Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Zusammenfassung

Wir berichten über eine Vorrichtung und ein neues Verfahren Zellen und Embryonen zu untersuchen. Einzelne Zellen werden in Mikroresonator-Arrays genau bestellt. Ihre 3D Haft ist ein Schritt in Richtung 3D-Umgebungen unter physiologischen Bedingungen auf und lässt zu Organell Orientierung. Durch die Steuerung der Zellform, minimiert diese Setup-Variabilität in Standardtests berichtet.

Zusammenfassung

Biologische Zellen sind in der Regel auf ebenen (2D) Oberflächen beobachtet. Dieser Zustand ist nicht physiologisch, und Phänotypen und Formen sind sehr variabel. Screening auf Basis von Zellen in solchen Umgebungen haben daher gravierende Einschränkungen: Zellorganellen zeigen extreme Phänotypen, Zelle Morphologien und Größen sind heterogene und / oder spezifische Zellorganellen nicht richtig sichtbar gemacht werden kann. Darüber hinaus werden in vivo Zellen in einer 3D - Umgebung angeordnet ist ; In dieser Situation zeigen Zellen unterschiedliche Phänotypen vor allem wegen ihrer Wechselwirkung mit der umgebenden extrazellulären Matrix des Gewebes. Um Reihenfolge der einzelnen Zellen in einem physiologisch relevanten 3D - Umgebung für zellbasierte Assays zu standardisieren und zu erzeugen, berichten wir hier die Mikrofertigung und Anwendungen einer Vorrichtung zur In - vitro - 3D - Zellkultur. Diese Vorrichtung besteht aus einer 2D - Anordnung von Mikrokavitäten (typischerweise 10 ⁵ Kavitäten / cm ^2), die jeweils mit einzelnen Zellen oder Embryonen gefüllt. Zell position, Form, Polarität und interne Zellorganisation dann normalisiert werden eine 3D-Architektur zeigt. Wir verwendeten Replik Formens Muster eine Reihe von Mikrokavitäten, 'eggcups', auf eine dünne Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Deckglas geklebt. Hohlräume wurden mit Fibronectin bedeckt Haftung zu erleichtern. Zellen wurden durch Zentrifugation eingesetzt. Füllprozentsatz wurde für jedes System optimiert, um 80% ermöglicht werden. Die Zellen und Embryonen Lebensfähigkeit wurde bestätigt. Wir wendeten diese Methode zur Visualisierung von Zellorganellen wie Nukleus und Golgi-Apparat, und aktive Verfahren, wie das Schließen des Rings während zytokinetischen Zellmitose zu studieren. Dieses Gerät erlaubt die Identifizierung von neuen Features, wie zB periodische Ansammlungen und Inhomogenitäten von Myosin und Aktin während der zytokinetischen Ringschluss und verdichtet Phänotypen für Golgi und Kern-Ausrichtung. Wir gekennzeichnet , das Verfahren für Säugetierzellen, Spalthefe, Bäckerhefe, C. elegans with spezifische Anpassung in jedem Fall. Schließlich machen die Eigenschaften dieses Gerät interessant besonders für Arzneimittel-Screening-Assays und personalisierte Medizin.

