Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Zusammenfassung

Seit den 1940er Jahren Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet seit Biologen mit ultra-hochauflösende Bilder von biologischen Materialien. Doch weil der mühsame und zeitraubende Protokolle, die auch verlangen, Erfahrung in der Herstellung von artefaktfreie Proben, TEM ist nicht als eine benutzerfreundliche Technik. Traditionelle Probenvorbereitung für TEM verwendeten chemischen Fixiermittel, um zelluläre Strukturen zu bewahren. Hochdruckgefrier ist Kryofixation von biologischen Proben bei hohen Drücken sehr schnell Kühlraten zu erzeugen, wodurch die Eisbildung, die nachteilig für die Integrität der zellulären Ultrastruktur schränkt. Hochdruck Gefrieren und Gefriersubstitution sind derzeit die Methode der Wahl zur Herstellung der höchsten Qualität Morphologie Harzabschnitte für TEM. Diese Methoden minimieren die Artefakte, die normalerweise mit herkömmlichen Verarbeitungs für TEM von Dünnschnitten verbunden. Nach Kryofixation das gefrorene Wasser in der Probe wird mit Flüssigkeit ersetztorganischen Lösungsmittel bei tiefen Temperaturen, ein Prozess, der Gefriersubstitution. Gefriersubstitution erfolgt typischerweise über mehrere Tage in gewidmet, teure Ausrüstung durchgeführt. Eine Innovation kann das Verfahren in drei Stunden abgeschlossen sein, anstelle der üblichen zwei Tage. Dies wird typischerweise durch mehrere Tage der Probenvorbereitung, die Infiltration und die Einbettung in Epoxyharzen vor dem Schneiden enthält, gefolgt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, die hohe Druckgefrieren und Schnellgefrier Substitution, die Pflanzenprobe Fixierung innerhalb weniger Stunden erreicht werden können. Das Protokoll kann leicht für die Zusammenarbeit mit anderen Geweben oder Organismen angepasst werden. Pflanzengewebe sind von besonderer Bedeutung, da die Anwesenheit von belüfteten Räumen und mit Wasser gefüllte Vakuolen, die eisfreien Gefrieren von Wasser zu verhindern. Darüber hinaus ist der Prozess der chemischen Fixierung besonders lange in Pflanzen durch Zellwände behindert das Eindringen von Chemikalien, tief in das Gewebe. Pflanzengewebe sind daher insbesonsondere Herausforderung, aber dieses Protokoll ist zuverlässig und produziert Proben von höchster Qualität.

Einleitung

Unser Wissen über die Ultrastruktur der Zelle kommt hauptsächlich aus Elektronen-Mikroskopie, die Details im Bereich von wenigen Nanometern ¹ auflösen kann. Obwohl er so mächtig in auflösenden TEM nicht als benutzerfreundlich, da die Probenvorbereitung erfordert zeitaufwändige und mühsame Protokolle und verlangt einige Erfahrung aus dem Praktiker. Traditionelle Fixierung der Proben wurde die Verwendung von Aldehyden und Osmiumtetroxid vor der Weiterverarbeitung, die eine Dehydratation umfaßt, Einbetten in Harz und dann Schneiden an Ultradünnschnitten, die anschließend mit Schwermetallen verschmutzt sind produzieren kombiniert. Es ist jedoch bekannt, dass chemische Fixierung kann Artefakte einschließlich Proteinaggregation und Verlust von Lipiden ^1, und Änderungen an Membranen, die letztlich auf mehrere Zellkompartimente ² herzustellen. Diese Artefakte sind weitgehend auf die langsame Geschwindigkeit der Fixierung und Dehydratisierung bei Raumtemperatur ^{3, 4, 5} zurückgeführt.

Kryofixation durch Hochdruckgefrier (HPF) vermeidet die meisten der Artefakte, die durch chemische Fixierung verursacht. Das Prinzip der Kryofixation ist, dass es senkt den Gefrierpunkt von Wasser um 20 Grad, verlangsamt die Keimbildung und das Wachstum von Eiskristallen und erhöht die Viskosität von Wasser in einer biologischen Probe, so dass zelluläre Bestandteile sind im wesentlichen immobilisiert ^{6, 7.} HPF nimmt ein Temperatur Probe zu der flüssigen Stickstoff unter hohem Druck (210 MPa oder 2100 bar) in Millisekunden. Wenn richtig gemacht HPF verhindert die Bildung von großen Eiskristallen, die große Schäden an Ultrastruktur der Zelle führen kann. HPF kann verwendet werden, um Proben von 100-200 um Dicke bei typischen Konzentrationen von gelösten Stoffen biologischen ⁷ fixieren. Es gibt zahlreiche Beiträge über die Physik und Grundsätze HPF, zB ^{1, 7, 8.}

