Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Zusammenfassung

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Zusammenfassung

NG2-exprimierenden Zellen (polydendrocytes, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen) sind die vierte große glialen Zellpopulation im zentralen Nervensystem. Während der embryonalen und postnatalen Entwicklung sie aktiv vermehren und erzeugen myelinisierenden Oligodendrozyten. Diese Zellen haben häufig in der Grund dissoziiert Kulturen, Neuron Kokulturen untersucht worden, und in fixiertem Gewebe. Mit neu verfügbaren transgenen Mauslinien schneiden Kultursysteme können verwendet werden, um die Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozyten-Linie Zellen in beiden grauen und weißen Substanz Regionen des Vorderhirns und des Kleinhirns zu untersuchen. Schnittkulturen sind aus der frühen postnatalen Mäusen hergestellt und in Kultur für bis zu 1 Monat gehalten. Diese Scheiben kann mehrfach über die Kulturzeit abgebildet werden, um das Zellverhalten und Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von NG2 Zellteilung und die Schritte, die zu Oligodendrozyten-Differenzierung und ermöglichen detaillierte Analyse der Region-abhängigent NG2 Zelle und Oligodendrozyten funktionelle Heterogenität. Dies ist eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden können, um die innere und äußere Signale in einer zellulären Umgebung, die sehr ähnlich, die in vivo gefunden Beeinflussung dieser Zellen mit der Zeit zu untersuchen.

Einleitung

Organoytpic Schnittkulturen des zentralen Nervensystems haben sich als sehr nützlich für das Studium Neuron und Glia Zellbiologie in semiintact System ^{1 - 4.} Diese Kulturen sind relativ einfach zu übernehmen und behalten viele Vorteile der primären dissoziierten Zellkulturen, wie Manipulationen der die extrazelluläre Umgebung und einfachen Zugang für wiederholte langfristige Live Cell Imaging und elektrophysiologischen Ableitungen ^5-9. Außerdem Schnittkulturen pflegen 3-dimensionalen Gewebe Zellarchitektur, regionalen neuronalen Konnektivität, und die meisten großen Zelltypen in dem System vorhanden sind. Diese Eigenschaften machen diese Kulturen ein einzigartiges und bequemes System zur Einzelzellverhalten und Physiologie mit zellulären und Umweltwechselwirkungen zu untersuchen.

NG2 Zellen eine Population von Gliazellen im Zentralnervensystem von Säugetieren, die zur Proliferation und erzeugen weiterhin myelinating Oligodendrozyten während der embryonalen und postnatalen Entwicklung ^10. Sie sind ausführlich in dissoziierten primären Zellkulturen untersucht, und die jüngsten Entwicklung transgener Mauslinien mit NG2 zellspezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen in vivo Schicksal Mapping und elektrophysiologische Ableitungen im spitzen Schnittpräparate erleichtert. Auch bei diesen Studien ist wenig über die zeitliche Dynamik der NG2 Zellproliferation und Differenzierung Oligodendrozyten bekannt. Obwohl dissoziierten Zellkultur in großem Umfang zur relativen Anlage in pharmakologischen und genetischen Manipulationen verwendet werden, ist es nicht geeignet für die Abfragefunktionsunterschiede dieser Zellen in verschiedenen Hirnregionen insbesondere wenn es wünschenswert ist, den Rahmen der zellulären Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Schnittkulturen bieten eine einfache Alternative, die zugänglich für pharmakologische Manipulationen ist und verwendet worden, um Oligodendrozyten Myelinisierung ^11,12 untersuchen, Zelldere Reaktion nach Lysolecithin (LPC) oder Antikörper-induzierte Demyelinisierung ^13,14, und die Induktion von Remyelinisierung über pharmakologische Behandlung ^15.

Ein Verfahren zur Untersuchung und Analyse von NG2 führen Zellproliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten organotypischen Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn getroffen wird beschrieben Live-Bildgebung und fixiertem Gewebe (oder Nachfixierung). Dies ist eine leistungsfähige Methode, die verwendet werden können, um die Zelle Schicksal der einzelnen Zellen nach NG2 Abteilung ¹⁶ zu studieren und regionale und altersabhängige Unterschiede in der Wachstumsfaktor induzierte Proliferation NG2 ¹⁷ entdecken. Diese relativ einfache Technik ist allgemein zugänglich, weiter zu untersuchen Zelle intrinsischen und / oder Umweltregulierungsmechanismen die Physiologie dieser Gliazellen und ihre Reaktion auf die neuronale Aktivität oder Myelinschäden.

