffer, pH 7,4, zu entfernen.
3. Spülen Sie die Herzen 5-6x, um Blut zu entfernen und dann wechseln Sie zu einem Ca ^{2 +-freien} Krebs-Ringer-Puffer mit 0,02% und 0,06% Protease Kollagenase A (5,0 ml / Herz). Die Herzen in dieser Lösung für 10-15 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Schütteln.
4. Nach 10-15 min, waschen die enzymatische Lösung mit Ca ^{2 +-freien} Krebs-Ringer-Puffer für weitere 5 min. Lassen Sie die Zellen aus dem Gewebe schlaff unsten eine 25-ml-Pipette durch Pipettieren der Suspension nach oben und unten mehrmals.
5. Trennen Sie die Zellen von Gewebe durch Filtrieren durch eine 70 um Nylon-Mesh und es ihnen ermöglichen, in Krebs-Ringer-Puffer mit 0,1 mM Ca ^{2 +} zu begleichen. Aussetzung des Zellpellets in 1,0 ml Krebs-Ringer-Puffer, enthaltend 0,2 mM Ca ^{2 +.}
6. Vorsichtig Schicht über 5,0 ml 60 ug / ml Rinderserumalbumin, BSA, in 15 ml Zentrifugenröhrchen, zu Kardiomyozyten aus nonmyocytes trennen und es ihnen ermöglichen, für 30 Minuten absetzen. Die Herzmuskelzellen sind schwerer und bewegen sich auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand Zellen und Medien. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um weiter zu reinigen, die Zellen.
7. Schrittweise Übergang durch Waschen (in den Schritten unter Verwendung von 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM und 1,0 mM Ca ^{2 +-haltigen} Puffer) die ventrikulären Myocyten / Kardiomyozyten bis 1,0 mM Ca ^{2 +-haltigen} Puffer und ACCT Medium, bestehend aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium resuspendiert , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-Carnitin, 5 mM Kreatin, 5 mM Taurin, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
8. Platte der Kardiomyozyten in ACCT Medium in einer Dichte von 100 bis 150 Zellen / mm ² auf 100 mm oder 35 mm Laminin beschichteten Kunststoffkulturschalen oder 40 x 22 mm Deckgläschen mit Laminin (1 ug / cm ²⁾ schwemmt. Nach 1 Stunde, waschen das Geschirr mit 2,0 ml ACCT zu Zellen, die nicht gebunden sind, zu entfernen. In 10,0 ml frisches Medium und Inkubation der Zellen.

2. Differenzierte Air-Liquid-Interface (ALI) Kultur der Menschen Airway Epithelial Cells Basal

1. Procure menschlichen Geweben tracheobronchiale von National Disease Research Interchange unter Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Zellernte und durchzuführen, Kultur mit einem veröffentlichten Verfahren ^5,6. Dieses Verfahren verwendet Zellkulturen, wie sie sind ein präzises Modell für den menschlichen Einatmung von TIC jedoch, wenn nötig kann man isolieren und zu wachsen ALI mozu verwenden und / oder Ratte Epithelzellen der Atemwege ^7,8.
2. Kurz gesagt, stellen kleine Stücke (~ ¼ Inch) des Gewebes nach dem Entfernen aller Bindegewebe und Lymphknoten. Mehrmals in Ringer-Laktat-Lösung waschen Gewebe. Hinzufügen Gewebe zu einer 50 ml konischen Röhrchen und fügen Protease-Lösung (1% Protease/0.01% DNase in Minimalmedium, MEM, Gewebe Fluidverhältnis (1:10)).
3. Rock the Gewebe bei 4 ° C über Nacht. Enden die Dissoziation des Gewebes durch Zugabe von 10% fötalem Rinderserum. Kratzen die Epitheloberfläche mit einem chirurgischen Skalpell und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation (2.000 Upm für 10 min).
4. Platten Zellen bei Passage auf einem kollagenbeschichteten snapwells in speziellen ALI Medium hergestellt, wie ausführlich von Fulcher et al ⁹ beschrieben. Kultur für 5 Tage vor dem Wechsel zum Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) durch Entfernen apikalen Medium.
5. Füttern Sie die Zellen mit ALI Medien jeden zweiten Tag und damit die Zellen für weitere 2-3 Wochen (zu unterscheidenbevor Expositionen beobachten zahlreiche Schläge Cilien und Schleim Sekretion). Waschen Sie die apikale Oberfläche mit warmem PBS zusammen mit Medienwechsel.