Nach HPF Proben werden bei niedriger Temperatur (-78,5 ° C bis -90 inkubiert und# 176, c) in Gegenwart eines flüssigen organischen Lösungsmittels, das chemische Fixiermittel wie Osmiumtetroxid, in der Regel einige Tage. Bei dieser niedrigen Temperatur wird das Wasser in der Probe durch das organische Lösungsmittel, üblicherweise Aceton oder Methanol ^{1, 9} ersetzt. Somit wird dieser Prozess aufgerufen Gefriersubstitution (FS). Die Probe wird dann nach und nach erwärmt und während dieser Zeit ist festgelegt, in der Regel mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat ^9. Vernetzung bei niedrigen Temperaturen hat den Vorteil einer Fixierung Moleküle immobilisiert sind, die ^1. FS erzeugt daher Proben im Vergleich zu denen von herkömmlichen chemischen Fixierung bei Raumtemperatur fixiert höchster Qualität, insbesondere in verbesserten ultra Erhaltung Ergebnisse, bessere Erhaltung der Antigenität und reduziert Verlust von ungebundenen zellulären Komponenten ^{10, 11.}

Die meisten FS erfolgt über lange Zeiträume, typischerweise bis zu mehreren Tagen. Dies ist besonders true für Pflanzen Proben ^{12, 13, 14.} Eine aktuelle Protokoll, das von McDonald und Webb entwickelt reduziert die Zeit für die FS von mehreren Tagen auf wenige Stunden ^15. In ihren Schnellgefriersubstitution (QFS) Verfahren wird FS über 3 Stunden durchgeführt, während in den super schnell FS (sqfs) Proben werden in 90 Minuten bearbeitet. Die Qualität der Proben durch diese Verfahren hergestellt wird, vergleichbar mit denen von herkömmlichen FS Protokolle ergab. Wir haben die QFS-Protokoll für die Weiterverarbeitung von Pflanzenproben nach HPF angenommen. Dies hat sich nicht nur Zeit, sondern auch Geld sparen, da QFS und sqfs verwenden gemeinsame Laborgeräte statt der kostspielige Handel erhältlichen FS-Maschinen.

Pflanzengeweben sind oft sehr schwierig, für die TEM vorzubereiten. Im Durchschnitt sind Pflanzenzellen größer als entweder bakterielle oder tierische Zellen. Die Anwesenheit von hydrophoben, wachsartigen Kutikula, dicke Zellwände, große mit Wasser gefüllte Vakuolen, die organische Säuren, Hydrolasen und Phenol compounds, dass bis zu 90% des gesamten Zellvolumens einnehmen bis ^16, und das Vorhandensein von belüfteten Räumen stark vermindert die Wärmeleitfähigkeit des Systems ^17. Ferner wird in dem Fall von Pflanzen, die Probendicke fast immer 20 um übersteigt, die Grenze für die Nutzung der chemischen Fixierung. Bei diesen Stärken, die geringe Wärmeleitfähigkeit von Wasser verhindert, dass ein Gefrierrate mehr als -10.000 ° C / s in der Mitte der Probe. Diese Rate ist erforderlich, um schädliche Eisbildung hexagonalen (Eiskristalle mit einer geringeren Dichte und größer als 10 bis 15 nm) zu vermeiden, ^8. Zusammen bilden diese aktuellen Herausforderungen sowohl richtige Einfrieren der Probe und anschließende FS. Dennoch ist Kryofixation die beste Methode für die Festsetzung Pflanzenproben. Hier wird ein Protokoll für die HPF-QFS Pflanzengewebeproben dargestellt. Es konzentriert sich auf das Modell Art Arabidopsis thaliana, hat aber auch mit Nicotiana benthamiana verwendet. Die typischen Ergebnisse zeigen, dass HPF-QFS produziert samples vergleichbarer Qualität zu herkömmlichen HPF-FS in einem Bruchteil der Zeit. Mit der richtigen Einstellung, kann dieses Protokoll auch für andere relativ dicken biologischen Proben verwendet werden.

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Protokoll

HINWEIS: Das Verfahren erfordert QFS äußerster Sorgfalt und Vorsicht durch den Benutzer und stellen wir diese Sicherheitsmaßnahmen hier als Vorsichtshinweise und Hinweise, wo anwendbar.

