Gewebe-Simulation Phantoms zur Bestimmung der potentiellen Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen in Brustkrebschirurgie

Zusammenfassung

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Zusammenfassung

Ungenauigkeiten in der intraoperativen Tumorlokalisation und Auswertung der Status der Resektionsränder Ergebnis einer suboptimalen Ergebnis der brusterhaltenden Operation (BCS). Die optische Bildgebung, insbesondere im nahen Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Bildgebung, könnte die Häufigkeit der positiven operativen Margen folgende BCS durch die Bereitstellung der Chirurg mit einem Werkzeug für Pre-und intraoperativen Tumorlokalisation in Echtzeit zu reduzieren. In der aktuellen Studie wird das Potenzial der NIRF-geführte BCS ausgewertet mit gewebe Simulation Brust Phantome aus Gründen der Standardisierung und Schulungszwecke.

Brust Phantome mit optischen Eigenschaften, die denen von normalem Brustgewebe wurden verwendet, um brusterhaltenden Operationen zu simulieren. Tumor-Simulation Einschlüsse, die die Fluoreszenz-Farbstoff Indocyaningrün (ICG) in der Phantome an vorgegebenen Stellen eingearbeitet und für prä-und intraoperativen Tumorlokalisierung, Echtzeit-NIRF-geführt Tumorresektion NIRF-geführt abzubildendenAuswertung über den Umfang der Operation und postoperative Bewertung der Schnittränder. Eine angepasste NIRF Kamera wurde als Prototyp für die klinische Bildgebung verwendet.

Brust Phantome enthalten Tumor-Simulation Einschlüsse bieten eine einfache, kostengünstige und vielseitiges Werkzeug zur Simulation und Bewertung der intraoperativen Tumordarstellung. Die gallertartige Phantome elastische Eigenschaften ähnlich dem menschlichen Gewebe und können mit herkömmlichen chirurgischen Instrumenten geschnitten werden. Darüber hinaus enthalten die Phantome Hämoglobin und Intralipid zum Nachahmen Absorption und Streuung von Photonen bzw. Erstellen ähnlich der menschlichen Brustgewebe gleichmäßige optische Eigenschaften. Der Hauptnachteil der NIRF Bildgebung ist die begrenzte Eindringtiefe von Photonen, wenn durch das Gewebe, das (nicht-invasive) Bildgebung von tief sitzenden Tumoren mit Auflicht-Strategien behindert ausbreiten.

Einleitung

Brust-Operation (BCS), gefolgt von einer Strahlentherapie ist die Standard-Behandlung für Brustkrebs-Patientinnen mit _T1-T2 Mammakarzinom ^1,2. Ungenauigkeiten in der intraoperativen Beurteilung des Ausmaßes der Operation zu positiven operativen Margen in 20 bis 40% der Patienten, die BCS unterzog, erfordern zusätzliche chirurgische Eingriffe oder Strahlentherapie ^3,4,5. Obwohl umfangreiche Resektion des angrenzenden gesunden Brustgewebe kann die Häufigkeit der positiven operativen Margen reduzieren, wird dies auch behindern kosmetische Ergebnis und erhöhen Komorbidität ^6,7. Neue Techniken sind daher notwendig, dass die intraoperative Rückmeldungen über die Lage des Primärtumors und dem Ausmaß der Operation zu schaffen. Die optische Bildgebung, insbesondere im nahen Infrarot-Fluoreszenz (NIRF) Bildgebung, könnte die Häufigkeit der positiven operativen Margen folgende BCS durch die Bereitstellung der Chirurg mit einem Werkzeug für Pre-und intraoperativen Tumorlokalisation in r reduzierenEAL-Zeit. Kürzlich berichteten unserer Gruppe auf dem ersten in-Studie am Menschen von Tumor-Fluoreszenz-Imaging gezielt bei Eierstockkrebs-Patienten, die die Machbarkeit dieser Technik, um Primärtumoren und Metastasen intraperitoneale mit hoher Empfindlichkeit ⁸ zu erkennen. Bevor zu klinischen Studien bei Patientinnen mit Brustkrebs, aber der Durchführbarkeit der verschiedenen Tumor gerichtet NIRF Imaging-Anwendungen im BCS bereits präklinisch mit Phantomen ausgewertet werden.

Die folgenden Forschungsprotokoll beschreibt die Verwendung von NIRF Bildgebung in Gewebe-Simulation Brust Phantome mit fluoreszierenden Tumor-Simulation Einschlüsse ^9. Die Phantome ein kostengünstiges und vielseitiges Werkzeug, um prä-und intraoperativen Tumorlokalisierung, Echtzeit-NIRF-geführte Tumorentfernung, Beurteilung des chirurgischen Marge Status und Nachweis von Resterkrankung simulieren. Die gallertartige Phantome elastische Eigenschaften ähnlich dem menschlichen Gewebe und kann mit üblichen s geschnitten werdenurgical Instrumente. Während des simulierten chirurgischen Eingriffs kann der Chirurg durch taktile Informationen (im Fall von tastbaren Einschlüsse) und visueller Inspektion des Operationsfeldes geführt. Zusätzlich wird NIRF Bildgebung angewendet, um den Chirurgen mit Echtzeitintra Feedback über den Umfang der Operation bereitzustellen.

Es sollte betont werden, dass die NIRF-Bildgebung erfordert die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen. Idealerweise sollten fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden, die Photonen im nahen Infrarotbereich emittieren (650-900 nm), um die Absorption und Streuung von Photonen durch Moleküle im Gewebe physiologisch reichlich zu minimieren (beispielsweise Hämoglobin, Lipiden, Elastin, Kollagen und Wasser) ^10,11. Außerdem Autofluoreszenz (dh die Eigenfluoreszenz-Aktivität in Geweben aufgrund von biochemischen Reaktionen in lebenden Zellen) in dem nahen Infrarotbereich minimiert, wodurch optimale Tumor-zu-Hintergrund-Verhältnisse ^11. Durch Konjugation NIRF färbt tumor TargeTed Einheiten (zB monoklonale Antikörper), können gezielte Abgabe von Fluoreszenzfarbstoffen für die intraoperative Bildgebung Anwendungen gewonnen werden.

Da das menschliche Auge unempfindlich ist im nahen Infrarotbereich Licht, ist eine hochempfindliche Kameravorrichtung für NIRF Bildgebung erforderlich. Mehrere NIRF Bildgebungssystemen für den intraoperativen Einsatz bisher ¹² entwickelt worden. In der aktuellen Studie verwendeten wir eine benutzerdefinierte bauen NIRF Imaging-System, die für die intraoperative Anwendung in Zusammenarbeit mit der Technischen Universität München entwickelt wurde. Das System ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Farbbildern und Fluoreszenzbildern. Um die Genauigkeit der Fluoreszenzbilder zu verbessern, wird ein Korrekturprogramm für Variationen in der Lichtintensität im Gewebe umgesetzt. Eine detaillierte Beschreibung wird von Themelis et al. ¹³

