Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Zusammenfassung

Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.

Zusammenfassung

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Einleitung

Es ist seit vielen Jahren, dass Deletionen oder zusätzliche Kopien von Chromosomensegmente verursachen geistiger Behinderung, Dysmorphien und congentical Fehlbildungen bekannt, und in einigen Fällen dazu führen, genetische Syndrome ^1. Doch die einzige Technologie zur Verfügung, bis Mitte der 2000er Jahre für die genomweite Erfassung dieser Veränderungen war, G-gebändert Chromosomenanalyse, die eine Auflösung von rund 5-10MB hat, je nach Region und Art des Ungleichgewichts und welche nicht abnorme Chromosomen, wo Material wurde von einer Region aus einem anderen Chromosom mit der gleichen Bandenmuster ersetzt. Neben zytogenetischen Techniken wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Multiplex Ligation-spezifischen Sonde Verstärkung wurden für die Abfrage bestimmter Loci vorhanden, bei Verdacht auf bestimmte syndromale Ungleichgewicht, aber es war nicht bis zur Einführung der Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) in der klinischen Routinediagnose service ^2-5, die genomweite Erfassung der Kopienzahl-Varianten (CNVs) wurde zu einem stark erhöhten Auflösung (typischerweise um 120kb) möglich. Klinische Servicearbeiten neben Studien haben gezeigt, dass CNVs für einige Regionen in der Normalbevölkerung ^6-7 weit verbreitet, während andere CNVs, die zuvor nicht nachweisbar, werden mit neurodisabilities wie Autismus und Epilepsie ^8-11 verbunden.

Die in diesem Dokument beschriebenen Protokoll wird in unserem UK National Health Service (NHS) klinisch-diagnostischen Labor; wir neuartige Hybridisierung Strategien, Chargenprüfung und Robotik zu Kosten in diesem staatlich finanzierten Dienst minimieren.

Vor dem unten beschriebenen Protokoll sollte hochwertige DNA aus dem entsprechenden Ausgangsmaterial, meist Blut, kultivierten Zellen oder Gewebeproben entnommen werden. Spektrophotometrie verwendet werden, um Konzentration zu messen (sollte> 50 ng / ul) und prüfen 260: 280 Absorptionsverhältnisse (zu be von 1,8 bis 2,0). Die Gelelektrophorese kann kontrolliert werden, dass die DNA mit hohem Molekulargewicht ohne signifikanten Abbau werden.

Dieses Protokoll wird für einen höheren Durchsatz Laboratorien, Kennzeichnung 96 Proben pro Lauf mit automatisierten Liquid-Handling-Robotik sollen. Es kann jedoch für niedrigere Durch Labors ohne Automatisierung angepaßt werden.

Protokoll

1. Kennzeichnung Reaktion

1. Vor, Pre-Aliquot Cyanin 3 und 5-markierten dUTPs, unmarkierten Nukleotiden und Zufallsprimer an den Hersteller empfohlenen Konzentrationen verwenden in 96-Well-Platten und bei -20 C einsatzbereit. Für die Zwecke dieses Protokolls Aliquot von 10,5 & mgr; l des geeigneten markiertem dUTP und 10,5 ul unmarkierter Nukleotide und Zufallsprimer in jede Vertiefung.
2. Auftauen ready-to-use Platte mit 96 Vertiefungen von Nukleotiden und Primern bei 4 ° C für etwa 1 Stunde, vor Licht geschützt.
3. Nach dem Auftauen Gleichgewicht dieser Platte bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, vor Licht geschützt.
4. Äquilibrieren DNA-Proben bei 60 ° C für mindestens 15 min.
5. Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboters, verzichtet Nuklease-freies Wasser zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Die Wassermenge hängt von der Konzentration jedes Eingangs DNA-Probe ab und sollte ausreichen, um in einer Endkonzentration von 50 ng / ul führt.
6. Verwendung eines flüssigen hanling Roboter-Pipette 1 ug DNA in eine Vertiefung der 96-Well-Platte (siehe 1.5), um das Gesamtvolumen auf 20 ul zu bringen.
   HINWEIS: Kleinere Mengen von DNA kann verwendet werden, obwohl die Qualität der resultierenden Daten beeinträchtigt sein kann (zum wertvollen Proben können Eingabe DNA Mengen bis 400 ng) verwendet werden.
7. Verwendung einer Flüssigkeit handhabenden Roboter, übertragen 20 ul äquilibrierten Nukleotide und Primer in jede Vertiefung der Platte verdünnt DNA.
8. Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit Verschlussstreifen (a dicht ist entscheidend).
9. Die DNA zu denaturieren bei 99 ° C für 10 min in einer PCR-Maschine mit einem beheizten Deckel und rasten kühl auf Eis für 5 min auf Glühen Primer.
10. Mit einem Liquid-Handling-Roboter, fügen Sie 10 ul Klenow-Exo-DNA-Polymerase-Enzym zu jedem DNAs und Pipetten Mischung gründlich.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte 50 ul sein.
11. Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und bei 37 ° C für 16 Stunden.
    ANMERKUNG: Eine kürzere Inkubationszeit von 4 h reicht jedoch ein O / Ncubation kann bequemer sein.
12. Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter, mit 5 ul Stoppuffer zu jedem Well.
    ANMERKUNG: Eine Zusammenfassung der für die Markierungsreaktion verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 gezeigt.

2. Entfernung von Nicht eingebaute Nukleotide

1. Entfernen eingebauten Nukleotiden unter Verwendung von Silica-Membran von Spin-Säulen und eine dedizierte Spin-Säule Bearbeitungsroboter (die Spin-Säulen können auch manuell bearbeitet werden). Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
   1. Den Inhalt jeder Vertiefung in ein 2-ml-Tube; Pre-Label diese mit gut-IDs.
      Anmerkung: Dieser Schritt kann manuell oder vorzugsweise mit Hilfe einer Flüssigkeitshandhabungsroboter durchgeführt werden.
   2. Bei Verwendung einer Spin-Säule Bearbeitungsroboter, dann laden Sie den Roboter mit 2-ml-Röhrchen, die DNA-Reinigung Spin-Säulen und die damit verbundenen Puffer.
   3. Nach Eintragen von 250 ul Hochsalz, DNA-Bindungspuffer (Puffer PB) an die Markierungsreaktion, um die markierten DNA an die Kieselsäure bindenMembran.
   4. Verunreinigungen durch zweimaliges Waschen der Membran mit 500 ul Waschpuffer (Puffer PE).
   5. Werden 15 ul niedrigen Salz Elutionspuffer (Puffer EB) auf die Membran, um die gereinigte markierte DNA in einem Volumen von ~ 12 & mgr; l zu gewinnen.

3. Kombinieren Hyb Paare

1. Kombinieren Sie die entsprechenden Paare von Cyanin 3 und 5-markierte DNA, COT-1-DNA, ein Hersteller gelieferten blockieren-Mix und ein Hersteller gelieferten Hybridisierungspuffer unter Verwendung eines flüssigen Handhabungsroboter.
   Hinweis: Diese hyb Paare können eine Probe und eine Referenz oder Probe vs Probe, wenn gemeinsamen CNVs sind kein Thema (zB wir routinemäßig zu koppeln Phänotyp-übereinstimmende Muster, wie ein Nierendysplasie Patienten vs einer Kraniosynostose Patienten, da sie sehr sind unwahrscheinlich, dass die gleichen klinisch signifikanten CNV tragen). Bei Verwendung einer Referenz-DNA ist eine kommerzielle DNA Versorgung empfohlen und sollte zusammen mit der Probe verarbeitet werden.
   1. Mit ein Liquid-Handling-roBot Fügen COT-1 DNA (3333 ng / ul), die vom Hersteller gelieferten Sperrmischung und Hybridisierungspuffer in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, so dass jede Mulde 1,1 ul Cot-1-DNA, 4,95 & mgr; l Blockierungs Mischung und 24.75 ul Hybridisierungspuffer.
   2. Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin 3-markierter DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit.
   3. Hinzufügen 9,35 ul des geeigneten Cyanin5 markierten DNA in jede Kammer. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit.
   4. Verschließen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen und Vortex für 1 min. Drehen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Inhalte auf den Boden jeder Vertiefung zu sammeln.