Einleitung

Strom in vitro zellbasierten Assays , sind zweidimensionale (2D). Diese Konfiguration ist nicht natürlich für Säugerzellen und ist daher nicht physiologisch relevant ^1; Zellen zeigen eine Vielfalt von Formen, Größen und heterogenen Phänotypen. Sie stellen zusätzliche ernsthafte Einschränkungen bei dem Screening-Anwendungen angewandt, wie beispielsweise eine ungeordnete Verteilung innerhalb der Ebene und extreme Phenotypen von Zellorganellen (Stressfasern, insbesondere). Dies ist besonders wichtig in klinischen Studien für Drogentests, bei denen eine hohe Budgets jedes Jahr ausgegeben. Die meisten dieser Medikamente versagen jedoch, wenn die Tiermodelle angewandt wegen der künstlichen 2D-Kulturbedingungen in frühen Phasen der Wirkstoffscreening. Zusätzlich kann durch diesen Ansatz verwenden, bestimmte Zellorganellen nicht richtig dargestellt werden kann, wie beispielsweise die zytokinetischen Actomyosin Ring während Mitose und allgemein Strukturen, die in der Ebene senkrecht zur Ebene des Beobachtungs entwickeln sich. Etwasneue 2D - Assays wurden zu überwinden , um die oben erwähnten Nachteile und wichtige Erkenntnisse über Zytoskelettorganisation wurden ^2,3 beobachtet vorgeschlagen. Allerdings sind diese Tests noch vorhanden eine ernsthafte Einschränkung: zeigen Zellen , die einen sehr Ausbreitung Phänotyp im Gegensatz zu dem, was in vivo beobachtet wird, wo Zellen , die eine 3D - Architektur präsentieren. Diese Artefakte mit dem Kulturverfahren verbunden sind, können auslösen nichtphysiologischen Eigenschaften wie verbesserte Stressfasern ^1,4,5.

Dreidimensionale Zellkultur - Assays bieten mehrere Vorteile im Vergleich zu den 2D - Umgebungen ^6,7. Sie sind physiologisch relevanter, und die Ergebnisse sind daher sinnvoll. Als Beispiel zeigen in Hydrogelen eingebetteten Zellen 3D-ähnliche Strukturen , aber ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle in eine andere ^8,9. Jedoch ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle zur anderen, die Screening-Anwendungen erschwert. Eine alternative Strategie ist Single einzubettenZellen in mikrostrukturierten Hohlräumen ^10,11. Zell Position, Form, Polarität und interne Zellorganisation kann dann normalisiert werden. Neben der Bereitstellung von 3D-like Architektur an Zellen, Mikrokavitäten ermöglicht auch für High-Content - Screening - Studien ^10,12-14; Einzelzellen können in Microarrays und Zellorganellen und ihre Entwicklungen bestellt werden können parallel beobachtet werden. Diese Regelmäßigkeit liefert gute Statistiken mit geringen Anzahl von Zellen und eine bessere zeitliche / räumliche Auflösungen. Nützliche Verbindungen sind leichter zuverlässig zu identifizieren.

In dieser Studie zeigen wir die Herstellung und Anwendung einer neuen 3D-like Kultursystem einzelne Zellen für die High-Content-Screening - Anwendungen ^10,12,13. Die Vorrichtung besteht aus einer Anordnung von elastomerem Mikrokavitäten (10 ⁵ Hohlräumen / cm ^2), geprägt 'eggcups' (EC). Abmessungen und das Gesamtvolumen der EG in dieser Arbeit sind mit dem typischen Volumen einzelner NIH3T3 und HeLa-Zellen optimiertwährend der Zellteilung. Morphologie der Hohlräume - zylindrisch - richtig zu orientieren Zellform zur Sichtbarmachung von aktiven Prozessen ausgewählt wird. Replica Form wird Muster eine Anordnung von EC auf einen dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Glas geklebt verwendet ^15,16 Deckglas. Die Zellen werden in der EC durch Zentrifugation eingeführt. Wir berichten hier über die Beobachtung und Normalisierung der Zellorganellen (Aktin-Stressfasern, Golgi-Apparat und Kern) in 3D (EG) im Vergleich zu den gleichen Zellen auf 2D (flach) Oberflächen. Wir berichten auch die Beobachtung der aktiven dynamische Prozesse wie die Schließung des zytokinetischen Aktomyosin Ring während Mitose ^17. Schließlich zeigen wir Ergebnisse dieser Methodik auf anderen Systemen mit starren Wänden, wie Bäckerhefe, Spalthefe und C. elegans Embryonen , die die Anwendbarkeit unserer Methodik auf eine breite Palette von Modellsystemen bestätigt.

Wir präsentieren neben eine vollständige und genaue protokoll, um die 'eggcups' für 3D-Mikro herzustellen und anzuwenden. Unser Ansatz ist einfach und nicht ein sauberes Zimmer benötigen. Wir gehen davon aus, dass diese neue Methode besonders interessant für Wirkstoff-Screening werden Assays und personalisierte Medizin, in der Ersatz von Petrischalen. Schließlich wird unsere Vorrichtung zur Untersuchung der Verteilung von Zellen Reaktionen auf externe Stimuli, beispielsweise bei Krebs ¹⁸ oder in der Grundlagenforschung ¹⁹ nützlich sein.

Protokoll

1. Mikrofertigung von 'Eggcups'

1. Die Herstellung des Master: Mikrokavitäten Array
   1. Erhitzen Sie eine 3 '' Silizium-Wafer auf 200 ° C bis ob Feuchtigkeit verdunsten.
   2. Spin-Mantel eine dünne Schicht aus SU-8 Photoresist. Einstellen der Lautstärke Harz und Spinngeschwindigkeit in Abhängigkeit von der gewünschten Dicke und Photoresisttyp. Diese Dicke wird die Tiefe der 'eggcups' (EG) diktieren. Für eine 30 & mgr; m dicke Schicht und SU-8 2025, Spin-Beschichtung bei 2800 Umdrehungen pro Minute.
   3. Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 1 min (Schritt 1 von 2) für eine 30 & mgr; m dicken SU-8 2025 Schicht. Passen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Photoresist-Art und der Dicke gewünscht. Überprüfen Sie den Hersteller Datenblatt.
   4. Pre-Bake-Wafer bei 95 ° C für 3 min (Schritt 2 von 2) für eine 30 & mgr; m dicken SU-8 2025 Schicht. Passen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Photoresist-Art und der Dicke gewünscht. Überprüfen Sie den Hersteller Datenblatt.
   5. Laden Sie dasWafer auf der Mask Aligner für UV-Exposition. Legen Sie die photolithographische Maske auf sie. Die Maske zeigt ein Muster von kreisförmigen Merkmalen (Platten) von 20 & mgr; m im Durchmesser. Achten Sie auf einen einwandfreien Kontakt zwischen einander.
      HINWEIS: Verschiedene Hersteller Photolithographiemasken bieten. Die räumliche Auflösung wird die endgültigen Kosten bestimmen. Acetate Masken eine akzeptable Auflösung (≈10 um) zu niedrigen Kosten. Chrommasken eine bessere Auflösung, sind aber teurer. Anpassung der Durchmesser der Scheiben (von der photolithographischen Maske) zu dem Volumen der Zellen. Abmessungen der Scheiben auf der Maske wird der Durchmesser der Hohlräume des Gerätes bestimmen. Kleine Durchmesser wird auf einen niedrigen Füllung führen; zu großen Durchmesser wird nicht die Zellen begrenzen. Für HeLa und NIH3T3-Zellen, mit Durchmessern von 20 um bis 25 um vorgeschlagen.
   6. Überprüfen Sie die Leistung der UV-Lampe vor Exposition und entsprechend zu optimieren, die Belichtungszeit. Bestrahlen (Wellenlänge = 365 nm) 41,5 sec (oder die optimierte Belichtungszeit) bei250 mJ / cm ^2.
      HINWEIS: SU-8 2025 ein negativer Photoresist ist, was bedeutet, dass belichtete Bereiche mit UV ausgehärtet wird. In diesem Fall waren die kreisförmige Merkmale schwarz und der Rest transparent. Positive Photoresist-Arbeit auf dem umgekehrten Weg: nicht-belichteten Bereiche gehärtet sind. Wählen Sie die Photoresist entsprechend, abhängig von der Konstruktion und Photomaske.
      Hinweis: Um die Augen vor UV-Licht mit einer geeigneten Schutzbrille schützen.
   7. Entfernen Sie vorsichtig die Maske aus dem Photoresist-Schicht.
   8. Post-Bake dem Wafer bei 65 ° C für 1 min (Schritt 1 von 2) für eine 30 & mgr; m dicken SU-8 2025 Schicht. Post-Bake dem Wafer bei 95 ° C für 3 min (Schritt 2 von 2) für eine 30 & mgr; m dicken SU-8 2025 Schicht. Passen Sie die Zeit in Abhängigkeit von der Photoresist-Art und der Dicke gewünscht. Überprüfen Sie den Hersteller Datenblatt. Nach dem Post-Backen, Kühlen der Wafer auf Raumtemperatur auf der Bank für ca. 1 min.
   9. Platzieren Sie den Wafer in der Spin-Coater und fallen einige mm von SU-8-Entwickler zu deckendie gesamte Waferfläche. Entwickeln für 2 min und dann spin-coat für 30 sec bei 1000 rpm. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
   10. Spülen Sie mit 2-Propanol die vollständige Entfernung von unbebauten SU-8 zu gewährleisten. Auftreten von weißen Regionen ist ein Hinweis auf unvollständige Entwicklung. Wenn ja, wiederholen Sie den Entwicklungsschritt ein weiteres Mal.
   11. Hart backen dem Wafer bei 200 ° C Robustheit der hergestellten Mikrostrukturen zu gewährleisten. Dieser Schritt ist optional.
   12. Lagern Sie das 3 '' Wafer mit Mikrostrukturen in einem 94 mm x 15 mm Petrischale aus Polystyrol.
       HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit für die Oberflächenbehandlung, insbesondere Silanisierung, für die nächsten Schritte.
2. Herstellung des Polydimethylsiloxans (PDMS) Replica: Pfosten Array
   1. Gründlich mischen in einem Verhältnis von 1:10 (w / w) der Vernetzer und der Pre-Polymer für insgesamt 30 g in einem 50-ml-Tube.
      HINWEIS: 1:10 (v / v) Verhältnis Verwendung auch arbeiten.
   2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1800 × g für 5 minLuftblasen zu entfernen.
   3. Lassen Sie sanft die PDMS auf der Oberseite der Mikrostrukturen.
      HINWEIS: Wenn Luftblasen in diesem Schritt erscheinen, entgasen die Probe mit einer Vakuumpumpe für 15-20 min mit.
   4. Die Probe wird in einem Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden.
      HINWEIS: Die Härtungszeit variiert zwischen Benutzern und zusammen mit dem Vernetzer: pre-Polymeranteil. Dieses Mal wird die Steifigkeit der PDMS diktieren. Es wird empfohlen, über 2 h zu härten und zu einem festen Härtungszeit zu haften.
   5. Verwenden Sie ein Skalpell vorsichtig den Bereich von Interesse (Stempel) zu schneiden von etwa 1 cm ² , die etwa 10 ⁵ Mikrokavitäten oder 'eggcups' enthält.
      HINWEIS: Schneiden Sie zuerst die PDMS und dann schälen Sie sie vorsichtig ab. Prüfen Sie die Qualität des PDMS-Replik mit einem optischen Mikroskop.
3. Die Herstellung von 'eggcups' durch Replik Formen. Im Folgenden werden zwei alternative Strategien für die Herstellung von "eggcups 'beschrieben. Beide Protokolle sind Similar und identische Ergebnisse liefern:
   1. Strategie 1
      1. Aktivieren Sie die hergestellten PDMS-Stempel für 30 Sekunden durch Sauerstoffplasmabehandlung. Speichern vorübergehend die aktivierten Stempel in eine geschlossene Petrischale Ablagerung von Staub zu verhindern.
         HINWEIS: Stellen Sie die Belichtungszeit, wenn andere Gase für das Plasma verwendet werden.
      2. Platzieren Sie die aktivierten PDMS-Stempel der Oberseite nach oben (die Seite mit den Strukturen) in einer Petrischale neben einem 15-ml-Tube Kappe. Füllen Sie die Kappe mit 200 ul Trimethylchlorsilan (TMCS). Schließen Sie die Petrischale und lassen Sie den Stempel silanisieren für 7 min.
         HINWEIS: Einige temporäre Verformung auf dem Stempel und / oder Veränderung der Farbe (weiß) beobachtet werden. Der Stempel wird seine ursprüngliche Form in kurzer Zeit zu erholen und die Strukturen sind nicht betroffen.
         HINWEIS: TMCS produziert akute inhalative und dermale Toxizität und ist leicht entzündlich (bei Zündung Rückblende können über große Entfernungen zu kommen). Daher sollte sie weg in einem Abzug verwendet werden, von der Quelles der Zündung.
      3. Legen Sie die PDMS-Stempel auf dem Spin-Coater mit den Strukturen der Oberseite nach oben. Einen kleinen Tropfen von wenigen Mikrolitern (etwa 20 ul) der Flüssigkeit PDMS (1:10 w / w Vernetzer: pre-Polymer) auf die Oberseite der Strukturen. Spin-Beschichtung bei 1500 Upm für 30 sec mit einer dünnen Schicht von PDMS auf der Oberseite der Strukturen abzuscheiden.
         HINWEIS: den Stempel auf einer Petrischale Deckel mit einem kleinen Loch in der Mitte Wenn der Stempel nicht die Spin-Coater Futter Platz passt.
      4. Platzieren Sie den Stempel in den Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden die abgelagerte schleuderbeschichtet PDMS-Schicht zu härten.
      5. Aktiviere die dünne PDMS-Schicht durch die PDMS-Stempel upside up platzieren, zusammen mit einem Deckglas # 0 von 25 mm im Durchmesser, Sauerstoffplasmareiniger für 30 sec unter Verwendung von. Gehen schnell zum nächsten Schritt.
         HINWEIS: Die Deckgläser mit anderen Dicken, Formen und Abmessungen können ebenfalls verwendet werden. Allerdings könnten einige zelluläre Strukturen schwierig sein, auf der gewählten Deck Dicke sichtbar zu machen abhängig und ZielVergrößerung und / oder NA und / oder Arbeitsabstand. Überprüfen Sie die objektive Datenblatt.
      6. Legen Sie in Kontakt, um die Stempel (die Seite mit der dünnen spinnbeschichteten Schicht) mit dem Deckglas. Drücken Sie sanft auf der ganzen Oberfläche des Stempels mit einer Pinzette die "Bindung" zu machen. halten schließlich einen konstanten Druck auf die Oberseite des Stempels für ca. 10 sec.
      7. Nach 30 Minuten sanft 'schälen' der Stempel aus dem Deckglas , um zu "befreien" 'eggcups "(siehe Abbildung 1). Gründlich mit Ethanol und trocken. Wenn PDMS 'eggcups' sind nicht gut auf dem Deckglas geklebt ( das heißt , sie während der "unpeeling 'Schritt zu lösen), sollten Sie die Einstellungen des Plasma - Reiniger Einstellung und starten Sie in Schritt 1.3.1.5.
         HINWEIS: Dieser Schritt ist heikel. Achten Sie darauf, um ein Brechen des Deckglases und / oder Ablösen der dünnen PDMS-Schicht zu vermeiden.
      8. Kleben Sie ein kleines Stück (Handle) des gehärteten PDMS von 1 mm x 1mm x 3 mm am Rand des Deckglases mit einem kleinen Flüssigkeitstropfen PDMS in Volumen und die PDMS wie zuvor auszuhärten. Dadurch wird die Manipulation der Probe danach (siehe Abbildung 1) erleichtern. Dieser Schritt ist optional.
   2. Strategie 2
      1. Hydrophilisierung der hergestellte PDMS-Stempel durch Sauerstoffplasmabehandlung für 30 Sekunden. Speichern vorübergehend die aktivierten Stempel in einer verschlossenen Petrischale bis Ablagerung von Staub zu verhindern.
         HINWEIS: Stellen Sie die Belichtungszeit, wenn andere Gase für das Plasma verwendet werden.
      2. Hydrophilisierung der Durchmesser von 25 mm Glasplättchen # 0 Sauerstoffplasmabehandlung bei 15 W für 30 Sekunden. Gehen schnell zum nächsten Schritt.
         HINWEIS: Die Deckgläser mit anderen Dicken, Formen und Abmessungen können ebenfalls verwendet werden. Allerdings werden zelluläre Strukturen schwierig sein, zu visualisieren, auf der gewählten Deck Dicke und objektiven Merkmalen abhängig (siehe Hinweis oben).
      3. Spin-coat ein kleiner Tropfen PDMS (1:10 w / w Vernetzer: pre-polYmer) von wenigen Mikrolitern auf die Glasplättchen. Spin-Beschichtung bei 1500 Upm für 30 sec für eine endgültige Dicke von etwa 50 um.
      4. Kleben ein kleines Stück (handle) des ausgehärteten PDMS von 1 mm x 1 mm x 3 mm in Volumen am Rand des Deckglases mit einem kleinen Tropfen der flüssigen PDMS und aushärten wie zuvor die PDMS. Dadurch wird die Manipulation der Probe danach (siehe Abbildung 1) erleichtern. Dieser Schritt ist optional.
      5. Bewahren Sie vorübergehend die PDMS-beschichtete Deckgläser auf ein sauberes in einer Petrischale abwischen von Staubablagerungen zu schützen.
      6. Geben Sie einen Tropfen Silanisierungsreagenz oben auf jeder Marke und lassen Sie es für 1-2 Minuten verdampfen. Dann trocknen Sie sie unter einem Strom von N _2.
         HINWEIS: In diesem Schritt kann eine vorübergehende Verformung des Stempels während der Verdampfung beobachtet werden. Der Stempel wird seine ursprüngliche Form nach dem Trocknen mit N ₂ ohne bleibende Verformung von Mikrostrukturen zu erholen.
      7. Lassen Sie sehr vorsichtig auf die silanisierte Stempel oben auf derPDMS-Spin-beschichtet in der Petrischale aufbewahrt Deckglas. Stellen Sie sicher, dass beide Seiten vollständig während des Kontaktes parallel sind. Vermeiden Sie drücken oder den Stempel zu bewegen, nachdem sie auf die PDMS-beschichtete Deck platzieren.
      8. Platzieren Sie die Petrischale mit Proben im Vakuum für 1-2 h Luftblasen zu entfernen.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig horizontal sind Stempel Verschiebung zu vermeiden. Vermeiden Sie auch möglicherweise Vibrationen durch die Vakuumpumpe verursacht.
      9. Platzieren Sie die Proben im Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden.
      10. Vorsichtig schälen den Stempel zu offenbaren 'eggcups' ab. Gründlich mit Ethanol und trocken.
          HINWEIS: Praxis an dieser Stelle erforderlich ist. Achten Sie darauf, einen Bruch des Deckglases und / oder Ablösen der dünnen PDMS-Schicht zu vermeiden.

