Universal-Hand Dreidimensionale Optoakustische Bildgebung Sonde für Deep Tissue Menschen Angiographie und Funktions präklinischen Studien in Echtzeit

Zusammenfassung

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Zusammenfassung

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today’s preclinical research and clinical practice.

Einleitung

Optoakustische (photoakustische) Bildgebung zieht wachsende Interesse aus den biologischen und medizinischen Forschungsgemeinschaften, wie sie in der ständig wachsenden Zahl von Publikationen umfassenden Vielzahl von neuen Anwendungen, die die einzigartigen Vorteile von der Technik ^5.1 zu nutzen manifestiert. Insbesondere eröffnet die Fähigkeit, Bild spektral unverwechselbaren Foto-Absorptionsmittel mit hoher raum-zeitlicher Auflösung in Tiefen weit über die Diffusionsgrenze von Licht beispiellose Fähigkeiten für funktionelle und molekulare Bildgebung ^6-10.

Tatsächlich Übersetzung der optoakustischen Technologie in die klinische Praxis kommt mit vielversprechenden Perspektiven in der Diagnostik und Therapieüberwachung von vielen Krankheiten. Noch der begrenzte Ausbreitung von Photonen in optisch streuenden und absorbierenden Gewebe und der generell schwachen Reaktionen mit der optoakustischen Phänomen zu begrenzen den anwendbaren Tiefe des Verfahrens. Als Ergebnis Hand optoacoustic Sonden haben, um Bildteile von außerhalb des Körpers ^11,12 zugänglich versucht worden, während endoskopischer Systeme werden verwendet, um Bilder aus dem Körperinneren, indem Sie sie über natürliche Körperöffnungen ¹³ bereitzustellen. Einige Low absorbierenden Teile des menschlichen Körpers, wie der weiblichen Brust sind auch von tomographischen optoakustische Scanner ^14,15 zugänglich. Von besonderem Interesse ist das Hand Ansatz, da es ermöglicht große Vielseitigkeit, ähnlich wie Ultraschall. Hier bleibt die Anpassung der gemeinsamen Ultraschall lineare Anordnung Sonden für optoakustischen Bildgebung anspruchsvoll, vor allem auf grundlegende Unterschiede in Bildgebungsanforderungen zwischen Ultraschall und Optoakustik. Während hohe Frameraten in Standard-Sonographie werden durch sequentielle aktiviert Sende-Empfangs-Systeme, die Hochimpulsfolgefrequenzen im kHz-Bereich, wird in Echtzeit dreidimensionale optoakustischen Bildgebung durch gleichzeitige Sammlung von volumetrischen tomographischen Daten aus einer einzigen int erreichterrogating Laserpuls. Somit impliziert hochwertigen optoakustischen Tomographie-Erfassung von dreidimensionalen Daten aus einem möglichst großen Raumwinkel um das abzubildende Objekt.

Kürzlich haben wir den ersten akusto-optischen Handsonde zur dreidimensionalen (volumetrisch) Bildgebung in Echtzeit ^16. Das System basiert auf einem zweidimensionalen Array 256 auf einer Kugeloberfläche (blaue Punkte in 1A) angeordneten piezoelektrischen Elementen abdeckt einen Winkel von 90 ° bezogen. Die Größe der einzelnen Elemente von ca. 3 x 3 mm ^2, sowie deren Orientierung und Frequenzbandbreite (ca. 2-6 MHz) garantieren effektive Signal Sammlung von einer zentimetergroßer Lautstärke rund um das Zentrum der Kugel (schwarz Würfel in Abbildung 1A). Optische Anregung der Abbildungsbereich mit einem Faserbündel durch einen zentralen zylindrischen Hohlraum der Anordnung eingesetzt ist, so dass jede Wellenlänge Susceptible der durch das Faserbündel übertragen kann für die Bildgebung verwendet werden. Eine tatsächliche Bild der Anordnung von Wandlern zusammen mit dem optischen Faserbündel ist in 1B gezeigt. Die effiziente Anregung und gleichzeitige Detektion von Signalen ermöglicht tiefen Gewebe-Bildgebung mit Single-Shot-Anregung (ein Laser-Impuls), so daß eine Echtzeitabbildung mit einer Bildrate von der Pulswiederholungsfrequenz des Lasers bestimmt ist ferner mit einer Grafik- aktiviert Verarbeitungseinheit (GPU) Durchführung des Wiederaufbauverfahren ^17. Ein zylindrisches Gehäuse mit einem transparenten Polyethylenmembran (1C) mit der Wandleranordnung befestigt ist, um eine akustisch Übertragungsflüssigkeit (Wasser) zu umschließen. Die Membran wird auf die Gewebe mittels akustischer Gel gekoppelt. Ein Bild von der optoakustischen Sonde in handgehaltenen Betriebsmodus verwendet wird in 1D gezeigt.

