Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Zusammenfassung

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Zusammenfassung

Die meisten morphogenetische Prozesse in der fetalen Darm haben von Dünnschnitten von fixierten Gewebe entnommen worden, die Bereitstellung Schnappschüsse von Veränderungen über die Entwicklungsstadien. Dreidimensionale Informationen aus dünnen Serienschnitten kann eine Herausforderung sein, wegen der Schwierigkeit der Rekonstruktion Serienschnitte perfekt und die Aufrechterhaltung der richtigen Ausrichtung des Gewebes über Serienschnitte zu interpretieren. Jüngsten Erkenntnisse Grosse et al., 2011, die Bedeutung der dreidimensionalen Informationen für das Verständnis der Morphogenese der Entwicklungs Zotten des Darms ^1. Dreidimensionale Rekonstruktion des einfach markierten Darmzellen zeigte, dass die Mehrheit der intestinalen Epithelzellen treten sowohl die apikale und basale Oberflächen. Weiterhin dreidimensionale Rekonstruktion des Aktin an der apikalen Oberfläche des Epithels zeigte, dass die Darmlumen kontinuierlich ist und dass die sekundäre Lumen ein Artefakt sectioning. Diese zwei Punkte, zusammen mit dem Nachweis der interkinetic Kernwanderung im Darmepithel, definiert die Entwicklungs Darmepithel als mehrreihigen Epithel und nicht wie bisher angenommen geschichtete ^1. Die Fähigkeit, das Epithel dreidimensional beobachten war wegweisend für demonstriert diesen Punkt und die Neudefinition epithelialen Morphogenese in der fetalen Darm. Mit der Entwicklung der Mehrphotonen-Bildgebungstechnik und dreidimensionale Rekonstruktionssoftware, die Fähigkeit zu visualisieren intakt Entwicklungsorgane rasch verbessert. Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht weniger schädliches Eindringen tiefer in Gewebe mit hoher Auflösung. Zwei-Photon-Imaging und 3D-Rekonstruktion der gesamten fötalen Mausdarm in Walton et al., 2012, half, das Muster der Zotten Auswuchs ² definieren. Hier beschreiben wir eine ganze Organkultursystem, das ex vivo Entwicklung der Zotten und Erweiterungen dieser Kultur-System ermöglicht, damitder Darm dreidimensional in ihrer Entwicklung dargestellt werden.

Einleitung

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells³. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes¹. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons⁴. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium^2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.5². As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue⁶.

Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens^7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters¹¹. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence^2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.

Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

Protokoll

HINWEIS: Alle Mäuse wurden mit human Protokolle, die von der University of Michigan Medical School Einheit für Labortiermedizin zugelassen und nach den Richtlinien der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren behandelt.