Protokoll

HINWEIS: Alle Tierverfahren werden nach den Richtlinien und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von Connecticut genehmigt worden.

HINWEIS: Für diese Experimente konstitutive NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) und induzierbare NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) transgenen Mäusen gekreuzt, um Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) oder gtRosa26: YFP Reporter ²⁰ (JAX # 006148) Leitungen, die jeweils verwendet wurden Bild zu NG2 Zellen und deren Nachkommen. Um das Bild zu reifen Oligodendrozyten wurden PLPDsRed transgenen Mäusen ²¹ verwendet. Für eine konsistente Überlebens, können Scheiben von Mäusen bis zu postnatalen Tag 10 sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn isoliert werden.

1. Scheibe Vorbereitung

1. In einer Kultur, Haube, legen Gewebekulturplatten in sechs Well-Platten und 1 ml Scheibe Kulturmedium (Rezept in Reagenzien Abschnitt). Platzieren Sie die Platten in Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO ₂ bei mindestens 2 h vor der Sektion.
2. Sterilisieren alle Werkzeuge und Gewebe Chopper mit 70% Ethanol.
3. Blasen Dissektion Puffer (Rezept Reagenzien Schnitt) mit 95% O _2, 5% CO ₂ auf Eis für mindestens 15 Minuten vor dem Beginn der Präparation.
4. Betäuben Maus Welpen, indem sie auf Eis für 5-10 min nach anerkannten Tier Protokolle. Ermitteln Sie die geeignete Narkosetiefe durch die Bestätigung, dass die Mäuse nicht bis zum Schwanz und Zehen Kneifen reagieren.
5. Enthaupten Tiere mit einer scharfen Schere folgenden Tier Protokolle. Entfernen Sie schnell den Schädel über dem Vorderhirn und Kleinhirn, indem zuerst eine sagittale Schnitt, gefolgt von seitlichen Schnitt, mit sterilisierten Werkzeugen. Geschnitten Hirnnerven von der ventralen Oberfläche des Gehirns und des Kleinhirns durch vorsichtiges Aufrollen des Gewebes an der Seite.
6. Zeigen Gewebe in einem sterilen 35 mm Schale mit eiskaltem sauerstoffhaltigen Dissektion Puffer.
7. Mit einer Rasierklinge, trennen das Kleinhirn und Vorderhirn. Dann machen Sie eine Mitte-Sagittalschnitt through das Vorderhirn und Kleinhirn, die Trennung der Hemisphären.
8. Schneiden Sie 300 um dicke koronale und sagittale Abschnitte des Vorderhirns und des Kleinhirns mit einem manuellen Gewebe Chopper. HINWEIS: Ein Handbuch Gewebe Chopper ermöglicht die schnelle Verarbeitung von Präparation zu Kultur Inkubation ohne die Notwendigkeit für Agarose-Einbettung. Ein Vibratom kann auch eingesetzt werden, wie zuvor ⁹ beschrieben.
9. Übertragen getrennt Scheiben in frisch sprudelte kalte Dissektion Puffer auf Eis.
10. Verwenden Sie kleine Sezieren oder einem Gewicht von Spachteln, einzelne Teile zu trennen und sie auf sechs und Gerichte mit Kultureinsätze vorinkubiert.
11. Überschüssiges Dissektion Puffer von der Oberfläche des Kultureinsatz mit einer Einwegübertragungspipette oder eine P 200 Pipettenspitze. Zwei bis drei Vorderhirn oder drei Kleinhirnscheiben können auf einem Kultureinsatz platziert werden.
    HINWEIS: Für die konsistente Ergebnisse mit Vorderhirn Kulturen, ist es ideal, um Scheiben nehmen überspannt den vorderen Drittel des Corpus callosum(1A), um die beiden grauen und weißen Substanz Regionen in der gleichen Schicht zu untersuchen. Jedes Tier erhält man in der Regel 6 Scheiben Vorderhirn und Kleinhirn 6 Scheiben schneiden.
12. Legen Sie die sechs Well-Platten im Brutschrank und mit 1 ml Medium Scheibe 1 Tag nach Schnittpräparat und dann jeden zweiten Tag, bis Scheibe Fixierung ersetzen Sie die Scheibe Medium.
13. Je nach Experiment, verwenden Scheiben nach 5-7 Tagen in Kultur. Verwenden Sie nur Scheiben, die transparent nach den ersten paar Tagen geworden, und entsorgen Sie die, die unebenen opaken Bereichen haben. HINWEIS: Opaque Regionen innerhalb Scheiben sind mit dem Auge sichtbar und erscheinen als ein Klumpen von dunklen Zellen unter Phasenkontrast. Nachdem die Technik bewältigt wurde, auftreten tot undurchsichtigen Scheiben selten, in weniger als 1-5% der Scheiben.

2. Time-Lapse-Imaging von NG2 Zellteilung und Differenzierung der Oligodendrozyten

HINWEIS: Um Zeitraffer Bildgebung von NG2 Zellproliferation und Differenzierung führen wir verwenden NG2cre: ZEG-Mäusen ¹⁶die EGFP exprimieren in NG2 Zellen und deren Nachkommen (1C-E). Reporterexpression in dieser Zeile ist ausreichend robust, um Live-Bilder der GFP +-Zellen in Scheiben unmittelbar nach Schneiden für einen Zeitraum von mindestens vier Wochen erhalten. Die deutlichsten Bilder werden nach der ersten Durchforstung Zeit der Scheibe, die sich in den ersten 3-5 Tagen in Kultur anfällt.

1. Während des Experiments halten die Scheiben in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C, und entfernen Sie nur für kurze Zeit (weniger als 15 min pro Scheibe), halten den Deckel auf die sechs Well-Platte, während Bildgebung.
2. Mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalkamera ausgerüstet ist, zu erfassen Bilder von dem ersten Zeitpunkt mit einem 10X-Objektiv. HINWEIS: Zum ersten Mal Punkte werden durch das Experiment variieren und können den Tag, wenn die Scheiben hergestellt wurden oder einen Zeitpunkt nach sein.
3. Machen Sie Bilder von mehreren Regionen zum Zeitpunkt einer in beiden grauen und weißen Substanz Bereiche der Scheibe. Hinweis the Region durch spezifische Sehenswürdigkeiten innerhalb der Scheibe und durch die Abbildung die Lage des Bildes auf einem Schema, das für nachfolgende Imaging-Sitzungen verwendet werden können, abgebildet. Nützlich Sehenswürdigkeiten können Kanten der Scheiben und / oder Orientierung von der weißen Substanz enthalten. Bild vier Minuten vor acht Stellen auf jeder Scheibe zu jedem Zeitpunkt.
4. Erfassung nachfolgender Bilder in einem Intervall von 4-6 Stunden, wenn die Prüfung NG2 Zellteilung und Differenzierung Oligodendrozyten, idealerweise über 5-7 Tage.
5. Nehmen Sie ein endgültiges Bild von allen Regionen und fixieren die Scheiben sofort. 1 ml der Fixierlösung (4% PFA mit 0,1 M L-Lysin 0,01 M Natriummetaperiodat), um den Boden des Kultureinsatz, dann fügen Sie eine weitere 1 ml oben auf den Scheiben. Achten Sie darauf, die direkt auf dem Fixiermittel Scheibe spritzen, wie es aus der Membran zu lösen. Befestigen Sie das Gewebe für 30 Minuten und fahren Sie mit der Immunhistochemie mit Entwicklungsstadium spezifische Marker, wie in Kapitel 4 beschrieben.
6. Wasch Scheiben mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer 3 x 10 m. Wenn nötig, speichern Scheiben bei 4 ° C in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer für 1-3 Tage vor Immunfärbung durchzuführen, sondern im Idealfall innerhalb von 24 Stunden. Fahren Sie mit der Immunhistochemie, wie unten in Abschnitt 4 beschrieben, den Anteil der Zellen, die in Oligodendrozyten (2D-F) differenziert sind, zu bestimmen.

3. Fate Mapping von NG2 Zelle Nachkommen Mit induzierbare Reporter transgenen Mäusen in Schnittkulturen

HINWEIS: Um das Schicksal von NG2 Zellen aus einem bestimmten Zeitpunkt in der Kultur zu verfolgen, induzierbare NG2creER: kann YFP transgenen Mäusen verwendet werden.

1. Cre die Rekombination zu induzieren und Reporter-Expression durch Zugabe von 100 nM 4OHT in Ethanol zu dem Kulturmedium gelöst. HINWEIS: Reporter-positiven Zellen sollte innerhalb von 1-2 Tagen bei einem Induktionseffizienz von ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 +-Zellen und zu diesem Zeitpunkt erscheinen alle Zellen an der NG2-Zell-Stadium (Abbildung 2a-c)
2. Fix und waschen Sie die Scheibeen zu verschiedenen Zeitpunkten nach unterschiedlichen Manipulationen (in den Abschnitten 2.5 und 2.6 beschrieben).

4. Scheibe Immunhistochemie

1. Schneiden Sie die Membranen mit den Scheiben aus den Einsätzen mit einem Skalpell angebracht.
2. Übertragen Scheiben auf einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem Satz von Pinzetten, kümmert sich nicht um die Zusammensetzung der Scheibe stören bei der Abholung der Membran.
3. Transfer der Scheiben zu einer Platte mit 24 Vertiefungen mit Blockierungslösung, die 5% normales Ziegenserum (NGS) und 0,1% Triton-X100 in PBS für 1 Stunde.
4. Die Scheiben in primären Antikörper inkubieren O / N in 5% NGS in PBS bei 4 ° C ist. Zur Identifizierung von Zellen in der Zellstadium NG2, verwenden Sie Antikörper gegen NG2 und PDGFRα. Zur Identifizierung von differenzierten Oligodendrozyten, verwenden Sie ein Antikörpers an die adenomatöse Polyposis coli-Antigen (APC; Klon CC1).
5. Am zweiten Tag waschen Scheiben in PBS 3 x15 min, dann im Sekundär Antibo inkubierenstirbt in 5% NGS in PBS für 1 h bei RT. Scheiben waschen in PBS 3 x15 min und montieren auf Folien. Halterung mit Scheiben und Membran mit Blick auf den Objektträger, so dass die Membran nicht zwischen dem Ziel und dem Gewebe sein.

Ergebnisse

Beispiele für repräsentative Daten sind unten angegeben, die mit Schnittkulturen sowohl aus dem Vorderhirn und Kleinhirn der P8 NG2cre erhalten worden sind: ZEG, NG2creER: YFP und PLPDsRed transgenen Mauslinien. NG2 Zellen über Tage in Vorderhirn und Kleinhirn Scheiben (1B-D, Video 1) und der Phänotyp dieser Zellen abgebildet werden kann, nach der Fixierung bestimmt und Immunfärbung mit NG2 und CC1 Antikörper (1E). Neben der Echtzeit-Bildgebung kann die Zellproliferation auch mit ...

Diskussion

Myelinisierung im zentralen Nervensystem ist wesentlich für eine effiziente Kommunikation und neuronalen Axonen Überleben ^22. NG2-Zellen zu generieren kontinuierlich myelinisierenden Oligodendrozyten in das Erwachsenenalter, während eine Wohnbevölkerung in den meisten Hirnregionen ^{16,23 - 25.} Einige genetische und molekulare Mechanismen die Differenzierung dieser Zellen beschrieben worden, aber es bleibt noch viel zu entdecken. Organotypischen Kulturen sind ein geeignetes Mittel, um diese Mecha...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slice Culture Medium
Minimum Essential Medium	Invitrogen	11090	50%
Hank’s Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175	25%
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Horse Serum	Hyclone	SH30074.03	25%
Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use
Other Reagents and Supplies
4-hydroxy tamoxifen (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldehyde (PFA)	EM Sciences	19200	4%
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Sodium Metaperiodate	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Rabbit anti NG2 antibody	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Mouse anti CC1 antibody	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Mouse anti Ki67 antibody	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Mouse anti NeuN antibody	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Species specific secondary antibodies	Jackson Immunoresearch
Normal Goat Serum (NGS)			5%
Triton X-100			0.10%
Mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size	Fisher Scientific	PICM03050
Bottle top filters	Fisher Scientific	09-740-25E
Ethanol
95% O2 5% CO2 gas mix
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sterile six well plates
Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas
Manual or automatic tissue chopper
Razor blades
Disposable transfer pipettes
35mm and 60mm sterile Petri dishes
Stereomicroscope
Inverted Phase Microscope
Laminar Flow Hood
Tissue Culture Incubator
Inverted Fluorescence Microcope