Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Zusammenfassung

Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

Zusammenfassung

Elektroporation wurde zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren erhalten, weil es ein sehr leistungsfähiges Verfahren zum physikalischen Einführen nicht-durchdringenden exogenen molekulare Sonden in Zellen. Diese Arbeit berichtet über eine mikrofluidische Plattform Elektroporation der Lage ist, mehrere Molekül Lieferung an Säugetierzellen mit präzisen und molekularen abhängigen Parametersteuerung. Die Fähigkeit des Systems, um Zellen mit einheitlicher Größenverteilung zu isolieren lässt weniger Variation in Elektroporationseffizienz pro gegebenem elektrischen Feldstärke; damit verbesserte Probenfähigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Beobachtung des Fluoreszenzmolekularaufnahmeprozess in Echtzeit, die prompt Molekular Lieferung Parametereinstellungen zur Effizienzsteigerung ermöglicht in situ seine Prozessvisualisierungsfunktion. Um die riesigen Möglichkeiten der Plattform gemeldet zeigen, Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen (zB Dextran mit MW von 3.000 und 70.000 Da) warengeliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen mit hoher Fördereffizienzen (> 70%) für alle getesteten Moleküle. Die entwickelte Plattform wurde das Potenzial für den Einsatz in den Ausbau der Forschungsfelder, wo auf dem Chip Elektroporationstechniken von Vorteil sein kann bewiesen.

Einleitung

In den letzten Jahren hat die Verwendung von elektrischen Impulsen an das cytosolische Abgabe von extrazellulären Molekülen erleichtern zu einem attraktiven Mittel zum Manipulieren Säugerzellen. ¹ Dieses, auch als Elektroporation bekannt ist, reversibel permeabilisiert der Zellmembran, so dass für inhärent Membran undurchlässig Moleküle um Zugang zu erhalten intrazellulären Milieu der Zellen. Da praktisch jedes Molekül in das Cytosol über temporäre erzeugt Poren in der Membran von jeder Art von Zellen unter Verwendung von Elektroporation eingebracht werden, ist die Technik, wie berichtet, wobei reproduzierbarer, universell einsetzbar und effizienter als andere Verfahren, einschließlich Virus-vermittelten chemischen und optische Methoden. ^2-3 Diese Technik wurde verwendet, um fluoreszierende Moleküle einzuführen, ⁴ Medikamente ⁵ und Nukleinsäuren ^6-7, während Zellen lebensfähig und intakt. Angesichts dieser Vorteile hat die Elektroporation als eine gemeinsame Arbeits verabschiedetAtory Technik zur DNA-Transfektion in vivo Gentherapie und Zell ⁸ Vakzinierungsstudien. Es ist jedoch immer noch schwierig für herkömmliche Systeme Elektroporation, gleichzeitig eine praktische Effizienz und Rentabilität für Proben mit großen Heterogenität in der Größe, da die elektrische Feldstärke für eine erfolgreiche Elektroporation erforderlich eng mit Durchmesser der Zelle korreliert. Hinzu kommt, dass diese Systeme nicht erlauben präzise Steuerung der mehreren molekularen Mengen, die durch die Abhängigkeit von Groß stochastischen Molekularlieferprozess geliefert. ⁹ Um diese Probleme anzugehen, haben viele Gruppen mikrofluidischen Elektroporation Plattformen entwickelt und bietet den Vorteil der geringeren Körperschaftsteuer Spannungen, bessere Transfektionseffizienz, eine große Reduktion der Zellsterblichkeit, und die Fähigkeit, mehrere Moleküle liefern. ^10-13 Diese Vorteile wurden möglich durch die kleinen Fußabdrücke von Mikrosystemen, deren Elektroporation ElektrodenabstandLängen sind Unter Millimeter, dramatisch sinkende Spannungen für erfolgreiche Zustellung erforderlich. Darüber hinaus können diese Mikrosysteme Elektroporation einheitliche elektrische Feldverteilung zu erreichen und schnell erzeugte Wärme abzuführen, was reduzierter Zellmortalität und gleichzeitig die Liefereffizienz. Die Nutzung von transparenten Materialien für diese Mikrochips ermöglicht ferner in situ Beobachtung der Elektroporation Prozesses für eine schnelle Parameteränderungen. ^2,12 jedoch präzise Dosierung Steuerung und molekular und zellulären abhängigen Parametersteuerung, für die Schwellen Forschung und therapeutische Anwendungen, ^{6 erforderlich, 14-16} immer noch ungelöst.