Protokoll

1. Erstellen Sie Silikonformen für Tumor-Simulation Einschlüsse

1. Sammeln feste Materialien in der gewünschten Form und Größe, die als Modelle für die Tumor-Simulation Einschlüsse, zB, Perlen oder Murmeln dienen kann.
2. Die Tumormodelle gründlich reinigen. Um eine einfache Entnahme aus der Silikonform können die Tumormodellen mit Antihaftspray besprüht oder mit einer dünnen Schicht Vaseline oder Wachs überzogen werden.
3. Legen Sie jedes Modell in einer separaten dünnwandige Rechteck (Kunststoff)-Box mit einer glatten Oberfläche. Falls erforderlich, fixieren das Modell auf der Unterseite der Box, um sie in Position zu halten. Verwenden Sie eine Box, die etwas größer als die Tumormodell selbst zu verschwenden übermäßige Mengen von Silikon ist.
4. Die erforderliche Menge von Silikon-Komponente A in eine Schüssel und fügen Silikon Komponente B in einem 10: 1-Verhältnis von Gewicht. Beide Komponenten. Wahlweise kann eine Vakuumpumpe verwendet werden, um Luftblasen aus der Siliconmischung zu entfernen.
5. Sanft pour die Silikonmischung in der Kunststoff-Box von Luftblasen zu verhindern. Das Silicongemisch innerhalb 45 Minuten verarbeitet werden, um optimale Ergebnisse zu erhalten.
6. Lassen Sie die Silikonmischung verfestigen für mindestens 6 Stunden vor dem Schneiden der Form und Entfernen des Tumormodell. Optional kann die Silikonform in einer Zick-Zack-Muster geschnitten werden, damit sie wieder zusammen passen sauber. Maximale Festigkeit des Silicon wird nach 3 Tagen erreicht.

2. Erstellen Tris-gepufferte Kochsalzlösung

1. Erstellung einer Tris-gepufferten Kochsalzlösung (TBS) Lösung durch Zugabe von 6,1 g (50 mM) Tris und 8,8 g (150 mM) NaCl zu 800 ml entionisiertem Wasser.
2. Geben Sie 1,0 g (15 mmol) NaN ₃ zu Oxygenierung des Hämoglobins (Schritt 3.3 und 4.4) zu blockieren und um das Bakterienwachstum zu hemmen. ACHTUNG: NaN ₃ ist eine schwere Gift. Es kann tödlich in Kontakt mit der Haut oder beim Verschlucken. Die Toxizität dieser Verbindung ist vergleichbar mit der löslichen Alkali Cyanide und die letale Dosis für einen erwachsenen Menschenetwa 0,7 g beträgt. Beachten Sie unbedingt die Sicherheitshinweise, wie vom Hersteller bereitgestellt.
3. Den pH-Wert auf 7,4 und bringen das Volumen auf 1.000 ml mit VE-Wasser.

3. Erstellen Fluorescent Einschlüsse

1. 2 g Agarose auf 50 ml TBS mit Schritt 2. Die höheren Schmelzpunkt, verglichen mit Gelatine-Agarose (Schritt 4.2) werden die Einschlüsse von Auflösen und undichte Fluoreszenzfarbstoff, wenn in geschmolzene Gelatine gegeben verhindern. Gegebenenfalls kann die Menge des zugesetzten Agarose 1 oder 3 g geändert werden, um weichere oder tastbaren Tumor Einschlüsse bzw. erhalten.
2. Erhitzen Sie die Agarose-Brei mit Hilfe einer Mikrowelle, bis der Siedepunkt erreicht ist. Gut durchrühren, bis die Agarose vollständig gelöst ist.
3. Fügen 1,1 g (17 mmol) Hämoglobin und 5 ml Intralipid 20% in 50 ml TBS unter konstantem Rühren gelöst, um die Agarose-Mischung, um die optischen Eigenschaften des umgebenden Brustgewebes Phantom (Schritt 4) ähneln.
4. Fügen 20,0 mg (250,8 mmol) des Fluoreszenzfarbstoffs Indocyaningrün auf 83,8 ml VE-Wasser. Sicherstellen, daß der Farbstoff vollständig gelöst ist.
5. Pipette 5,0 ml von dieser Lösung, und es an die Agarose-Mischung hinzu, um eine Endkonzentration von 14 uM erhalten. Gegebenenfalls können andere Fluoreszenzfarbstoffe als ICG falls mit ihren eigenen optimalen Konzentration verwendet werden.
6. Sanft füllen die Silikonformen in Schritt 1 mit der heißen Agarose-Gemisch mit einer Spritze (1A) erzeugt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Formen gefüllt sind.
7. Lassen Sie die Leuchtstoffeinschlüsse erstarren bei RT für etwa eine Stunde. Schützen Sie die Einschlüsse von Licht durch die die gesamte Form mit Aluminiumfolie.
8. Nach dem Erstarren, öffnen Sie vorsichtig die Form, und drücken Sie die Aufnahme (Abbildung 1B). Optional können Sie die Spitze der Spritze, um kleine Tropfen geschmolzener Agarose-Mischung auf der Oberfläche der Aufnahme beantragen. Durch Wiederholen dieses Vorgangs mehrmals an der gleichen Stelle, kleine tumor Sporen können erstellt werden, um infiltrative Tumoren simulieren.
9. Schützen Sie die Agarose-Einschlüsse aus Licht und Austrocknung durch Einwickeln in Aluminiumfolie und speichern sie in einer feuchten Vorratsbehälter bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Verwendung von niedrigeren oder höheren Konzentrationen als Fluoreszenzfarbstoff der bekannten Konzentration optimale Ergebnis werden beide in verminderter Intensität Fluoreszenzsignal. Die scheinbar eingängig Verringerung der Signalintensität mit zunehmender Farbstoffkonzentrationen oberhalb der optimalen Fluoreszenzfarbstoffkonzentration aufgrund eines Phänomens, wie Abschrecken bekannt. Bei der Beurteilung der maximalen Eindringtiefe von einem fluoreszierenden Farbstoff in Phantome, mit der optimalen Konzentration ist erforderlich.

4. Erstellen Brust Phantoms

1. Besorgen Sie sich eine becherförmige Form auf Brust Phantome der gewünschten Größe und Volumen, zB ein Glas oder Kunststoffbehälter zu schaffen. Die Form sollte eine glatte Oberfläche aufweisen, um die Gelatineform zu der Form anhaftet. Eine Form volume von 500 ml an Brustkrebs Phantome von ausreichender Größe zu schaffen.
2. Um eine Brust Phantom mit einem Volumen von 500 ml zu erstellen, fügen Sie 50 g Gelatine 250 Bloom 500 ml TBS (Schritt 2). Wärme die Gelatine Aufschlämmung auf 50 ° C unter konstantem Rühren.
3. Sobald die Gelatine vollständig gelöst ist, können die Gelatinemischung allmählich abkühlen und halten es auf einer konstanten Temperatur von 35 ° C unter Verwendung eines heißen Wasserbades.
4. Unter konstantem Rühren werden 5,5 g (85 mmol) Rinderhämoglobin und 25 ml Intralipid 20%, um die Absorption und Streuung von Photonen in Gewebe zu simulieren sind.
5. Vorkühlung des becherförmigen Form bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde. Neben der Stockgelatinemischung in der Form auf eine Ebene, die zu der vorgegebenen Tiefe des Tumor Agarosegel-Simulation Aufnahme (1C) entspricht. Lassen Sie das Gelatinegemisch verfestigt bei 4 ° C für 30 min bis eine Stunde.
6. Nach dem Erstarren Stellung eine tumor Simulation Fluoreszenz Agarose Aufnahme auf der Oberfläche Das Phantom und vorübergehend fixieren die Aufnahme mit einer kleinen Nadel. Bis zu einem Maximum von drei tumor Simulation Fluoreszenz Einschlüsse in einem Brustphantoms eingearbeitet werden. Ausreichend Platz (mindestens 5 cm) sollte zwischen den einzelnen Tumor-Simulation enthalten (1D) gehalten werden.
7. Gießen des Rests des warmen Gelatinemischung in dem verbleibenden Formvolumens, so dass die Einhaltung der beiden Schichten, ohne Brechung Artefakte. Markieren Sie die Position der fluoreszierenden Tumor-Simulation Einschlüsse auf der Form. Lassen Sie die Phantom erstarren O / N bei 4 ° C.
8. Einmal verfestigte, entfernen Sie die für temporäre Fixierung der Einschlüsse verwendeten Nadeln und entfernen Sie vorsichtig die Brust Phantom von seiner Form (1E). Schutz der Brust Phantom von Licht und Austrocknung durch das Einwickeln in Aluminiumfolie und speichern sie in einer feuchten Vorratsbehälter bei 4 ° C.

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Figur 1 aufeinanderfolgenden Schritte der Schaffung Brust Phantome mit fluoreszierenden Tumor simulierende Einschlüsse. Nachdem Silikonformen von der gewünschten Form und Größe, die Formen mit geschmolzener Agarose-Gemisch mit einer Spritze (A) gefüllt. Tumor-Simulation Einschlüsse unterschiedlicher Größe und Form wurden in der aktuellen Studie (B) hergestellt. Als nächstes wird eine dünne Schicht der geschmolzenen Gelatine-Mischung in einem angepassten beschichteten Holzbrustform (C) gegossen. Nach dem Erstarren werden die Tumor-Simulation Einschlüssen angeordnet ist, vorübergehend fixiert, und mit einer weiteren Schicht aus geschmolzener Gelatine-Mischung (D) bedeckt. Nach dem Erstarren wird das Brustphantom vorsichtig aus der Form (E) entfernt wird. Das Phantom kann dann zur Simulation verschiedener NIRF Imaging-Anwendungen (F) angewendet werden.ref = "/ files / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Stellen Sie die NIRF-Kamera-System

1. Ein NIRF Kamerasystem für die intraoperative Anwendung zur Simulation gezielte NIRF Bildgebung in der Brustkrebs-Operation erforderlich. Mehrere NIRF bildgebende Systeme für Echtzeit-Bildgebung intraoperative NIRF sind derzeit für Forschungszwecke zur Verfügung. Obwohl einige Unterschiede zwischen diesen Geräten vorhanden sind, enthalten sie alle eine Anregungslichtquelle (zur Anregung der fluoreszierenden Tumor Einschlüsse) und eine hochempfindliche Abbildungsvorrichtung zum Erfassen der emittierten Photonen.
2. Achten Sie darauf, eine Anregungslichtquelle eines ausreichenden Wellenlänge zu verwenden. Für die Tumor-Simulation Einschlüsse enthalten ICG, verwenden Sie eine Anregungslichtquelle (zB Laser), die Photonen zwischen 750 und 800 nm emittiert. Wenn eine alternative Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird, sollte die Anregungswellenlänge eingestellt entsprechen den ma werden Anweisungen hersteller ist.
3. Falls die NIRF Kamerasystem enthält einen Emissionsfilter, um unerwünschte Hintergrundsignale, stellen Sie sicher, dass der richtige Filter verwendet wird. Für die Tumor-Simulation Einschlüsse enthalten ICG, verwenden Sie ein Emissionsfilter zwischen 800 und 850 nm auf. Alternative fluoreszierende Farbstoffe können unterschiedliche Emissionsfilter erfordern, je nach Angaben der Hersteller.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es Nullüberdeckung zwischen der Anregung und der Emissionswellenlängen, um übersättigte Bilder zu verhindern. Darüber hinaus kann die Bildaufnahmezeit justiert werden, um eine optimale Fluoreszenzbilder zu erhalten. Im Falle von tief sitzenden Fluoreszenz Einschlüsse oder schwache Fluoreszenzsignale kann die Bildaufnahmezeit bis zu mehreren Sekunden erhöht min. Im Fall von oberflächlichen Einschlüsse oder starke Fluoreszenzsignale kann Akquisitionszeit bis zu mehreren ms verringert werden, um für Video-Rate Fluoreszenz-Bildgebung in Echtzeit zu ermöglichen.