1.Vorbereitung für HPF Run

1. Vor Beginn der Probenvorbereitung, schalten Sie den Hochdruckgefrier folgenden Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendet HPF Einheit ist ein Wohlwend Compact 02 Einheit (1A), und es dauert etwa ein bis ein-und-ein-halb Stunden von Start-up-Verfahren vor HPF läuft kann beginnen.
   1. Einschalten des Wohlwend Compact 02 Hochdruck-Gefrierschrank.
      1. Gerät einschalten, indem der Hauptschalter von "0" auf "1".
      2. Freidruckluft an die Maschine.
      3. Frei flüssigem Stickstoff an der Maschine.
      4. Drücken Sie die Taste "SYSTEM austrocknen".
      5. Nach 30 Minuten, drücken Sie die "SYSTEM austrocknen "-Taste.
      6. Drücken Sie die "ON / OFF"-Taste, um das Gerät einzuschalten.
      7. Drücken Sie die "Stickstoff"-Taste.
      8. Lassen Sie die Maschine für 20 Minuten abkühlen lassen, auch wenn der "DRIVE IN"-Taste hat bereits beleuchtet.
      9. Der "DRIVE IN"-Taste leuchtet.
      10. Drücken Sie die "Drive in"-Taste.
      11. Drücken Sie die "AUTO"-Taste.
      12. Die Taste leuchtet "SYSTEM READY" auf.
      13. Legen Sie die Temperatur-und Druckfühler in die Druckkammer und verriegeln Sie ihn mit dem Stift.
      14. Drücken Sie die "JET AUTO"-Taste. Dieser Schritt überprüft, dass der Druckanstieg und Temperaturabfall, wie gewünscht sind; Wesentlichen ein Probelauf. Sharp Temperaturstürze und scharfe Druckerhöhungen erwartet werden (Abbildung 1B).
      15. Führen Sie zwei weitere JET-Zyklen.

2. Vorbereitung für Receiving gefrorenen Proben

1. Füllen Sie eine isolierte Box mit Cryovial Halter mit flüssigem Stickstoff (siehe Sicherheitshinweise), so dass die Halter vollständig bedeckt (Abbildung 1c).
   Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
2. Legen Sie die entsprechende Anzahl der Fläschchen, die die FS Medium in der Aluminium-Rohrhalter in den flüssigen Stickstoff (Abbildung 1c). Mit diesem Protokoll bis zu vier Scheiben jeweils eine einzelne Probe, die in einem einzigen Kryoröhrchen platziert werden.
   HINWEIS: Die Fläschchen sollten mit einem scharfen Instrument wie ein Diamantschreiber und sehr weichen Bleistift markiert werden.
   1. Für Fixiermittel bei QFS verwenden 1% OsO ₄ und 0,1% Uranylacetat in Aceton ^9. Bereiten Sie die Lösung in großen Mengen, verzichten Aliquots von 1,5 ml in Kryoröhrchen und lagern in flüssigem Stickstoff eingefroren.
      Hinweis: Beachten Sie Sicherheitshinweise für den Umgang mit OsO ₄ und Uranylacetat.
      HINWEIS: OsO ₄ und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalien und sollte im Abzug gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich geschlossene Schuhe, Kittel und Handschuhe.
      HINWEIS: Die für die Proben für QFS halten Kryoröhrchen sollte eine harte O-Ring, um zu gewährleisten, dass die Rohre bleiben während QFS abgedichtet, um eine Leckage von OsO ₄ zu vermeiden.
3. Bereiten Sie Hefe-Paste durch Mischen Bäckerhefe mit einem ungefähr gleichen Volumen 10% Methanol mit einem Zahnstocher oder andere Instrument, bis die Paste glatt ist. Die Hefe Paste wirkt als ein extrazelluläres Gefrierschutzmittel und wird verwendet, um den Raum um die Probe in dem Probenträger zu füllen. Die Menge der Paste hängt von der Anzahl der Proben; für 10 Proben oder weniger die Paste (1 ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt.