1. Vollorgankultursystem

1. Herstellung der Medien und Kulturplatten
   1. In einer Gewebekultur Haube, entfernen 5 ml BGJb Medien aus der Flasche und 5 ml Pen / Strep. Bereiten Sie einen Arbeitsvorrat von Medien in einem 50 ml konischen Röhrchen, durch Zugabe von 1 ml 5 mg / ml Ascorbinsäure bis 49 ml BGJb Medien (mit Pen / Strep).
   2. Bereiten Sie eine 6-Loch-Kulturplatte durch Zugabe von 1 ml unter jedem der Transwells.
      HINWEIS: Wenn alle 6 Transwells nicht verwendet werden, bewegen zusätzlichen Transwells in eine frische sterile 6-Well-Platte für die spätere Verwendung. 3 ml Arbeits BGJb Medien zu jedem der drei 10 cm sterile Petrischalen.
2. Vorbereitung für die Präparation
   1. Weichen Sie sezieren Tools in 70% Ethanolnol und sicher sein, die Werkzeuge sauber zu halten, während der Arbeit.
   2. Einrichten der Sektionsbereich mit einem großen Eiskübel und platzieren Sie den 6-Loch-Kulturplatte und 10 cm Petrischalen mit BGJb Medien auf Eis. Arbeiten auf Eis, so viel wie möglich, während sezieren und die Vorbereitung der Darm für die Kultur.
   3. Betäuben erwachsenen weiblichen Mäusen in einer Kammer mit Isofluran (100 ul) vor der Euthanasie durch Genickbruch für die Ernte der fetalen Darm.
   4. Nach der Ernte der Föten von ihrer Mutter, zu inszenieren jeder Fötus sorgfältig nach dem Theiler Inszenierung Grafik ^13. An den Tagen Verlassen Sie sich nicht nach dem Koitus auf das Alter des Fötus als Variationen von bis zu 24 Stunden in Entwicklungsstufe werden routinemäßig in einem einzigen Wurf beobachtet zu bestimmen.
3. Dissektion der fetalen Darm
   1. Euthanize Föten durch Enthauptung vor der Entfernung der Eingeweide.
   2. Sezieren jeden Darm in 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) und dann place es in eine 10 cm Petrischale mit Arbeits BGJb Medien.
   3. Die Milz aus dem Magen und die Bauchspeicheldrüse aus dem Magen und Zwölffingerdarm oberen vorsichtig entfernen.
   4. Trennen Sie vorsichtig das Netz darauf achten, dass die Netz so weit wie möglich und Trenn Verbindungen nur genug befestigt lassen, damit der Darm begradigt werden.
      HINWEIS: Für Darm älter als E14.5 oder den Personen, die länger als 24 Stunden kultiviert, sanft trennen den Darm in 3 gleich große Segmente zu ermöglichen luminalen Inhalte durch den Darm fließen und von den Schnittenden ausgeschlossen werden. Für Kulturen begannen vor E13.5 warten, bis nach 24 h der Kultivierung vor Abtrennen der 3 Segmente des Darms, damit der Serosa ordnungsgemäß über die Länge des Darms wachsen.
   5. Verwenden Sie einen Mund pipettieren, um die Darmstücke auf die Transwells von der Kulturplatte (1.1.2) zu übertragen.
   6. Vorsichtig positionieren den Darm nach Bedarf, so dass sie gerade über die transwell.
      Hinweis: Wenn der Darm beginnen, sich luminalen Inhalte durch die Röhre, werden alle Knicke im Darm ein Backup und eine Beschädigung des Darmes führen.
4. Kultur und Behandlung
   1. Entfernen Sie die Medien unter dem Transwell, fügen Sie 700 ul der Behandlung Medien (Arbeitsmedien mit Mehr rekombinanten Proteinen oder pharmakologische Inhibitoren) im Rahmen des Transwell.
   2. Fügen Sie 300 ul Behandlungsmedien tropfenweise auf der Oberseite des Darms und lassen Sie es durch die Transwell einweichen. Positionieren Sie den Darm wie nötig.
   3. Ändern Behandlungsmedien mindestens einmal täglich oder öfter in Abhängigkeit von der Halbwertszeit des Behandlungs Reagenz.
5. Herstellung von Protein-Agarose-Kügelchen eingeweicht für eine lokalisierte Quelle der Behandlung Reagenz
   1. Resuspendieren der Agarose in ihren Vorratsbehälter und dann 100 ul Agarosekügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Füllen Sie die restliche Volumen des Rohres mit sterilem 1x Phosphate Kochsalzlösung (PBS) und mischen Sie die Perlen, um sie zu waschen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Rack für ein paar Minuten, damit die Perlen am Boden absetzen und dann pipettieren Sie das PBS von oben auf den Perlen. Füllen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit sterilem 1x PBS und zweimal wiederholen Sie den Waschprozess.
   3. Vorbereitung für das Protein von Interesse auf das Zweifache der für die Behandlung gewünschten Konzentration.
   4. Mischen 5 ul gewaschenen Agarose-Kügelchen mit 5 ul der Protein 2x Lager und sanft schütteln die Perlen in das Protein. Das Röhrchen auf Eis für 1 h, vorsichtiges Mischen alle 10-15 min.
   5. Spülen Sie die Perlen kurz in sterilem 1x PBS, bevor Sie die Perlen auf den Darm.
6. Platzierung von Agarose-Beads
   1. Sanft legen Sie die Agarose-Kügelchen auf der Oberseite der Darm mit Hilfe eines mit dem Mund pipettieren gezogen Kapillarnadeln. Legen Sie die Perlen mit äußerster Vorsicht als grobe Behandlung wird den Darm beschädigen und zu verhindern villus Entwicklung in den verletzten Bereich.
   2. Legen Sie doppelt so viele Perlen wie für die Analyse benötigt werden, da der Darm wird peristaltische Bewegungen und etwa die Hälfte der Perlen gelegt wird weg von den Darm über die Kultivierungszeit rollen zu unterziehen.
7. Fixierung von kultivierten Darm
   1. Die Behandlungsmedien vorsichtig aus unterhalb des Transwell und lassen den Darm an der Luft trocknen für 3 min.
   2. 1 ml Fixativ unter der Transwell für 2 min, dann decken die Spitze der Darm mit 2 ml Fixiermittel für den Rest der Fixierungszeit. Fix mit 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C oder für 2 Stunden bei RT.