e "> 6. Simulation von NIRF Imaging-Anwendungen in Brustkrebschirurgie

1. Nehmen Sie die Gewebe-Simulation Brust Phantom aus seinem Behälter und legen Sie sie auf eine flache Oberfläche nicht fluoreszierend. Nächsten, positionieren Sie den NIRF Abbildungsgerät über der Brust Phantom, so dass ein ausreichender Arbeitsabstand für Exzision der Tumor-Simulation Einschlüsse.
2. Lokalisierung des Tumors-Simulation mit fluoreszierenden Einbeziehung NIRF Bildgebung und / oder Palpation der Phantom Brust. Falls kein Fluoreszenzsignal detektiert werden kann, wird die Aufnahme entweder zu tief im Phantom für die Detektion oder die Bildgewinnungszeit zu erhöhen positioniert.
3. Sobald die Aufnahme lokalisiert ist, einschneiden die Phantom Brust und entfernen den Tumor-Simulation der Einbeziehung in die Echtzeit-NIRF-Führung mit konventionellen chirurgischen Instrumenten. Alternativ kann die Aufnahme, kann ausgeschnitten allein durch visuelle Inspektion und Abtasten der Brust Phantom geführt werden, um den Standard-of-Care zu simulieren.
4. Direkt nach der Entnahmedes Tumor-Simulation Eingliederung, Bild der Operationshöhle für jede verbleibende Fluoreszenzaktivität anzeigt unzureichende Exzision.
5. Im Falle einer verbleibenden Fluoreszenzaktivität, Verbrauchs die Aufnahme Rest unter direkter Anleitung NIRF bis kein Fluoreszenzsignal übrig ist.
6. Bild die ausgeschnittenen Phantom Fragmente NIRF geführte makroskopische Marge Zustandsbewertung zu simulieren. Hierzu schneiden die Phantom Gewebe in 3-5 mm Platten und Bild die Plaques entsprechend. Fluoreszenzsignal bis in den operativen Margen weist auf die Existenz von positiven operativen Margen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieser Studie wurden bereits an anderer Stelle ⁹ gemeldet.

Unsere Daten zeigen, dass NIRF Bildgebung angewendet, um fluoreszierende Tumor-Simulation Einschlüsse in Gewebe-Simulation Brust Phantome zu erkennen, die Simulation NIRF geführte brusterhaltende Operation bei Patientinnen mit Brustkrebs werden. Mit unserem Phantommodell fanden wir intraoperativen Tumorlokalisation, NIRF geführte Tumorentfernung, intraoperative Beurteilung der Operationshöhle Ränder, un...

Diskussion

Wir simulieren mögliche klinische Anwendungen der NIRF-BCS geführt durch die Verwendung von Brust-förmigen Phantome mit integrierter Tumor-Simulation Einschlüsse. Intraoperativen Tumorlokalisation, NIRF geführte Tumorentfernung, Bewertung über das Ausmaß der Operation und der postoperativen Beurteilung der operativen Margen wurden alle gefunden machbar mit einem individuell bauen NIRF Kamera-System. Nichtinvasiven Nachweis von fluoreszierenden Tumor simulierende Einschlüsse nur für Einschlüsse im Phantom Geweb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine hemoglobin	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	H2500	Simulates absorption of photons in tissue
Intralipid 20%	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	I141	Simulates scattering of photons in tissue
Silicone A translucent 40 (2-components poly-addition silicone)	NedForm, Geleen, The Netherlands		Package consists of components A and B, that should be mixed one on one (A:B=10:1).  Link to manufacturers page: http://tinyurl.com/ncjq7jx
Gelatine 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	48724	Construction of breast-shaped phantoms
Agarose	Hispanagar, Burgos, Spain		Construction of tumor-simulating inclusions
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, Germany	822335	CAUTION: severe poison. The toxicity of this compound is comparable to that of soluble alkali cyanides and the lethal dose for an adult human is about 0.7 grams.
Examples of NIRF imaging devices for intraoperative application:
T2 NIRF imaging platform	SurgVision BV, Heerenveen, The Netherlands		Customized NIRF imaging system used in the current study. More details available at www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, Germany	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE imaging system kit	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, USA		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, France		www.fluoptics.com
Artemis handheld camera	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, the Netherlands		www.quest-mi.com
Examples of NIRF fluorescent dyes for intraoperative application:
Indocyanine green	ICG-PULSION,  Feldkirchen, Germany	PICG0025DE	Clinical grade fluorescent dye for NIRF imaging used in the current study. More details available at www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA	929-70021	www.licor.com