3. Hochdruck Einfrieren von Proben

1. Entfernen Sie ein Blatt (oder andere Gewebe) von Interesse aus der Pflanze und legen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Dental Wachs oder andere Schnittfläche. Verwenden Sie einen Schlag von 2,0 mm oder gewünschte Größe, um eine Probe aus dem Blatt geschnitten. Behandeln Sie die Probe vorsichtig mit einer Pinzette und arbeiten so schnell wie möglich.
2. Arbeiten unter einem Binokular, legen Sie die Blattscheibe in der 0,2 mm Seite der Typ-A-Probenträger und bedecken vollständig in Hefe-Paste. Sicherzustellen, dass die Platte vollständig gefüllt wird und die Paste auf einer Höhe mit dem Rand des Halters durch Glätten der Paste mit einem feinen Pinsel (Abbildung 2).
3. Legen Sie den Träger in den Probenhalter. Decken Sie die Probe mit dem Probenträger Typ B, flache Oberfläche nach unten.
   HINWEIS: Der Probenhalter sollte trocken und bei Raumtemperatur.
4. Nehmen Probe in Probenhalter, stecken Sie sie in Maschine und initiieren eine Gefrierzyklus durch Drücken der "JET AUTO"-Taste, die in einer oder zwei Sekunden zu vervollständigen sollte.
5. So schnell wie möglich arbeiten, entfernen Sie den Halter aus dem Gerät und legen Sie die Spitze hält die sample in flüssigen Stickstoff in dem isolierten Kasten auf der Oberseite des HPF Maschine. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Pinzetten in den flüssigen Stickstoff, um sie zu kühlen.
   HINWEIS: Nach dem Einfrieren sollten die Träger nur mit flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette gehandhabt werden. Warm (Raumtemperatur) Pinzette sind oft die Ursache des Scheiterns in cryotechniques.
6. Öffnen Sie ein Kryoröhrchen mit dem FS Medien, und legen Sie den Deckel auf die Seite der Box. Mit Hilfe eines Paares von flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette vorsichtig entfernen Sie die CD aus dem Probenhalter, so dass die Scheibe immer in den flüssigen Stickstoff oder Dampf. Arbeiten in der Flüssigstickstoffdampf, halten Sie das Rohr mit einem FS vorgekühlten Pinzette und mit der anderen, um den Halter in der FS Fläschchen zu platzieren. Schrauben Sie den Deckel des Fläschchens FS wieder an. Nicht jede Falle von flüssigem Stickstoff in der Ampulle.
   HINWEIS: Bei der Übertragung von Proben für QFS Kryoröhrchen, sicherzustellen, dass kein flüssiger Stickstoff in den Fläschchen gefangen. Flüssigem Stickstoff erweitert 700-fach bei Erwärmung und jeder Trapped flüssiger Stickstoff Explosionen während dieser Zeit führen.
7. Die Schritte 3.1 bis 3.7, bis alle gewünschten Proben werden eingefroren. Mehrere Blattscheiben, die die gleiche Art der Probe kann in der gleichen Ampulle gegeben werden. Beachten Sie, dass der Probenhalter um getrocknete und auf Raumtemperatur zwischen Gefrierpunkt Läufe gebracht werden muss. Um dies schnell zu tun, erhitzen Sie es mit einem Fön, und seine Temperatur durch Berührung zu überwachen.

4. Vorbereitung für die Gefriersubstitution

1. Vollständig einzutauchen das Aluminium Heizblock in flüssigen Stickstoff für 10 Minuten oder bis das Blasensieden stoppt. Während dies vor sich geht, legen eine Schicht aus Trockeneis (1-2 cm) in den Boden des als FS Kammer (Abbildung 3) verwendet Container. Ein Styropor-Behälter oder Eiskübel für FS verwendet werden, zusammen mit zerkleinerten Trockeneis oder Pellets.
2. Legen schnell die Kryoröhrchen mit den Proben zusammen mit dem Temperaturfühler in die mittleren Reihen der Heizungsblock. Achten Sie darauf, dass die Deckel auf dieFläschchen fest verschraubt, so dass der FS Medien nicht während FS auslaufen. Beginnt die Aufnahme der Temperatur.
   1. Machen den Temperaturfühler, indem ein Thermoelement in der Spitze eines Kryoröhrchen so daß er den Boden des Rohrs erreicht. Verschließen Sie den Deckel der Röhre mit Harz, so dass keine Flüssigkeit austritt. Das Rohr wird mit 1,5 ml Aceton bei Beginn jedes QFS Lauf.
3. Mit isolierten Kryo oder große Zange, gießen Sie die gesamte Flüssigkeit Stickstoff aus der Heizungsblock. Achten Sie darauf, gießt die Kryoröhrchen.
   Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff.
4. Legen Sie den Block mit den Fläschchen auf die Schicht aus Trockeneis in der QFS Kammer. Sicherstellen, daß der Block so angeordnet ist, daß die Rohre horizontal liegend, aber mit einer leichten Aufwärtsneigung. Es sollte keine Leckage sein, wenn die richtigen Kryoröhrchen eingesetzt werden.
5. Pack das QFS Kammer mit Trockeneis, so dass die FS Rohre bedeckt, obwohl es nicht notwendig ist,Decken Sie die Oberseite des Blocks. Den Deckel auf die Kammer.