2. Imaging von Fest Darm

1. Wholemount-Bildgebung
   1. Stelle sämtliche Darm (mit endogenen Fluoreszenz) auf einem Objektträger mit 100 ul 1x DPBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig arrangieren den Darm.
   2. Verwenden Sie ein Labor Gewebe vorsichtig die DPBS und sofort 100 l 70% Glycerin, um das Gewebe zu machen mowieder transparent und erhöhen die mögliche Tiefe der Bildgebung.
      HINWEIS: Wenn ein weiteres Eindringen des Darms gewünscht wird, statt die Montage der Darm in 70% Glycerin, genießen den Darm in ein paar Tropfen von Focus Klare Lösung für 10-30 min. Pipettieren Sie den Fokus Klare Lösung und montieren Sie den Darm mit dem Berg Klar.
   3. Tauchen Sie jede der vier Ecken eines Deckglases in Knetmasse und holen Sie eine kleine Menge von Ton zu als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas zu verwenden, um das Deckglas aus Abflachung der Darm zu halten.
   4. Deckglas auf den Objektträger mit geschmolzenem VALAP mit einem Wattestäbchen aufgetragen.
   5. Bild der Darm entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details.
2. Vibratom Schnitte von Fest Darm (zum Querschnitt der Darmstrukturen)
   1. Einbetten Darm in 7% Agarose in kleinen Kunststoffformen (10 x 10 x 15 mm) und damit die Agarose-Blöckeabkühlen und sich verfestigen.
   2. Entfernen Agarose-Blöcke aus den Kunststoffformen und Leim Agarose-Blöcke auf die Sammlung Vibratom Bühne mit Sekundenkleber.
   3. Füllen Sie die Sammelphase mit eiskaltem 1x DPBS.
   4. Zuschnitte mit einer Dicke zwischen 100-150 um. Bei dickeren Abschnitte verwenden Clearing-Lösungen (in Abschnitt 2.1.2 beschrieben) tiefer in den Querschnitt zu visualisieren.
   5. Pour Vibratom Abschnitte der Sammelstufe in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Lagerung bei 4 ° C ist.
3. Immunfluoreszenzfärbung von festen, Vibratom geschnitten Gewebe
   1. Zeigen 5-12 Vibratom Abschnitte pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit 1x DPBS.
   2. 1x DPBS entfernen und fügen 500 ul Permeabilisierung Lösung pro Vertiefung. Schaukeln die Proben für 25 min bei RT.
   3. Nach Permeabilisierung, waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS 1x.
   4. Block die Proben für mindestens 30 min in 500 ul Blockierungslösung.
   5. Nach dem Blockieren exchange der Blockierungslösung mit 500 ul primäre Antikörper verdünnt in Blockierungslösung und halte die Proben bei 4 ° CO / N.
      HINWEIS: Die primären Antikörperverdünnungen, die auf gefrorenen und Paraffinschnitten gut funktionieren in der Regel gut auf Vibratom Abschnitte zu, jedoch erfordern Antikörper im Kern Antigen-Retrieval in der Regel nicht gut mit diesem Protokoll (zB BrdU) zu arbeiten.
   6. Am folgenden Tag, waschen Sie die Proben 3 mal für 15 min mit je Blockierlösung.
   7. Nach dem Waschen anzuwenden 500 ul des sekundären Antikörpers in Blockierlösung verdünnt. Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Alufolie, um die Fluorophore von Licht für 45 min bei RT schützen und rocken die Proben 2 Stunden.
   8. 3 mal waschen die Proben mit 1x PBS für jeweils 15 min und montieren Sie die Vibratom Abschnitte auf Objektträger, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben.
4. Montage Vibratom Abschnitte
   1. Bereiten Sie Folien für Vibratom Montage durch Schneiden von dünnen Scheiben der Doppel-stick Band und indem sie entlang der langen Seiten der Folien.
   2. Vorsichtig 5-10 Vibratom Abschnitte zwischen dem doppelseitigem Klebeband auf den Folien in einem Tropfen von 100 ul 1x PBS.
   3. Entfalten alle Abschnitte und breitete sie in einer einzigen Schicht über die Rutsche.
   4. Entfernen Sie überschüssiges Agarose oder unebenen Bits, die einen Deckglas aus dem Sitzen Flach verhindern würde.
   5. Sorgfältig einen Labor Gewebe aus der ganzen Vibratom Abschnitte tanken überschüssige 1x PBS.
   6. Fügen Sie einen Tropfen wässrigen Eindeckmedium auf der Oberseite der Vibratom Abschnitte und dann das Deckglas.
   7. Verschließen Sie die Deckgläser auf die Objektträger mit zerlassener VALAP angewendet mit einem Wattestäbchen.
   8. Bild die Vibratom Abschnitte entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details zur Auswahl eines Abbildungssystems beziehen.