4. Hybridisierung

1. Heizen Sie eine Hybridisierungsofen auf 65 ° C vorwärmen und eine Trägerschlitten und einer Hybridisierungskammer für jedes Array Objektträger.
   1. Denaturieren der markierten DNA in einem vorge Hybridisierungsinkubation bevor Aufbringen auf den Arrays. Führen Sie die Hybridisierung in einem rotierenden Ofen für 24 Stunden.
   2. Inkubiere die Platte mit 96 Vertiefungen bei 70 ° C für 30 min und dann lassen bei 37 ° C für mindestens 5 min.
   3. Die Arbeit an einem beheizten Plattform bei 42 ° C, laden jede Sicherung Rutsche in eine Hybridisierungskammer vor der Verwendung. Sicherzustellen, dass der transparente Teil der Dichtung Schieber fluchtet mit dem "gefensterten" Teil des Hybridisierungskammer.
   4. Pipettieren Sie 42 ul des Hybridisierungsmischung vorbereitete (siehe Abschnitt 3) auf die entsprechende Position auf dem Array sichern Rutsche. Vornässen jede Spitze zu verbessern Pipettiergenauigkeit. Pipette langsam auf die Mitte jeder Position, so dass die Flüssigkeit nicht den Gummiring Grenze berühren.
   5. Wenn alle Positionen auf dem Trägerschlitten gefüllt sind, lassen Sie das Array Rutsche auf sie und die Hybridisierungskammer zu montieren. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Anordnung mit Schreiben auf es mit Blick auf die Unterlage Rutschbahn. Achten Sie darauf, die Hybridisierungskammer Schraube festdrehen.
   6. Überprüfen Sie die zusammengebauten Hybridisierungskammer. ENSure daß es keine Leckage von Hybridisierungsmischung außerhalb der Gummiring Grenzen und jede Luftblase ~ 4 mm in der Höhe, wenn die Hybridisierungskammer ist an seinem Ende senkrecht ruhte. Drehen Sie die Hybridisierungskammer und überprüfen, dass sich keine Luftblasen, die in Position und bewegt sich nicht stecken. Wenn es irgendwelche von ihnen, geben dem Raum einen starken Schlag auf die Bank. Überprüfen Sie, ob alle Luftblasen in Bewegung sind.
   7. Platzieren Sie die Hybridisierungskammer in den rotierenden Ofen bei 65 ° C für 24 Stunden. Sicherstellen, dass der Ofen Rotor ist ausgewogen; verwenden andere leere Kammern, falls erforderlich.

5. Waschen und Scannen von Dias

1. Waschen Sie Arrays, um überschüssige markierte DNA zu entfernen und dann scannen, um Fluoreszenz jeder Probe zu messen.
   1. Nehmen Hybridisierungskammern aus dem Ofen und zu demontieren. Die Array-und Dichtungsfolien werden miteinander verklebt werden; tauchen diese in Waschpuffer 1 und mit einem Paar aus Kunststoff, Flachzange eingefasst, sie auseinander zu hebeln.
   2. Discard die Dichtung Rutsche und legen Sie das Array Rutsche in ein Rack in Puffer 1 getaucht.
   3. Waschen Sie die Array-Folie in ~ 700 ml frischem Waschpuffer 1 für 5 Minuten, unter starkem Rühren (mit einem Floh und Magnetrührer).
   4. Übertragen Sie die Array-Folie, um ~ 700 ml Waschpuffer 2 und waschen für 90 sec, unter kräftigem Rühren. Gently heben Sie die Array gleitet aus Waschpuffer 2, sollten sie trocken entstehen.
   5. Laden Sie das Array Abgleiten in einen Objektträgerhalter aus dem Scanner, über einen Schiebeschutz. Legen Sie die Folie in das Array-Scanner und scannen folgenden des Arrays Herstellers.

Ergebnisse

Jede Sonde auf einem Array hybridisiert wird als eine Mischung aus roten und grünen Fluorochrome visualisiert (siehe Abbildung 1). Das Verhältnis von rot nach grün fluoreszierenden Signals für jede Sonde wird vom Scanner quantifiziert und die zugehörige Software zeichnet diese als log2 Verhältnisse entsprechend ihrer genomischen Position und identifiziert Bereiche, die außerhalb voreingestellten Grenzen. Die resultierende Array Spuren ermöglichen Interpretation der Regionen als genomisch unsymme...

Diskussion

Array-CGH wird ausgewogenen Umlagerungen oder Ploidie Anomalien wie Triploidie nicht erkennen. Ferner können geringe mosaic Ungleichgewichte nicht erkannt werden. Hat Array-CGH jedoch eine höhere Auflösung für CNV Erkennung als G-gebändert Chromosomenanalyse, die es in vielen Labors Zytogenetik ersetzt hat. Es ist daher der derzeitige Goldstandard für die genomweite CNV-Erkennung. Sie kann von der nächsten Generation Sequenziertechnologien in der Zukunft ersetzt werden, aber derzeit, ihre Kosten und die technisch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH wash buffers	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridisation buffer	Agilent	5188-5380
Minelute purification kit	Qiagen	28006
Array CGH labelling kit	Enzo	ENZ-42672-0000