Das demonstriert three dimensional Handoptoakustischen Bildgebung in Verbindung mit dem Echtzeit-Funktionsabbildungsleistung wichtige Vorteile für die klinische Diagnostik und eine Anzahl von potentiellen Anwendungen sind für verschiedene Indikationen, wie periphere arterielle Verschlusskrankheit, des Lymphsystems, Brustkrebs, Hautläsionen vorgesehen, Entzündung oder Arthritis ^18. Weiterhin schnelle Abbildungsleistung ermöglicht die Visualisierung von dynamischen biologischen Ereignisse mit dem in einer stationären Position angeordnet Sonde. Kombiniert mit schneller Wellenlängenabstimmung optischen parametrischen Oszillator (OPO), Lasertechnik, ermöglicht die Echtzeit-Bildgebung von biologischen Verteilung von Photoabsorptionsmittel dieser Ansatz. Dadurch kann neue Möglichkeiten gleichermaßen entstehen in der Kleintierbildgebungsanwendungen, z. B. bei der Untersuchung Gewebe Hämodynamik, in vivo Zellverfolgung, Visualisierung der Pharmakokinetik, Organperfusion, gezielte molekulare Bildgebung von Tumoren und Herz-Kreislauf-System oder Neuroimaging.

In dieser Arbeit stellen wir eine detaillierte Beschreibung der experimentellen Bildgebung Protokoll, um mit dem sphärischen Array optoakustischen Handsonde und Schaufenster Leistung in mehreren typischen klinischen und Kleintierbildgebung Szenarien arbeiten.

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Protokoll

Die Einzelheiten des Verfahrens zum Betreiben der volumetrischen Handoptoakustischen Sonde wird nachstehend beschrieben. Dieser Vorgang wird nach anerkannten institutionellen Regelungen zur Tier- und Menschenversuche durchgeführt.

1. Systemvorbereitungs

1. Einschalten des Lasers für eine Aufwärmzeit von ca. 15 min vor dem Betrieb zur Stabilisierung der Ausgangslichtstrahl.
2. Setzen Sie den Wasser umschließenden Teil mit der Trennmembran, die in Kontakt mit der Haut (Abbildung 1) ist.
   HINWEIS: Der Abstand zwischen der Trennmembran (in Kontakt mit der Haut) und die Region mit der maximalen Empfindlichkeit des Wandlers (Zentrum der sphärischen Sonde) stellt die effektive Abbildungstiefe.
3. Füllen des gesamten Volumens von ca. 100 ml zwischen der Trennmembran und der Oberfläche des Wandlers mit entionisiertem Wasser mittels einer Pumpe.
4. Stellen Sie sicher, dass keine Wasserleckage noch Luftblasen Present. Alternativ zu vermeiden Luftblasen durch Rezirkulation des Wassers.
5. Führen die Versuche bei RT und gewährleisten die Koppelmedium (Wasser) wird bei dieser Temperatur gehalten.

2. Imaging Vorbereitung

1. Menschliche Bildgebung Vorbereitung.
2. Entfernen von Haar des zu bild Teil mit einer Depilation Lotion, um einen unerwünschten Hintergrund in den Bildern zu vermeiden (dieser Schritt ist optional).
3. Anwendung Ultraschallgel auf die Haut, um den Bereich zu, um eine effiziente akustische Kopplung bereitzustellen abgebildet werden. Legen Sie die optoakustischen Sonde in der Region von Interesse. Darauf, dass keine Luftblasen in der Ultraschallankopplung Gel vorhanden sind.
4. Tierbildgebung Vorbereitung.
5. Stellen Sie sicher, dass die Pflege und experimentellen Verfahren mit Tieren sind in Übereinstimmung mit institutionellen und staatlichen Vorschriften.
6. Entfernen das Fell des Tieres in dem Bereich mit einer Rasierwasser abgebildet werden. Schützen Sie die Augen des Tieres mitTierarzt Salbe, die Trockenheit und Schäden durch Einwirkung von intensiver gepulster Laserstrahlung verhindert.
7. Betäubt das Tier mit Hilfe intraperitoneale Injektion (IP) von Ketamin / Xylazin (100 mg / kg KG Ketamin + 5 mg / kg KG Xylazin) vor dem Experiment oder mit Isofluran-Narkose (2-3% (Volumen) mit 0,9 l / min Gasstrom) während des Experiments. Betäubung Bestätigen durch Überprüfung der Reflex der hinteren Gliedmaßen des Tieres.
8. Anwendung Ultraschallgel auf die Haut um den Bereich zu, um eine effiziente akustische Kopplung bereitzustellen und legen die optoakustischen Sonde in dem interessierenden Bereich abgebildet werden. Darauf, dass keine Luftblasen in der Ultraschallankopplung Gel vorhanden sind.