3. Live-Imaging von Whole Darm

Darm von fetuse geerntets nach E12.5, mit dem angeschlossenen Netz intakt gelassen, erfolgreich zu entwickeln Zotten in Kultur unter Verwendung der oben System. Daher ermöglicht diese ex vivo-System die Erfassung von lebenden z-Schnittbilder der Entwicklungs Darm, die eine dreidimensionale Ansicht der Morphogenese im Laufe der Zeit wieder aufgebaut werden kann.

1. Einrichten Live-Bildgebung
   1. Sekundenkleber verwenden, eine individuelle Polycarbonatmembran auf ein feinmaschiges Sieb zu halten. Dies bietet eine Unterstützung Gerüst, um den Darm an Ort und Stelle unter dem Eintauchen Linse des konfokalen Mikroskop aufrecht zu halten. Bitte beachten Sie die Diskussion Abschnitt für weitere Details über die Auswahl der Live-Bildgebung Mikroskope beziehen.
   2. Legen Sie die Mesh-Bildschirm in der Mitte und einer Kulturplatte.
   3. Legen Sie die seziert Darm auf die Polycarbonatmembran und einen Tropfen Sekundenkleber an jedem Ende. Verwenden Sie nur ausreichend Leim, um den Darm zu befestigen, aber nicht überziehen es!
   4. Fügen Kulturmedien frei von Phenol-Rot unter dem PolycarbonatMembran in der Mitte und von der Kulturplatte.
   5. Wasser hinzufügen, um den äußeren Rand der Kulturplatte gegen Feuchtigkeit bieten.
   6. Da die fötalen Darm erfährt peristaltische artige Kontraktionswellen in der Kultur wird mit 100 ul einer 1: 5-Lösung von Xylazin in 1x PBS bis 3 ml Medium, um die Bewegung des Darmes während Abbildungs ​​steuern. Diese Dosierung wird Darmbewegungen für etwa 8-10 Stunden ohne Kompromisse villus Entwicklung steuern.
   7. Für eine Queransicht des Darms, die Live-Darm einbetten in einer 3-4% igen Lösung und schneiden dicke Abschnitte (150-500 um) auf einem Vibratom. Entsprechen die Steifigkeit der Agarose mit der Steifigkeit des Darms geschnitten und empirisch ermittelt die Entwicklungsstadium. Im Allgemeinen wird eine 3% Agarose-Lösung eignet sich gut für Darm jünger als E14.5 und eine 4% ige Lösung funktioniert gut für Darm E15-E16.
   8. Kleben Sie die Vibratom Abschnitte, um eine Polycarbonatmembran mit einem Mesh-Sieb angebracht (wie in Abschnitt 3.1.1) undKultur, wie in Abschnitt 3.1.2-3.1.6 beschrieben.
   9. Führen die Echtzeit-Bildgebung unter Verwendung einer Zwei-Photonen konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser zwischen 690-1,040 nm) an einem aufrechten Ständer mit einem abstimmbaren Tabelle.
   10. Zwei-Photonen-Laser bis 900 nm tiefe Penetration mit der besten Auflösung für GFP-Signale bietet abgestimmt. Es reduziert Schäden an Geweben während Imaging. Darüber hinaus die Einstellung der Leistung des Lasers auf das geringstmögliche Emissions verringert Gewebeschäden. Typischerweise, um eine gute Anregung von GFP zu erhalten, verwenden 12% der Leistung auf der Zwei-Photonen-Laser.

