Die Verwendung der<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Chandler Loop-Gerät, um die Biokompatibilität von modifizierten polymeren Blutleitungen beurteilen

Zusammenfassung

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Zusammenfassung

Die Fremdkörperreaktion tritt auf, wenn eine Kunststoffoberfläche ist mit dem Körper eingeführt. Es wird durch die Adsorption von Blutproteinen und die anschließende Bindung und Aktivierung von Blutplättchen, Monocyten / Makrophagen-Adhäsion und entzündliche Zellsignalisierungsereignisse gekennzeichnet, was zu postoperativen Komplikationen. Chandler-Loop Vorrichtung ist ein experimentelles System, das die Forscher die molekularen und zellulären Wechselwirkungen, wenn große Blutvolumina werden über Leitungen polymeren perfundiert auftreten studieren kann. Zu diesem Zweck ist diese Vorrichtung als Ex-vivo-Modell ermöglicht die Beurteilung der entzündungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen Polymeroberflächenmodifikationen verwendet. Unser Labor hat gezeigt, dass Blutleitungen, kovalent über Photochemie mit rekombinanten CD47 geändert können Biokompatibilität auf polymeren Oberflächen verleihen. Anhängen von CD47 auf polymeren Oberflächen könnte ein wirksames Mittel, um die Wirksamkeit der polymeren Blutleitungen zu fördern. SieEin ist die Detaillierung der Methodik der Photochemie verwendet, um rekombinantes CD47 klinisch relevante polymeren Blutleitungen und der Verwendung der Chandler-Loop als Ex-vivo-Versuchsmodell hängen, um Blut CD47-Wechselwirkungen mit den modifizierten und Steuerleitungen zu untersuchen.

Einleitung

Viele klinische Verfahren, wie beispielsweise Herz-Lungen-und Nierendialyse, erfordern die Verwendung von polymeren Blutleitungen und sind oft mit postoperativen Komplikationen ¹ verbunden. Wenn sie mit Blut durchströmt, diese Polymere unerlaubt die Fremdkörperreaktion (FBR), was bei der Adsorption von Blutproteinen und Thrombozyten, Monozyten / Makrophagen-Haftung, und die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, die alle zu post-prozeduralen Komplikationen und tragen / oder Geräteausfall ^2,3. So, Strategien zur Lösung dieses Problems vor ein wichtiges und laufende Bereich der Biomaterialien Forschung. Forscher haben versucht, dieses Problem durch Änderung Blutkontaktflächen mit bioaktiven Molekülen oder bioinert ^4-6 anzugehen. Forschung in unserem Labor hat sich auf das Anhängen rekombinanten CD47 (recCD47) zu polymeren Biomaterialien als eine Strategie, um den FBR mildern und erhöhen die Wirksamkeit dieser Materialien. CD47 ist ein ubiquitär exprimiert transmembrane Protein mit einer bekannten Rolle in der Immun Steuerhinterziehung, verleiht Status "Selbst" auf exprimierenden Zellen ^7-10 und Shows versprechen bei Übertragung der Biokompatibilität, wenn auf polymere Oberflächen ^11-13 angehängt. Signal-Regulationsprotein alpha (SIRPα), der zugehörigen Rezeptor für CD47, und ein Mitglied der Immunrezeptor Tyrosin-basierte inhibitorische (ITIM) enthaltenden Familie von Transmembranproteinen, auf Zellen myeloiden Ursprungs ¹⁴ ausgedrückt. Wir haben zuvor gezeigt, dass CD47, über SIRPα-vermittelten Zellsignalisierung nach unten reguliert die Immunantworten auf Polyurethan (PU) und Polyvinylchlorid (PVC) in in vitro, ex vivo und in vivo-Modellen ^11-13.