3. Pre-view Operation Mode

1. Stellen die Abbildungswellenlänge (n) zwischen 690 nm und 900 nm und die Pulswiederholungsrate zwischen 10 und 50 Hz. Die Parameter für die akustische Datenerfassungssystem - 1 MEingangsimpedanz. Erwerben 2030 Abtastwerte für jeden Laserpuls mit einer Abtastrate von 40 Megasamples pro Sekunde und 12-Bit-Vertikalauflösung. Auslösen der Erfassung mit Q-Schalter-Ausgang des Lasers.
2. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Betreiber und der Patient Schutzbrille tragen zur optischen Anregungswellenlänge (n) angepasst. Eingestellt, die Laserleistung so, dass der Lichtfluss auf der Gewebeoberfläche unter 20 mJ / cm ² während des Experiments zur nahen Infrarotwellenlängen, um die Sicherheit Grenzwerte für Menschenversuche ¹⁹ erfüllen und thermische Belastung und Schädigung der Haut bei Tieren verhindern gehalten .
3. Starten des pre-view-Software mit einer GPU Umsetzung Verarbeitungsalgorithmen ermöglichen die Visualisierung dreidimensionaler Bilder mit einer Bildrate entsprechend der Impulswiederholungsrate des Lasers.
4. Bewegen Sie die Sonde und / oder das Objekt, um Visualisierungsleistung zu optimieren und zu lokalisieren, die Strukturen von Interesse abgebildet werden.

4. Datenerfassung

1. Die Datenerfassung für das Scannen (Handheld) Modus.
2. Falls erforderlich, Injizieren eines Kontrastmittels nach der Akquisition der Kontrast in der Region von Interesse zu machen.
   HINWEIS: In unseren Experimenten haben wir nicht kontrastverstärkten menschlichen Bildgebung durchgeführt. Dennoch können verschiedene Kontrastmittel potentiell für diesen Zweck verwendet werden. Indocyanin-Grün (ICG) ist ein Beispiel einer klinisch zugelassenen optische Kontrastmittel, die für die Kontrastverstärkung bei maximal empfohlenen Dosis von 2 mg / kg Körpergewicht bei Erwachsenen verwendet werden können.
3. Starten der Hardware für die Datenerfassung mit den in 3.1 beschriebenen Parameter Aufrechterhaltung der Ausführung des Vorschau Software. Bewegen vorsichtig die Sonde um den abgebildeten Bereich, um die Strukturen von Interesse zu verfolgen.
   HINWEIS: Wenn Bilder an mehreren Laserwellenlängen gleichzeitig erfasst, hat die Geschwindigkeit der Sondenbewegung im Handbetrieb deutlich verringert werden (vorzugsweise unter 2 mm / secfür eine Laserimpulswiederholungsrate von 50 Hz), um bewegungsbezogenen Artefakten in den spektral entmischten Bilder zu vermeiden.
4. Die Datenerfassung für den stationären Betrieb.
5. Montieren Sie das abgebildete Objekt (z. B. Tier) und der Handsonde auf den Halter und starten Sie die Übernahme mit den in 3.1 beschriebenen Parameter Aufrechterhaltung der Ausführung des Pre-View Software.
6. Aufrechterhaltung der optoakustischen Sonde und das Abbildungsteil in der gleichen Position während des Versuchs, um dynamische biologische Ereignisse in dem Bereich von Interesse darzustellen.
7. Injizieren eines Kontrastmittels, um seine dynamische Verteilung in der Region von Interesse zu verfolgen.
   HINWEIS: In unserem Mausexperimenten, Indocyaningrün (ICG) wurde zur Kontrastverstärkung eingesetzt. Als allgemeine Richtlinie gilt, einer Menge von 10 nmol oder 0,4 mg / kg ICG hat, um nachweisbare Unterschied multispektralen Optoakustik in vivo erzeugen in den Kreislauf eingebracht werden, der Maus.
   HINWEIS: Das Kontrastmittel mussfür den menschlichen und / oder tierischen Gebrauch durch den jeweiligen Behörde genehmigt.