Ergebnisse

Kultur ganzer fötaler Explantate Darm ermöglicht die Analyse der Lage, die Verteilung, und die Dauer der Signalmoleküle, die Darmentwicklung zu koordinieren, da dieses System ermöglicht die Bearbeitung der Signalisierungs pharmakologische Reagenzien oder rekombinante Proteine. Die Transwell-Kultursystem (1A, von Walton et al wiedergegeben., 2012) ² stellt ein Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle, die es ermöglicht, Wirkstoff-oder Protein getränkt Agarosekügelchen auf das Gewebe zu...

Diskussion

Die Dynamik und komplexe Gewebe-Wechselwirkungen der Entwicklungs Darm erfordert 3D-Visualisierung, um eine volle Anerkennung dieser morphogenetischen Ereignisse. Mit der Entwicklung der Imaging-Technologie, die Fähigkeit villus Morphogenese im Detail entwickelt / verbessert und mit ihr wird das Verständnis der räumlichen Kommunikation und Interaktion während der Organogenese stark verbessert zu prüfen.

Alternative Methoden zur Kultivierung ganze Darm wurden auch getestet worden, aber d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	2 pairs
70% Ethanol
1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14040-133	500 ml
6 well plates	Costar	3516
24 well plates	Costar	3524
60 x 15 mm petri dishes	Falcon	451007
Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes	Corning Costar	3428	6 inserts per plate
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)	Gibco	15140
Ascorbic Acid	Sigma	A0278	make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C
Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)	Fisher	21-180-10	remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.
6 inch glass pasteur pipets
Capillary Tubes	World Precision Instruments	TW100F-4	pull to needles
4% Paraformaldehyde			made in 1 x PBS, pH to 7.3
Culture plates	Falcon	353037
Fine mesh stainless steel screen	purchase at hardware store
Polycarbonate membranes	Thomas scientific	4663H25	alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports
Instant glue	purchase at hardware store	gel based preferrably
35 x 10 mm plates	Falcon	351008
7% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
minutien pins	Fine Science Tools	26002-20
Phenol red free media (DMEM)	Gibco	21063-029
Xylazine (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free
3-4% agarose	Sigma	A9414	prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath
Imaging of fixed intestines
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
vaseline	purchase at pharmacy		used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
lanolin	Sigma	L7387	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
paraffin	Surgipath	39601006	used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin
70% glycerol in 1 x PBS
Focus clear and Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Modeling clay	purchase at art supply store
double stick tape
cotton applicator swabs
plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tissue Tek	4565
slides
coverslips
lab wipe	Kimberly Clark	34155	lint free delicate task wipe
Theiler staging chart			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Leica SP5X confocal microscope	Leica		Used to conduct the live imaging
Leica DMI 6000 stand	Leica		Used to conduct the live imaging
Aqueous mounting medium (Prolong Gold)	Molecular Probes	P36930
Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
24 well plate	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS
Goat serum			used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS
Tween20	Sigma	P9416