Zentral unseren Untersuchungen ist eine relativ neue Photochemie, die hier beschrieben ist, in dem chemisch reaktive Thiolgruppen, die kovalent an Polymerschlauch durch Umsetzung der Schlauch mit einem multifunktionellen Polymers (PDT-Bz fügtenPh), 2-pyridyldithio (PDT) besteht, die photoreaktive Benzophenon (BzPh) und einem carboxy-modifizierten Polyallylamin ^11-13. Reduzieren der kovalent angehängt PDT Gruppen mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) ¹¹ liefert eine Oberfläche, die anschließend thiolierten sein kann mit therapeutischen Gruppierungen umgesetzt. Und hierin vorher beschrieben ^12,13, recCD47, ferner mit der Zugabe eines C-terminalen Poly-Lysin ^12,13 Schwanz modifiziert mit Sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexan-1-carboxylat umgesetzt (Sulfo-SMCC) für 1 h auf Thiol-reaktive Gruppen zu erzeugen, was eine Monosulfid-Bindungen zwischen dem Schlauch und recCD47 ^11. Die entzündungshemmende Fähigkeit der CD47 funktionalisierten Oberflächen getestet, ex viv o, mit der Chandler-Loop Vorrichtung mit menschlichem Vollblut, das ursprünglich im Jahr 1958 beschrieben wurde als ein in vitro-Modell der Thrombose Koagulation ^15. Die Vorrichtung beruht auf einergeschlossenes Rohr, das teilweise mit Luft und einen Drehmotor, um das Blut durch den Schlauch ¹⁵ zirkulieren gefüllt. Dieses Versuchsmodell bietet die Möglichkeit, die Wirkung der Blutexposition auf modifizierten und unmodifizierten Oberflächen sowie die Auswirkungen dieser Oberflächenmodifizierungen auf die Physiologie der Zellen des Blutes zu untersuchen.

recCD47 kann auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen mit diesen Photochemie angefügt werden, und seine entzündungshemmende Kapazität kann durch Verwendung eines klinisch relevanten ex vivo-Modell imitiert Blutperfusion auf polymeren Oberflächen ^11,12 beurteilen. Klinischer Qualität Blutleitungen mit recCD47 verändert zeigen deutlich weniger Blutplättchen und Entzündungszellhaftung im Vergleich zu nicht modifizierten Polymeren, wann menschliches Blut in dem Gerät ausgesetzt. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieses Änderungsprozess wird im Folgenden aufgeführt.

Protokoll

1. Ändern Polymere Oberflächen mit recCD47

HINWEIS:. Das Protokoll ist in 1 schematisch zusammengefaßt 1A zeigt Generation von Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen 1B zeigt Generation von Thiol-reaktiven recCD47..

1. Tag 1
   1. Eine Lösung von PDT-BzPh (1 mg / ml) und Kaliumhydrogencarbonat (KHCO ₃₎ (0,7 mg / ml) in sterilem Wasser. Rühren über Nacht bei 4 ° C (vor Licht schützen).
2. Tag 2
   1. Geschnitten polymeren Schlauch in 40 cm lange Stücke (lange genug, um rotierende Räder passen herum).
   2. Einweichen Rohre in einer 0,1% igen wässrigen Lösung von hexacylpyridinium für 90 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Chandler Kreisvorrichtung. Spülen Sie die Rohre mit sterilem Wasser 3x nach der 90 Minuten einweichen.
   3. Säure die Lösung von PDT-BzPh von Tag 1 durch Zugabe von 15% iger wässriger Kaliumphosphat einbasischen (KH ₂ PO _4). Fügen Sie 50 ul KH ₂ PO ₄ pro ml PDT-BzPh und bildet eine trübe Mizellarlösung.
   4. Weichen Sie die Rohre in der angesäuerten PDT-BzPh Lösung für 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder auf das Gerät.
   5. Spülen Sie die Rohre mit verdünnter Essigsäure (1: 1000) einmal.
   6. Setzen die Röhren UV-Bestrahlung mit einer Gesamtdauer von 60 min. Rohre drehen ¼ Umdrehung alle 15 min, um die gesamte Fläche zu bestrahlen.
   7. Einweichen der Rohre in einer Lösung von 20 mg / ml Kaliumbicarbonat (KHCO ₃₎ für 20 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Vorrichtung.
   8. Die Röhrchen mit sterilem Wasser spülen und zu speichern 3x bei 4 ° C in sterilem Wasser.
3. Tag 3
   1. Aufzulösen 5 mg Sulfo-SMCC in 200 ul Dimethylformamid (DMF) (Achtung: Führen in Abzug).
   2. Dann werden 50 ul der Sulfo-SMCC-Lösung in Schritt 1 bis 0,1 mg / ml recCD47 Poly-Lysin-Lösung, zugegeben und 60 min bei room Temperatur.
   3. Während 60 min rühren, Degas sterile Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) und beiseite stellen.
   4. Reinigen Sulfo-SMCC reagiert recCD47 mit einem Molekulargewicht 7K Cut-off-Spin-Entsalzungssäule den Anweisungen des Herstellers. Sammeln abschließenden Durchfluss (hochwertige thiolreaktive recCD47) und verdünnt auf eine notwendige Beschichtung des Inneren des Rohres mit DPBS Volumen.
   5. Die Rohre von Tag 2 mit sterilem spülen, entgast DPBS 3x.
   6. Reagieren der modifizierten Oberfläche der Rohre mit einer Lösung von 20 mg / ml mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) in entgastem DPBS für weniger als 2 min. Spülen Sie die Rohre mit sterilem DPBS 4x entgast.
   7. Fügen Sie den Sulfo-SMCC reagierten recCD47 zu den Rohren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler oder auf das Gerät.