In dieser Arbeit wird eine mikrofluidische Wirbelgestützte Elektroporation System liefern kann mehrere Moleküle sequentiell in einer vorgewählten identische Population von Zielzellen. Zellen, die mit gleichmäßigen Größenverteilung vor der Elektroporation isoliert mit zuvor berichteten size-selektive Fangmechanismus. ^17-18 Durch eine gleichmäßige Größenverteilung, weniger Schwankungen bei der Elektroporation Effizienz und verbesserte Rentabilität pro gegebenem elektrischen Feldstärke erreicht. ^19. Darüber hinaus kontinuierlich gerührt gefangen Zellen unter Verwendung von Mikrowirbel für gleichmäßige Abgabe von Molekülen über die erlaubte gesamte Cytosol, in Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit einem anderen wirbel unterstützt Elektroporation Plattform. ^20. Um zu zeigen, dass dieses System wäre für eine breite Palette von Molekülen in biologischen Anwendungen häufig genutzt, Makromoleküle mit einer breiten Palette von Molekulargewichten wurden geliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Darüber hinaus mit Hilfe von Echtzeit-Prozessüberwachung, bietet diese Arbeit mehr Beweise, um ein Ende während electrporation auf die langjährige Debatte über den Mechanismus der molekularen Lieferung setzen, wobei überwiegend Elektrophorese-vermittelte gegenüber diffusions vermittelt. ¹⁴ Im Gegensatz zu anderen Systemen Elektroporation, bietet diese Plattform eindeutig die kombinierten Vorteile der präzisen Multi-Molekül Lieferung, hohe Molekular Lieferung Effizienz, minimale Zellsterblichkeit, einer breiten Spanne von Größe und Kosten der gelieferten Moleküle, sowie Echtzeit-Visualisierung der Elektroporation Prozess. Angesichts dieser Möglichkeiten hat das System entwickelt Elektroporation praktische Potenzial als vielseitiges Werkzeug für die zelluläre Reprogrammierung Studien ^6,14,21-22 Drug-Delivery-Anwendungen und Anwendungen, die ^10,19 für ein tiefes Verständnis der molekularen Elektroporation Liefermechanismen.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Platte 1 × 10 ⁵ Zellen / ml von metastatischen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 in einem Volumen von 10 ml pro Gewebekultur T75-Kolben in Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Inkubieren MDA-MB-231-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C bei 0% CO _2-Umgebung.
3. Ernten der Zellen für Experimente 2 Tage nach der Saat, indem man die Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min und Inaktivierung der enzymatischen Aktivität von Trypsin durch Zugabe von 8 ml Wachstumsmedium.
4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 × g und Resuspendieren in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS, 1x, ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} zu einer Endkonzentration von 5 × 10 ⁵ Zellen / ml.

2. Geräte Konstruktion und Herstellung

HINWEIS: Die Maske, Masterform Erfindungen und dieMikrokanal umschließenden Verfahren sind in einem Reinraum durchgeführt, während die Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikro Gießverfahren auf einem normalen Labortisch durchgeführt werden kann.

1. Entwerfen Sie ein Mikrofluidik-Gerät wie in Abbildung 1 veranschaulicht mit AutoCAD. Die Vorrichtung sollte aus einem Einlass mit mehreren Einspritzöffnungen, Grobfilter und zwei parallelen geraden rechtwinkligen Trägheitsfokussierungskanäle bestehen (L = 7 mm, W = 40 um und H = 70 um). Einzelnen geraden Kanal besteht aus 5 Elektroporation Kammern, die platziert werden 800 um auseinander (W _C = 400 um) mit zwei über Löcher für Aluminiumelektroden. Zwei in Querrichtung benachbarten Elektroporation Kammern teilen die Bohrung für die negative Elektrode. Zwei gerade Kanäle gehen in einem Auslaß an dem stromabwärts gelegenen Bereich der Elektroporation.
2. Konvertieren Sie die CAD-Datei mit Mikrogefüge zu einer GDSII-Datei mit LinkCAD. Schreiben Sie die Mikro-Muster auf einem 5 "x 5" Photomaskenrohlingmit einem Laser-Maskenschreiber. Entwickeln Sie die Maske durch folgende Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Maske Entwicklungsprozess umfasst Fotolackentwicklung, Chrom Ätzen und Lackentfernen. Alternativ Mikromuster auf einem hochauflösenden Transparenz gedruckt (> 20.000 dpi) kann von einem Dritten Hersteller gekauft werden und als Photomaske verwendet. Endgültige Mikromerkmale auf einer Photomaske sollte transparent, um die Polarität eines negativen Photoresist-Spiel.
3. Herstellung der Gussform des Gerätedesign mit Standardsoftlithographie-Techniken ²³ mit einem negativen Photoresist gesponnen Mantel auf einem 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 2.000 Umdrehungen pro Minute, um die endgültige Dicke von 70 um haben.
4. Vorbacken des Wafers mit Negativlack für 20 Minuten bei 95 ° C aufweist.
5. Kontaktieren Sie die Maske mit dem Wafer und setzen auf eine UV-Quelle (17,4 mJ / cm ²⁾ für 80 Sekunden mit einem Mask Aligner.
6. Entwicklung des belichteten Wafers für 4 min in einer SU-8-Entwickler.
7. Messen Sie dieentwickelten Photolackdicke mit einem Profilometer Oberfläche.
8. Rigoros mischen Sie einen 10: 1-Verhältnis von Elastomer-Härter (Silikon-Elastomer-Kit) und gießen Sie die Mischung auf der Gussform zu PDMS Repliken zu generieren. Entgast Gießelastomer für 30 min und Aushärten der Gussform mit entgastem Elastomer in einem Ofen bei 70 ° C für 2 Stunden.
9. Ablösen geheilt PDMS-Nachbildung mit Mikrokanalmuster aus der Form und Stanzlöcher für Buchten, Steckdose und Elektrodeninsertionen mit einem Schraubstock. HINWEIS: Die normale Schneidendurchmesser des Stiftes Schraubstock sollte 0,76 mm, geeignet für fest an Ort und Stelle hält PEEK-Schlauch (Außendurchmesser von 1/32 ") und Aluminium-Elektroden (OD von 0,029") sein.
10. Erstellen geschlossenen mikrofluidischen Kanälen durch Kleben PDMS Replikate auf einem Glasobjektträger in einer Sauerstoff-Plasmareiniger für 7 Sekunden lang bei einer Hochfrequenzleistung und einem Sauerstoffpartialdruck von 75 W und 500 mTorr sind.