5. Abschließen der Experiment

1. Stoppen Sie den Laser.
2. Entfernen Sie die optoakustischen Sonde von der abgebildeten Region. Für Tierstudie, stoppen Sie die Anästhesieversorgung.
3. Positionieren Sie das Tier unter einer Infrarotheizung, um es warm zu halten und den Kontakt mit anderen Tieren zu verhindern, bis er aus der Narkose vollständig erholt. Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt während der Erholung von der Narkose.

6. Off-line Datenverarbeitung

1. Laden Sie die Datei (en) enthält, die erworbenen optoakustischen Signale in der Software-Anwendung für die Datenverarbeitung eingesetzt.
2. Verwenden eines Rekonstruktionsalgorithmus auf einer dreidimensionalen Matrixanordnung entsprechend einem volumetrischen Bild der optischen Absorption für jeden Rahmen, und jede Wellenlänge zu erhalten.
   HINWEIS: Für die Rekonstruktion ist es bevorzugt, einen Algorithmus zu verwenden, entfallen Störfaktoren, wie heterogenekeiten und Dämpfung in dem abgebildeten Objekt, Auswirkungen der endgültigen Bandbreite und geometrische Form der Erfassungselemente und Lichtfluenz Variationen, um eine quantitative Darstellung der Verteilung der absorbierten Energie zu erhalten.
3. Verwenden einen Algorithmus, um Entmischung zu erhalten, aus jedem Mehrfachwellenlängen-Rahmen, einen neuen Satz von dreidimensionalen Matrixarrays, die die optische Absorption für jeden in der Probe vorhandenen absorbierenden Substanz.
4. Bei Bedarf weiterverarbeiten die Matrix-Arrays, die die optischen Absorptionsverteilung bis zur Visualisierung und Lesen von biologisch relevanten Parameter zu erleichtern.

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Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse, demonstriert die Fähigkeiten des beschriebenen volumetrischen Handoptoakustischen Sonde, werden in diesem Abschnitt vorgestellt. In allen Fällen wurde der Lichtfluss auf der Hautoberfläche unter den Sicherheitsgrenzwert von 20 mJ / cm ^{2 19} gehalten.

Die Leistung der Sonde in Echtzeit-Tracking peripheren menschlichen Gefäß ist in Figur 2 vorgestellt. Im Verlauf dieses Versuches wurde die Sonde langsam entlang der Hand eines gesunden...

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Diskussion

Die einzigartigen Vorteile, die durch optoakustischen Bildgebungstechniken in kleinen Tierforschung angeboten haben starke Motivation für die Übersetzung der Technik in der klinischen Praxis mit einer Reihe von Diagnose und Therapieüberwachung Anwendungen vorgesehen, zB erstellt., Brust- und Hautkrebs, Entzündung oder periphere Gefäßkrankheiten. Jedoch, im Gegensatz zu Mäusen oder kleinere Tiere, die mit einer ausreichenden Anzahl von Lichtquellen und Detektorelementen umgeben sein kann, um eine wirksame...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical parametric oscillator (OPO)-based laser	Innolas Laser GmbH, Krailling (Germany)	custom-made	The laser provides laser pulses with a duration around 10 nsec and an energy up to 80 mJ. The wavelength is tunable between 680-950 nm.
Spherical array of piezocomposite detectors	Imasonic SaS, Voray (France)	custom-made	The array consists of 256 piezoelectric sensors distributed on a spherical surface. Each element has dimensions 3 x 3 mm2, a central frequency of 4 MHz and a bandwidth of 100%.
Data acquisition system (DAQ)	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Germany)	custom-made	The DAQ simultaneously acquires 256 signals at 40 megasamples per second and 2,030 samples. The input impedance is 1 MW.
Fiber bundle	CeramOptec GmbH, Bonn (Germany)	custom-made	The bundle consists of 480 individual fibers randomly distributed in the input and output. The numerical aperture of each individual fiber is 0.22.
Athymic nude mouse	Harlan Laboratories (The Netherlands)	Athymic nude - Foxn1nu	The mouse was 8 weeks old (adult) at the time of the experiment. The ethical protocol was approved by the Bavarian goverment (number 55.2.1.54-2632-102-11)
Bepanthen cream	Bayer AG (Germany)		Vet ointment to protect the eyes during anesthesia
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	custom-made	The data processing software was devoped at our institute. It allows reconstruction at each wavelength and multi-wavelength unmixing, as well as further data processing.
Water-enclosing part		custom-made	This part contains the water that acts as an acoustic coupling medium between skin and transducer elements
Indocyanine green (ICG)	PULSION Medical Systems SE		ICG-PULSION (active ingredient: indocyanine green dye) is a drug used in cardiac, circulatory and micro-circulatory diagnostics, liver function diagnostics and ophthalmic angiography diagnostics.