2. Immunoassay Quantifizierung der recCD47 auf modifizierte Oberflächen

1. Geändert Rohre spülen, um von Tag 3 wit quantifiziert werdenh DPBS 3x. Die Röhrchen nicht zur Quantifizierung in DPBS bei 4 ° C verwendet.
2. Verwenden Sie ein 4 mm Biopsie Punch, um doppelte Rohrproben in Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu machen und legen Biopsie Schläge.
3. Bereiten Sie eine Negativkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohr Probe nicht mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie eine Antikörperkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohrprobe mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie die mit dem Detektionsantikörper behandelt geändert Rohr-Testproben.
4. Block Proben mit 0,4% Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS für 60 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler.
5. Nach der Blockierung absaugen BSA und spülen mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, jeweils 10 Minuten auf einem Schüttler.
6. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung des Antikörpers in 0,4% BSA nach Hersteller empfohlenen Verdünnung für Immunoassays. Verdünnte menschliche CD47-Antikörper-FITC B6H12 1: 100 in 0,4% BSA.
7. Fügen Sie 200 ul Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Wells. Incubate negative Kontrollen mit nur 0,4% BSA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 60 min auf einem Schüttler (vor Licht schützen).
8. Spülen mit TBST 3x, jeweils auf einem Schüttler 10 min. Saugen Sie den letzten TBST spülen und mit 200 ul DPBS auf Rohrprobenvertiefungen.
9. Sammeln Sie die letzte Durchfluss, die hochwertige thiolreaktive rekombinanten CD47 ist und zu verdünnen, um eine notwendige Beschichtung der Innenseite der Rohre mit DPBS Lautstärke.
10. Lesen FITC Signalintensität mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader mit FITC-Anregung (485 nm) und Emission (538 nm)-Einstellungen.
11. Berechnen recCD47 polymere Oberfläche gebunden basierend auf Standardwerte, auf die Autofluoreszenz und unspezifische Bindung des Antikörpers Kontrollprobe.

3. Chandler Loop-Gerät Protokoll

Suchen Institutional Review Board (IRB) Genehmigung der Blutentnahme Protokoll und informierte Zustimmung Papierkram vor Beginn der Sammlung von menschlichen Blutproben. Infos zu erhaltenRmed Zustimmung von einem menschlichen Blutspender.
HINWEIS: Ein Diagramm, das die Vorrichtung ist in Figur 2 gezeigt.

1. Füllen Wasserbad mit destilliertem Wasser bis ca. 02.01 der Durchmesser Räder sind untergetaucht. Fügen Sie genug Bleichmittel auf dem Wasserbad auf 10% Bleichmittel-Lösung zu machen. Eingestellt Wasserbad auf 37 ° C und ermöglichen Temperatur äquilibrieren.
2. Sammeln Metalladapter (in 1B gezeigt), unmodifizierten und modifizierten Rohrschlauch und der Umgebung zusammenVorrichtung Räder, wie in 1C gezeigt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch passt eng um das Rad mit dem Metallteil an Ort und Stelle.
3. Erhalten 30 ml Blutprobe unter Verwendung eines IRB-genehmigten Protokoll, in einer Ampulle mit 2 ml Citrat oder anderen Antikoagulans vorgefüllt und Mischen durch Inversion der Gerinnung zu verhindern, sobald die Probe gesammelt wurde.
4. Etwa 10 ml Blut zu jedem Röhrchen unter Verwendung der Metallventil und Spritze, so dass etwas Luft in dem Rohr. Befestigen Sie die Ventilkappe und rOtate für 3 Stunden.
5. Lassen Sie das Blut in einen Abfallbecherglas mit einer 10% Bleichmittel-Lösung (oder, wie von institutionellen Politik erforderlich).
6. Rohrinnen sanft spülen mit DPBS um alle Spuren von Blut zu entfernen. Sammeln Durchströmung in der Abfallbecherglas. Entsorgen von Blut im Einklang mit den institutionellen Politik.
7. Desinfizieren Sie das Gerät und den Blutkontaktflächen mit einem 10% igen Bleichlösung oder nach institutionellen Politik.
8. Verfahren Proben für Fluoreszenzmikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie, wie unten beschrieben.

4. Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellzählung

1. Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung (Achtung: Führen in Abzug).
2. Schlauch inkubieren in 4% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C ist.
3. Nach Inkubation über Nacht entfernen 4% PFA und spülen Filme sehr vorsichtig mit DPBS.
4. Schneiden Sie den Schlauch in Abschnitte, um die Lumenoberfläche für die Färbung aus.
5. Fleckein Abschnitt der Rohrleitung mit einigen Tropfen Befestigungsmittel 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 30 min bei Raumtemperatur (vor Licht schützen). Nach der Färbung, spülen Sie den Schlauch sehr vorsichtig mit DPBS, um Hintergrund DAPI Signal zu reduzieren.
6. Bild unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem DAPI-Filter und Digitalkamera ausgestattet die Anzahl der Zellen in 9 blind ausgewählten Sichtfeldern unter 200facher Vergrößerung zu zählen.
7. Rekordzelle zählt pro Gesichtsfeld und führen Sie die entsprechenden statistischen Analysen, statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen.

5. Rasterelektronenmikroskopie

1. Bereiten Sie eine 2% Glutaraldehyd-Lösung (Achtung: Führen in Abzug).
2. Schlauch in einer 2% igen Glutaraldehyd-Lösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C ist.
3. Nach Inkubation über Nacht, sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS.
4. Bereiten Sie eine 1% ige Lösung von Osmiumtetroxid (Achtung: Schwere Gefährdung durch Einatmen! Verwenden Sie in Abzug).
5. Schlauch inkubieren in einer 1% igen Lösung von Osmiumtetroxid 15 min bei Raumtemperatur.
6. Sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS.
7. Vorbereiten einer Reihe von Ethanol-Konzentrationen (25%, 50%, 75%, 95% und 100% Ethanol).
8. Dehydratisierung der Schlauch durch Inkubation in einer Reihe von Ethanolkonzentrationen. Inkubieren in 25%, 50%, 75% und 95% Ethanol für jeweils 20 min. Inkubieren in 100% Ethanol für 30 min.
9. Überkritischen Punkt trocknen die Schläuche mit CO ₂ für 45 Minuten, um alle Feuchtigkeit zu entfernen.
10. Mount Rohrabschnitte auf einer Probe mit Stummelsilberpaste oder Graphit.
11. Mantel Rohrabschnitte mit 12,5 nm Gold-Palladium.
12. Untersuchen in einem Rasterelektronenmikroskop.

Ergebnisse

Erzeugen Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen durch die Verwendung von PDT-BzPh und TCEP mit Thiol-reaktiven recCD47 Poly-Lysin unter Verwendung von SMCC ermöglicht die Befestigung recCD47 auf polymeren Oberflächen. Das Modifizierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 zusammengestellt. Die Bequemlichkeit des Modifikationsprozesses ist, dass sie auf viele verschiedene Proteine ​​und viele verschiedene Polymeroberflächen aufgebracht werden, vorausgesetzt, das Protein mit genügend chemisch ...

Diskussion

Die Photochemie (in Figur 1 zusammengefaßt) erlaubt die Änderung der praktisch jedem Polymeroberfläche, die ausreichend ist, um Kohlenwasserstoffe PDT-BzPh Befestigung und anschließenden UV-Bestrahlung zu erleichtern Photo aktivieren PDT-BzPh. Funktionalisierung der Polymeroberfläche mit reaktiven Thiolgruppen erlaubt die nachträgliche Montage einer Reihe von testbaren Moleküle von Interesse. In unserem speziellen Studien wählten wir rekombinanten CD47 ^11-13. Die besondere Konjugation...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891