3. Durchflussversuche

1. EinsatzAluminiumelektroden (0,029 "OD) und einem Auslass PEEK-Schlauch (1/32" OD) in bestimmten Orten über Löcher in den Mikrokanal (siehe Bild 3b).
2. Schließen Sie die elektrische Ausrüstung zur Erzeugung von Hochspannungs kurzen Rechteckimpulsen zu den Aluminiumelektroden ¹⁸ verantwortlich (siehe Abbildung 3C), die in Kontakt mit fließenden Lösungen in der PDMS-Form sind. HINWEIS: Die Ausrüstung sollte aus einem Impulsgenerator und einer In-Haus gebaut Hochspannungsverstärker bestehen ^18.
3. Planen vier 50 ml Zentrifugenröhrchen einzeln DPBS enthaltenden Lösungen mit Zellen und Biomolekülen und befestigen jedes Rohr mit seinem jeweiligen Ampullenhalter zum pneumatischen Durchflusssteuerungssystem verbunden sind (siehe 3A). ¹⁸
4. Verbinden Einlass PEEK-Kapillare auf den Flaschenhalter in die jeweiligen Einlaßöffnungen in der mikrofluidischen Vorrichtung.
5. Stellen Sie die Grße der Rechteckimpulse, V, 100 V, um die elektrische FIE habenld Stärke, E = V / L _e, über die Elektroporationskammer äquivalent zu 0,7 kV / cm. HINWEIS: Hier ist L _E der Abstand zwischen zwei Punkten, wo die positiven und negativen Elektroden in Kontakt mit der fließenden Lösung sind (siehe Abbildung 1).
6. Stellen Sie den Druckregler auf 40 psi. ¹⁸ Eine einzelne manuell einstellbar Stickstoffquelle wird verwendet, um gleichmäßig Druck alle Probenfläschchen und eine High-Speed-Verteiler genutzt, um rechtzeitig aktivieren individuelle Lösung Ports mit der kundenspezifischen Software LabVIEW: Hinweis.
7. Für die Ventilsteuerung, öffnen Sie die maßgeschneiderte Software LabVIEW markiert Ventil Runner, und klicken Sie auf Run im Dropdown-Menü mit dem Titel arbeiten.
8. Schalten Sie Ventile, indem Sie auf jedem entsprechenden Ventil-Symbol. HINWEIS: Das Ventil Symbol wird grün, wenn es aktiviert wird. Ein Klick auf die aktive Symbol deaktivieren und das Ventil schließen. Das geschlossene Ventil Symbol sollte grau.
9. Öffnen Sie das Ventil für die DPBS Behälter (dh., Waschlösung) an Minister der Strömungsgeschwindigkeit für stabile Zell-Trapping Wirbelbildung erforderlich für 1,5 min.
10. Umschalten der aktiven Lösung Port aus der Waschlösung zu der Zelllösung zu stoppen Zellen in der Elektroporation Kammer 30 s (dh die Zellfangschritt).
11. Fließen sowohl Wasch-und Zell Lösungen durch das Gerät gleichzeitig für 10 Sekunden vor der Zell-Trapping-Schritt, um ungestörten Strömung während der Lösung-Schaltschritt zu gewährleisten. HINWEIS: Diese kurze Zusammenfluss Schritt sollte bei jeder Lösung-Schaltschritt wiederholt werden.
12. Schalten Sie den Waschhafen und spülen Sie das Gerät für 20 Sekunden, um nicht gefangen kontaminierenden Zellen zu entfernen.
13. Injizieren Sie die Lösung, die das erste Molekül von Interesse (0,2 mg / ml 3000 Da neutrale und anionische Dextranmolekülen oder 1,5 mg / ml von 70.000 Da neutral Dextranmolekül) in das Gerät.
14. Gelten fünf kurze Impulse (t = 30 ms mit 2 Sekunden-Intervallen) unverzüglich nach der Injektion derMolekularlösung und Überwachung der Größe und Dauer des angelegten elektrischen Impulse in Echtzeit unter Verwendung eines Oszilloskops.
15. Wiederholen Sie Schritt 3.10 so oft wie die Anzahl von zusätzlichen Molekülen geliefert werden. Für jede Lieferung Molekular, Inkubation Zellen für 100 s in der molekularen Lösung dann spülen Sie das Gerät mit der Waschlösung für 100 s, um überschüssige Moleküle zu entfernen.
16. Lassen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte für nachgeschaltete Analyse durch Senken der Betriebsdruck unter 5 bar. HINWEIS: Etwa 100 ul Lösung mit 100 Zellen von jedem Release gesammelt.
17. Führen Sie die experimentellen Schritte 3.9 bis 3.16 drei Mal, um genügend Zellen für die Durchflusszytometrie zu sammeln.
18. Zentrifugieren der 96-well-Platte, die verarbeiteten Zellen 5 min bei 228 × g.
19. Entfernen Sie den Überstand, die überschüssige fluoreszierende Moleküle enthält.
20. Die Zellen in DPBS für die Durchflusszytometrie-Analyse.
21. Lastzellen im Durchflusszytometer für die molekulare uptake Effizienzanalyse.

Ergebnisse

Der entwickelte parallele mikrofluidische Elektroporator geliefert Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen in lebende metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Erfolgreiche Molekularliefer wurde qualitativ durch Überwachung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des elektroporierten umlaufenden Zellen in situ bestimmt und durch quantitative Messungen mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. 4A zeigt, dass 90% der behandelten Zellen Auffassung 70.000 Da ne...

Diskussion

Mit der neuen Plattform parallelisiert Elektroporation, 10-fache Verstärkung in Durchsatz und Effizienz von Multi-Molekül Lieferung wurde zusätzlich zu all den Vorzügen, die die zuvor entwickelten Ein-Kammer-System bietet erreicht. Bisher ¹⁸ verfügbar Verdienste umfassen (i) Vorreinigung Zielzellen mit einheitlicher Größenverteilung für die Lebensfähigkeit Verbesserung, (ii) präzise und individuelle molekulare Dosierungssteuerung, und (iii) geringe Betriebs elektrischen Strom. Fluoreszierend markier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 cancer cell line	American Type Culture Collection (ATCC)	HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium	Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Trypsin	Gibco, Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner	Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT	Dow Corning
Compressed Nitrogen gas	Airgas	NI 300
High Pressure Regulator	McMaster-Carr	6162K22
Downstream regulator	McMaster-Carr	4000K563
High-speed 3/2way-8 valve manifold	Festo
Inline Check Valve	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings	Festo	P1533
1/32" PEEK tubings	Idex Health and Science	P1569
PEEK tubing unions	Idex Health and Science	P881
Pulse Generator	HP	8110A
Aluminum Wire	Bob Martin Company	6061 ALUM
Oscilloscope	Agilent	DSO3062A
50 ml centrifuge tubes	VWR	21008-178
15 ml centrifuge tube	VWR	21008-216
T75 culture flask	VWR	82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic	Gibco, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329