3. Chlor Belichtungs

1. Enthält die Chlor-Belichtungssystem (CES) in einem qualifizierten chemischen Abzugshaube mit einer Betriebsgeschwindigkeit von 100 Gesicht fpm, die die notwendige Auffang Exposition von Personal im Falle des zufälligen Chlor Lecks zu verhindern bietet.
2. Betreiben Sie das System unter leichten Überdruck (0,5 Zoll Wasser). Trockene Luft bei 15 L / min und einem angemessenen Niveau von Chlor zugeführt wird, um die gewünschte endgültige Chlorkonzentration zu erreichen zugeführt. Die Kammern haben einen Verschlussdeckel mit 4 Mini-BCU Schleusen und einem niedrigen Härtegrad Silikondichtung, um den Druck Dichtung zu schaffen.
3. Geben Sie sich die Cl _2-Gemisch durch einen Massendurchflussregler. Die CES verwendet eine Druckgasflasche, die 1,0% Cl ₂ in trockenem Stickstoff.
4. Regulieren Sie den Luftstrom mit Hilfe der Verdünnungkundenspezifische Systemsteuerung und ähnlich regeln die Cl _{2-Konzentration} in den Expositionskammern geliefert. Ein geringes Volumen Probenahmepumpe zieht die Abgase aus den Kammern in eine Chlor-Analysator zu Konzentrationen, die dann auf einem Datenlogger an den Analysator angeschlossen aufgezeichnet werden, zu überwachen.
5. Messen Sie die Durchflussmengen in den Kammern vor der Belichtung mit einem Durchflussmesser gleich und Abgasraten zu gewährleisten.
6. Bereiten Sie die Zellkulturen für die Exposition durch Entfernen der überstehenden Medien und Zugabe von frischem Medium (basolateralen Medien in ALI-Kulturen). Alle Vorbehandlungen mit Agenten konnte zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden.
7. Expose die ALI Kulturen der Epithelzellen der Atemwege zu Cl _2-Gas (50, 100 oder 300 ppm für 30 Minuten) in den beiden verschlossenen Polysulfon biocontainment Kammern. Die Herzmuskelzellen (untergetaucht oder konfluenten Kulturen auf Membranen) auf 50 oder 100 ppm Cl ₂ für 15 Minuten ausgesetzt.
8. Nach der Belichtung bündig die Kammern mit Luft, bis das Cl ₂ Stand unter 1 ppm und sicher geöffnet werden, um Zellen (innerhalb von 5 min) zu entfernen.

4. Transepitheliale Elektrischer Widerstand (TER) Mess

1. Messen Sie die TER der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, ALI, Kulturen mit einem epithelialen voltohmmeter mit einem Paar von Silberchlorid "Stäbchen"-Elektroden.
2. Äquilibrieren Sie die Essstäbchen Elektrode in der ALI Medien 15 min vor dem Gebrauch.
3. In warmen Medien zur apikalen (1,0 ml) und basolateralen (2,0 ml) und messen Sie die Oberfläche mit den Ess-Stäbchen TER Elektroden der voltohmmeter.
4. Tauchen Sie den kürzeren Arm der Elektrode in apikalen Medien und den längeren Arm in den basolateralen Medien. Klicken Sie auf die "Maßnahme"-Taste auf der voltohmmeter, den elektrischen Widerstand zu beurteilen.
5. Die voltohmmeter hat die Möglichkeit, Ohm oder k Ohm messen. Subtrahieren den Widerstand über einem zellfreien Kulturträger aus dem Widerstand über jede Zelle gemessen Schicht trans zu ergebenepithelialen Widerstand (TER).

5. Caspase Mess

1. Add frischen ALI Medien (2,0 ml) zur basolateralen Oberfläche nach der Belichtung und Inkubation der Zelle bei Raumtemperatur. Sammeln Stand Medien bei 4 und 24 Stunden.
2. Messen Sie Caspase 3/7 Aktivität in den Medienüberständen mit Hilfe eines kommerziellen Caspase 3/7 Assay-Kit.