5. Schnelle FS

HINWEIS: Führen Sie die QFS Lauf in einer Abzugshaube in dem Fall, dass eine Leckage von OsO ₄ versehentlich trotz anderer Vorsichtsmaßnahmen auftritt.

1. Zeigen QFS Kammer auf einer Plattform Rotationsschüttler in einer Abzugshaube und drehen sich mit 125 Umdrehungen pro Minute für 120 min. Während dieser Zeit wird die Temperatur des Blocks schrittweise auf etwa -80 ° C zu erhöhen. Das Rühren gewährleistet das Mischen der Komponenten zur besseren FS.
   HINWEIS: Die Platzierung der Shaker in der Dunstabzugshaube und der Position des Abzugshaube Tür sollte sich während der gesamten Prozedur QFS und für jede QFS laufen, um konsistente Erwärmung der Proben zu gewährleisten.
2. Entfernen Sie das Trockeneis aus der Kammer und weiter Schütteln für eine Stunde.
   Hinweis: die Temperatur auf etwa -15 ° C bis -20 ° C zu erhöhen.
3. Entfernen Sie die Proben und Temperaturfühler aus der QFS Kammer und auf denSchüttler bei Raumtemperatur für weitere 10-15 Minuten, bis sie Raumtemperatur erreichen. Stoppen Sie die Aufzeichnung der Temperatur.
4. Während FS, schalten Sie den HPF-Maschine.
   1. Schließen der Abgriff des Flüssigstickstofftank, während das HPF Maschine wird mit Stickstoff gefüllt.
   2. Drücken Sie die "Stickstoff"-Taste.
   3. Warten Sie, bis das rote "Kolben nach unten" Licht erlischt.
   4. Drücken Sie die "ON / OFF"-Taste.
   5. Drücken Sie die Taste "SYSTEM austrocknen".
   6. Zufuhr von Druckluft zu der Maschine.
   7. Nach mindestens 12 Stunden (auf Trocken jeglicher Feuchtigkeit zu gewährleisten), schalten Sie das Gerät durch Drehen des Hauptschalters von "1" auf "0".

6. Beitrag FS Verarbeitung

1. Die FS-Medien mit Kunststoff-Pipetten und in die entsprechenden Container für toxische Abfälle sorgfältig zu entfernen.
   HINWEIS: OsO ₄ und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalienund sollte im Abzug gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich geschlossene Schuhe, Kittel und Handschuhe.
2. Wasch Proben viermal mit 100% Aceton. Sammeln Sie die ersten zwei Wäschen und legen in der giftigen Abfallbehälter.
3. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Gewebeproben aus den Halterungen. Halten Proben nass mit Aceton als dies geschehen ist, und arbeiten sehr vorsichtig, um zu brechen Proben zu vermeiden.
   HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, und es kann tatsächlich nützlich die Hefe-Paste fallen weg von den Proben, an dieser Stelle haben. Die Hefe-Paste ist in der Regel sehr dunkel braun, während das Blattgewebe ist immer noch grün.
4. Sammeln Sie die Proben in Kryoröhrchen Aceton enthalten. Fahren Sie mit dem Probenvorbereitung (Infiltration und Einbettung) für die TEM nach den üblichen Protokollen.

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Ergebnisse

Nachfolgend dargestellten Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Wohlwend Compact 02 für HPF (Abbildung 1A) erhalten. Ein großer Vorteil dieses Instruments ist die Leichtigkeit der Verwendung der Probenträger und ihre Halterungen. Bei der Verwendung von anderen Instrumenten, empfiehlt McDonald, dass zwei Benutzer sollten die Durchführung der Probenvorbereitung und HPF, eine Vorbereitung der Proben, während der andere tut das Einfrieren und Transfer zum FS ⁹ Kryoröhrchen. Doch die Wohlwend Pr...

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Diskussion

Der Erfolg der hier vorgestellten Protokoll hängt stark von dem Benutzer. Zuerst wird advanced Vorbereitung erforderlich, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Materialien leicht verfügbar sind und in ausreichender Menge, um eine gesamte HPF-QFS Lauf abzuschließen. Zweitens muss der Benutzer schnell zu arbeiten, sich von Schritt zu Schritt in einer effizienten Weise, die Handhabung der Proben minimiert und somit Änderungen der nativen Zustand des Gewebes zu minimieren. Sobald Proben werden eingefroren und bevor ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch - Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 ml	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs