SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Zusammenfassung

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

Zusammenfassung

SIVQ-LCM ist eine neue Methode, die automatisiert und rationalisiert die traditionelle, benutzerabhängige Laser Dissektion Prozess. Es zielt darauf ab, eine fortschrittliche, schnell anpassbar Laser Dissektion Plattform-Technologie erstellen. In diesem Bericht beschreiben wir die Integration der Bildanalyse-Software ortsinvariantem Vektor Quantisierung (SIVQ) auf die ArcturusXT Instrument. Die ArcturusXT System enthält sowohl eine Infrarot-(IR) und Ultraviolett-(UV) Laser, so dass für bestimmte Zelle oder große Fläche Dissektionen. Das Hauptziel ist es, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Laser-Dissektion, Probendurchsatz zu erhöhen verbessern. Dieser neue Ansatz ermöglicht Mikrodissektion von tierischen und menschlichen Geweben in der Forschung und der klinischen Arbeitsabläufe.

Einleitung

Ursprünglich in der Mitte der 1990er Jahre entwickelt, die Laser Mikrodissektion (LCM) ermöglicht dem Benutzer, genau zu erfassen spezifische Zellen oder Zellbereiche von einem histologischen Gewebeschnitt mittels mikroskopischer Visualisierung ^{1, 2.} Viele Studien, die molekulare Analyse von LCM gegen Kratzer Gewebe veranschaulichen den Wert der Methode ^12.3. Darüber hinaus gibt es drei Videoprotokoll Veröffentlichungen über die Technologie, die für die Anzeige von ^{13, 14} verfügbar sind. Doch trotz seiner bewährten Wert, LCM kann langwierig und mühsam sein, wenn das Ziel von Interesse ist eine verteilte Zellpopulation in einer heterogenen Gewebeschnitt, oder wenn eine große Anzahl von Zellen sind für bestimmte Downstream-Anwendungen wie Proteomics erforderlich. Die Belastung für den menschlichen Bediener platziert führte uns zu einer halbautomatischen Präparation Ansatz für LCM durch die Kombination eines leistungsfähigen Bildanalyse-Algorithmus, um die LCM-Verfahren ¹⁵ führen zu entwickeln.

In Zusammenarbeit mit der University of Michigan, unserem Labor am NIH erweitert die bereits entwickelten und berichtete ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ)-Algorithmus in einer Art und Weise, um es in semi-automatisiert das Gewebe Auswahlprozess, damit Eigen geführt Mikrodissektion, wodurch ein Werkzeug zur Verfügung mit dem Pathologen oder Lebenswissenschaftler im Auge. Ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ) ist ein Algorithmus, der Benutzer einfach "Klick" auf einem histologischen Merkmal von Interesse, um einen Ring-Vektor (Prädikat Bild Funktion), die verwendet werden können, um den gesamten histologischen Bild erstellen zu suchen, die Anpassung der statistischen Schwelle erlaubt nach Bedarf ^16-21. Die entstehende Wärme Karte zeigt die Qualität der Übereinstimmungen mit dem Anfangsbild Prädikat-Funktion und wird anschließend in einer einzigen Farbe (rot) Beschriftungskarte, die in das LCM Instrument importiert werden können umgewandelt. Anschließend wird die automatisierte Auswahl-Software, AutoScanXT, verwendet, um eine Karte zu ziehen Basisauf SIVQ Anmerkungs Führung der Erfassung der Zielzellen aus der Gewebeprobe. Das detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung der in den SIVQ Mikrodissektion Workflow.

Protokoll

Das beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den NIH Regeln für die Verwendung von menschlichen Gewebeproben verwendet.

1. Gewebepräparation

1. Vor Beginn erhalten menschlichen Gewebeproben nach Institutional Review Board (IRB)-Protokolle.
2. Wählen Sie die Art des Gewebes / der Zellenblock und die entsprechenden Verarbeitungsverfahren [Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), gefroren, oder Ethanol-fixierten und in Paraffin eingebetteten (Efpe)]. Formalin-Fixierung sorgt für eine optimale Histologie, gefolgt von Ethanol-Fixierung und schockgefroren. Jedoch kann die Fixierung und Gewebebearbeitungsmethoden DNA, RNA und Protein-Menge und Qualität für nachfolgende molekulare Analyse beeinflussen und sollten berücksichtigt werden.
3. Schneiden Sie die Gewebe / Zellblockabschnitte auf den Objektträger Art (Glas, Glas-Membran-oder Metallrahmen Membran) der Wahl. SIVQ Analyse funktioniert genauso gut auf allen drei Folientypen. Bitte beachten Sie, dass die Pseudo-Deckglas-Methode (siehe unten) mit Xylol und Ethanol kann auf den Metallrahmen Membran Objektträgern durchgeführt werden, da der Schieber muss auf der Stufe invertiert werden.
4. Wählen Sie ein oder chemisch-IHC-basierte Gewebe Fleck auf Zellen von Interesse aus dem Hintergrund zu identifizieren. Beachten Sie, dass Färbeverfahren können auch auf DNA-, RNA-und Protein-Qualität und Quantität des Gewebes. Testen Sie das Gewebe nach dem Färben auf die Grundlinie Qualität von Biomolekülen, bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu beurteilen. Immunhistochemie (IHC) mit DAB ^15, Immunfluoreszenz, schnell rot, de-novo-, Toluidinblau und Hämatoxylin und Eosin (H & E) (unveröffentlichte Daten): SIVQ-LCM hat sich auf Gewebe / Zytologie Folien mit Buntdurchgeführt worden.

2. Specimen Imaging

1. Last gleitet auf den Motortisch des Mikrodissektionsgerät und starten Sie die zugehörige Software. Wählen Sie die Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien bestimmen und sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilddateien sind im JPEG-Format gespeichert werden.
2. Optimieren Sie die imAlter Qualität durch die Anpassung der Helligkeit und Schärfe des Bildes auf dem Bildschirm, entweder mit dem manuellen Fokus-Rad oder über die Software der Dissektion Instruments.
   1. Mit der Bild-Toolbox-Software innerhalb der Dissektion Instruments, stellen Sie die Helligkeit der Lampe und Kamera-Gewinn entsprechend. Beispiel Werte sind Helligkeit = 60 und Gain = 220, mit dem Diffusor.
   2. Konzentrieren Sie sich entweder manuell oder mit der Autofokus-Funktion in der Software.
3. Nehmen Sie ein Thumbnail-Übersicht Bild von der Folie, um einen Fahrplan für die Dissektion Prozess zu ermöglichen.
   1. Für eine optimale Bildqualität eines uncoverslipped Rutsche, nutzen Sie den Diffusor unterhalb des Kondensators auf das Instrument, oder, eine kleine Menge (~ 30 ul) entweder Ethanol oder Xylole um die feuerfeste Index (pseudo-Deckglas) zu verbessern. Bei der Verwendung von Xylol, bewusst sein, sie sind giftig und ordnungsgemäße Sicherheitsmaßnahmen verwendet werden müssen, einschließlich der Verwendung von einer Abzugshaube und Schutzlaborkittel, Schutzbrille und Handschuhe.
   2. Stellen Sie den LCM Kappe auf der Folie, bis das Ethanol oder Xylole Lösung wurde komplett gelöscht oder das Polymer auf der Kappe verzerrt.
4. Navigieren Sie die Folie und die Aufnahmen der Bereiche zu 10X, 20X oder 40X Vergrößerung seziert werden. Wenn nötig, das Image mit einer Software wie Autokorrektur (in Microsoft Office Picture Manager) wie zuvor beschrieben ^22. Die Bilder müssen im JPEG-Format, um sie in den automatisierten Auswahlsoftware wieder importiert werden, damit erfasst werden.

3. Algorithmus Analyse der Bild

1. Über aufgenommenen Bilder von der Mikrodissektionsgerät auf die SIVQ-Ordner. Installieren und öffnen Sie die ArcturusXT, Autoscan und SIVQ Softwarepakete auf dem Computer auf die Dissektion Gerät angebracht sind. Für den Zugriff auf die Software SIVQ, kontaktieren Sie bitte Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
2. Offene SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild (jpeg) von Interesse.
3. Navigieren Sie zu dem Bereich von Interesse und / oder die Größe der Anzeigefenster (Viewport-5 & 6). In der SIVQ Software Viewport 5 zeigt die Vorverarbeitung Bild-und Viewport-6 zeigt die Post-Processing-Bild ^16.
4. Wählen Sie die Größe des Rings und der Anzahl der Vektor-Ringe zu verwenden.
5. Wählen Sie das Prädikat Bild-Funktion, um mit der rechten Maustaste darauf in Viewport 6 erfasst werden.
6. Klicken Sie auf "Scan", um das Bild zu analysieren.
7. Stellen Sie die statistische Wahrscheinlichkeit Bildabgleich mit den beiden Gleitschienen. Der obere Balken stellt die Gesamt Vektor Spezifität und wird verwendet, um Bereich von der ersten Scan auszuschließen sind (mit Sensibilität, wie durch die ausgewählten Variablen "Stat" definiert), die übermäßige enthalten Bereich darstellen kann. Umgekehrt ist der untere Schieber verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, nachdem eine Prüfung durchgeführt wird, mit der Absicht der Erhöhung der Fläche, die als eine Übereinstimmung klassifiziert wird. Beide Schieberegler utiren den "Stat"-Variable als Anfangsgrundlinie Empfindlichkeitsschwelle.
8. Um das Bild zu speichern, klicken Sie auf "Speichern als jpeg" (Bild wird nun im Ordner c :/ vq_test / Bilder gespeichert).
9. Analyse des Bildes mit dem Algorithmus. Der Ausgang des Analysealgorithmus muss in einer kommentierten Bild führen, damit es in SIVQ-LCM verwendet werden. Derzeit ist die aktuelle Version des SIVQ Kerntriebwerk in der Beta-Version Testen mit der Erwartung, dass die volle Produktionsversion (verfügbar ab Q1 2014) wird eine vollständige Software Development Kit (SDK) und Application Programming Interface (API) für die vereinfachte Integration von nehmen User-generierten Raumfilter und nachgelagerten Workflow Datenverarbeitungsschritte mit dem Kernring passenden Motor. Das SDK wird mit einem kompletten Satz der Dokumentation verteilt werden.
   1. Sicherzustellen, dass die SIVQ heatmap wird auf eine gleichmäßige rote Farbe verändert.
10. Exportieren Sie das Bild. Es ist wichtig, wieder einzubetten, die die Positionskoordinaten in der pOST-Analyse-JPEG-Bild mit Hilfe eines HEX-Editor, um in der Datei-Header aus dem Originalbild Dissektionsinstrument einfügen. Die entsprechenden Daten können zwischen "Start of Image"-Marker (0xFF, 0xD8) und dem ersten "Define Quantisierung Table"-Marker (0xFF, 0xDB) gefunden werden.

4. Microdissection

1. Platzieren Sie den LCM Kappe in der Mitte der Region von Interesse, wo die Bilder wurden für die Analyse eingefangen SIVQ.
2. Kalibrieren und Qualitätskontrolle (QC) die UV / IR-Laser und die Parameter, einschließlich Energie, Dauer-, Laser-Standorten und UV Schnittgeschwindigkeit (wie vom Hersteller empfohlen) optimieren. Führen Sie diese Kalibrierungen vor dem erneuten Import der Bild analysiert.
3. Offene AutoScanXT (automatisierte Auswahl-Software) und importieren Sie die analysierte Bild von c :/ vq_test Ordner / Bilder.
4. Trainieren Sie die automatisierte Software, um die Auswahl SIVQ Annotation erkennen und schaffen die Dissektion der Karte.
   1. Um ein Trai erstellenning-Datei, wählen vier Regionen von Interesse (durch "blaue Kreise" gekennzeichnet) auf der "rote Farbe" der SIVQ analysierte Bild.
   2. Wählen Sie die Hintergrundbereiche (durch das "rote Quadrate" gekennzeichnet), die nicht seziert werden.
   3. Klicken Sie auf "Analyze"-Taste, um die Trainingsdatei, die für die spätere Verwendungen gespeichert werden können, zu erzeugen.
5. Führen Mikrodissektion mit der entsprechenden Infrarot-(IR) und / oder Ultraviolett (UV)-Laser.
   1. Kopieren Sie die ausgewählten Bereiche auf die "Live"-Bild.
   2. In der "microdissect" Toolbox, wählen Sie die entsprechende Capture IR-oder UV-Schneid Tasten.
6. Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, bewegen Sie den LCM Kappe an der QC-Station und erfassen ein Bild der präparierten Gewebe / Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Kappe auf einen leeren Bereich der Folie vor dem Verschieben in den QC-Station zu platzieren, ermöglicht dies dem Benutzer, Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen zu nehmen.
7. Nehmen Sie ein Bild der Gewebebereich von Interesse nach Mikrodissektion zur weiteren Beurteilung Hebeeffizienz.
8. Wenn die gewünschten Zellen wurden erfolgreich seziert wurde, klicken Sie auf den "gegenwärtigen Zeitpunkt" in der ArcturusXT Software und entfernen Sie die LCM Kappe, um die molekulare Extraktionsverfahren für Downstream-Analyse zu starten.

Ergebnisse

Ein FFPE menschlichen Brustgewebeschnitt wurde für Zytokeratin AE1/AE3 mit einem Standard-IHC-Protokoll ²³ immun. Nach dem Färben wurde das Gewebe auf dem Objektträger ArcturusXT Stufe angeordnet, und die SIVQ LCM-Protokoll wurde, wie oben beschrieben eingeleitet. Da das Gewebe nicht für die Mikrodissektion Deckglas versehen werden, die IHC + gefärbten Zellen schwierig sein, visuell zu erkennen (Abbildung 1A). Um somit eine bessere Indexanpassung und ein verbessertes Bild bereitzustellen...

Diskussion

Wir stellen ein Protokoll für die Anwendung SIVQ-LCM auf immun Epithelzellen aus FFPE menschlichem Brustgewebe microdissect. Die Verwendung eines Bildanalysealgorithmus, wie SIVQ, reduziert die Menge der Handhabungszeit für die Mikrodissektion Prozess erforderlich. Dies ist eine potentiell wichtige Neuerung, da Bediener Zeit und Mühe ist typischerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die präzise Präparation von Zellen von Interesse. In dem vorliegenden Protokoll, die wir speziell angepasste unser Verfa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Positive Charged Glass Slides	Thermo Scientific	4951Plus-001
Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis	Sigma Aldrich	247642	CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous	The Warner-Graham Company	6.505E+12	CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.
Arcturus CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
ArcturusXT Laser Microdissection Instrument	Life Technologies	ARCTURUSXT
AutoScanXT Software	Life Technologies		An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.
Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)	University of Michigan		This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]