6. Western Blot und Immunzytochemie

1. Führen Western Blots mit Zelllysaten wie zuvor beschrieben ^10. Hängen Sie das Proteinlysat (20 ug) in 5x Probenpuffer reduziert und kochen für 5 min. Betreff des Proteinlysat SDS-PAGE (4-15%) und die Übertragung der getrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran durch elektrophoretische Blot.
2. Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Membran mit 5% Milch in Waschpuffer (PBS + 0,1% Detergens) und die Sonde die Membranen mit primärem Antikörper gegen Actin SERCA2 oder sarcomeric bei 1:1000 Verdünnung, über Nacht bei 4 ° C. Weiter, waschen und Inkubation mit den jeweiligen Membranen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu entwickeln und für den Nachweis nach wie vor mit handelsüblichen ^{10-Peroxidase-Nachweis-Kit} beschrieben.
3. Für Immunzytochemie Behandlung lebenden Zellen auf Einlagen oder Deckgläschen in 6-Well-Platten für 20 min nach dem Spülen mit PBS mit 0,4% gewachsen Triton-X-100 in 10 mM Natriumcitrat-Puffer.
4. Block unspezifische Bindung durch Behandlung der Zellen mit 5% Eselserum für 20 min inkubiert und dann die Zellen mit nicht-spezifischen IgG oder einzelne primäre Antikörper spezifisch sarcomeric Actin oder Ki-67.
5. Waschen der Zellen mit PBS und Inkubation mit Fluoreszenz-konjugierte sekundäre Antikörper an den primären Antikörper und einem Nuklearfarbstoff (1 &mgr; g / ml DAPI) zu erfassen.
6. Mit PBS waschen und montieren Deckgläser mit handelsüblichen Montage Medien.
7. Visualisieren Sie die Färbung mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Primäre stabförmigen Kardiomyozyten befestigen auf Laminin Matrizen und zu verbreiten und differenzieren sich in konfluenten Kulturen (Abbildung 1A und seinen Kasten). Diese Zellen wurden weiter auf der Grundlage des sarko Aktin und SERCA2 Ausdruck (Fig. 1B und 1C) gekennzeichnet. Kardiomyozyten sind sehr anfällig für Chlor Toxizität als 15 min Einwirkung von 100 ppm Chlor verursachte umfangreiche Zellabrundung und Tod in Submerskulturen und Störungen der konfluen...

Diskussion

Die häufigste Form der akuten toxischen Expositionen tritt auf, wenn man eine giftige Chemikalie in die Lunge atmet. Diese Chemikalien können auch schnell in den Blutkreislauf aufgenommen werden und andere Organe wie Herz und Gehirn beeinflussen. Giftigkeit beim Einatmen von verschiedenen Agenten mit Hilfe von Tiermodellen untersucht und darüber berichtet, aber die Mechanismen sind weniger gut verstanden. Dies ist eine große Hürde bei der Entwicklung wirksamer Therapien. Das Fehlen von in-vitro-Belichtungssyste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
Caspase 3/7 kit	Promega	G8091
Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode	World Precision Instruments	EVOM and STX2
Snapwell inserts	Corning	07-200-708
70 micron nylon cell strainer	Corning	#352360
Polysulfone biocontainment chambers	BCU, Allentown Cage Equipment	BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Sarcomeric actin antibody	Abcam Cambridge, MA	ab28052
SERCA2 antibody	Affinity Bioreagents, Golden, CO	MA3-9191
Ki-67 antibody	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Alexa 488-conjugated secondary antibody	Invitrogen, Grand Island, NY	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Carnitine	Sigma-Aldrich	C0283
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
Creatinine	Sigma-Aldrich	C6257
Krebs Ringer Buffer	Sigma-Aldrich	K4002
Protease	Sigma-Aldrich	P5147
Collagenase	Sigma-Aldrich	C6885
DNAase	Sigma-Aldrich	DN-25
Lactated Ringer solution	Abott Laboratories	7953
Donkey serum	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% SDS-PAGE gels	Bio-Rad	456-1083
Nitrocellulose membrane	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Peroxidase detection kit	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting media, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497
Collagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD biosciences	354259
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