2. Einführung in Zellen in die 'Eggcups'

Um Säugerzellen im Inneren 'eggcups', PDMS-Oberfläche ne einführeneds um mit Adhäsionsproteine ​​der extrazellulären Matrix funktionalisiert werden. Dieses Beispiel verwendet Fibronektin aber andere interessierende Proteine, wie Kollagen, verwendet werden könnten.

1. Hydrophilisieren die 'eggcups' in der Sauerstoffplasma-Reiniger für 30 sec.
   HINWEIS: Optimieren Sie die Parameter, wenn nötig.
2. Bereiten Sie eine Lösung in PBS 1x von 20 ug ml ^-1 Fibronektin aus Rinderquellen.
3. Sterilisieren Sie die 'eggcups' mit UV für 5 min. Abzuscheiden einen kleinen Tropfen (etwa 20-50 & mgr; l) von Fibronektin-Lösung die gesamte 'eggcups' Bereich abzudecken und für 1 h bei RT inkubiert. Schützen Sie die Probe vor dem Austrocknen.
4. Spülen Sie vorsichtig die 'eggcups' mit PBS 1x. 3-mal wiederholen.
   ANMERKUNG: Die Probe ist fertig für mehrere Wochen im Dunkeln bei 4 ° C gelagert oder sofort verwendet werden.
5. Einführung eines zylindrischen maßgeschneiderten Kunststoff-Stück von 63 mm in der Höhe, 26 mm Außenradius und 7 mm Innenradius Dimensionen in einen 50-ml-Röhrchen (sieheAbbildung 2) ²⁰
   ACHTUNG: Verwenden Sie UV-Sterilgut oder sie vor Gebrauch sterilisiert werden.
   HINWEIS: Dieses Stück leicht im Labor hergestellt werden. oder von jeder verfügbaren Werkstatt.
6. Stellen 13 ml Zellkulturmedium im Inneren des Rohres (siehe Tabelle 1). Das Medium sollte mindestens 2 cm über dem zylindrischen Stück füllen vollständiges Eintauchen der Probe zu gewährleisten.
   Hinweis: Einzelheiten zu spezifischen Zelltypen und andere Modellsysteme wie Hefe oder C. elegans Embryonen und das entsprechende Medium verwendet wird , finden Sie in Abschnitt 5 und Tabelle 1. Das beschriebene Protokoll wurde optimiert für HeLa, NIH3T3 - Zellen und anderen Zelllinien (siehe Tabelle 1).
7. Einführung sehr sanft die 'eggcups' innerhalb des Rohrs und parallel zur Oberseite des Kunststoffteils. Scharfe Pinzette, um die Probe mit dem PDMS Griff zu halten. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas, bis es liegt auf der Oberseite des Kunststoffteils, unbis es vollständig eingetaucht ist (siehe Abbildung 2).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, scharf und gerade Pinzette zu verwenden. Mit gebogenen Pinzette, ist die Manipulation der Probe schwierig und kann zum Bruch führen.
8. Kulturzellen bis 80-100% Zusammenfluß in einer P60 Petrischale und sammeln sie durch Trypsinierung.
   HINWEIS: Die Zellen können bei jedem Medikament von Interesse Wildtyp transfiziert oder behandelt werden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Zellaggregaten, die einzelnen Zellen zu vermeiden werden die 'eggcups' einzugeben. Zur Optimierung der diesen Schritt, Pipette nach oben und unten gründlich nach Trypsinierung.
9. Resuspendieren Zellen in 5 ml Kulturmedium. Je 200 & mgr; l von Zellen auf der Oberseite der 'eggcups'.
   HINWEIS: Drop-Zellen so weit wie möglich an der Spitze der 'eggcups' zentriert aber körperlichen Kontakt zu vermeiden. Dies wird Bruch und / oder Beschädigungen der Probe zu verhindern.
10. Zentrifuge bei 1.800 × g für 2 min.
    HINWEIS: Nach der ersten Zentrifugation, Check-in ein MikrofonROSCOPE den Füllgrad der 'eggcups'.
11. Pipette wieder 200 ul Zellen auf der Oberseite der 'eggcups' und Zentrifuge bei 1800 × g für 2 min. Wiederholen für insgesamt dreimal um den Füllgrad zu optimieren.
    HINWEIS: Nach der letzten Zentrifugation, überprüfen Sie mit einem Mikroskop den Füllgrad von 'eggcups'. Falls erforderlich, wiederholen Sie die Füllung + Zentrifugationsschritte, bis die gewünschte Füllgrad erreicht.
12. Entfernen Sie die Probe aus dem Rohr die scharfen Pinzette Halten des PDMS Griff. Achten Sie darauf , in nicht 'störende' Zellen , vorsichtig zu sein , die in den 'eggcups' gehalten werden (siehe Abbildung 2).
13. Die Probe wird in einer Petrischale mit Medium. Spülen Sie den Überschuss an Zellen zu entfernen, die nicht in den 'eggcups' sind durch Auf- und Abpipettieren dreimal sanft neben jeder Seite (insgesamt 4 Seiten) des Mikroarrays.
    HINWEIS: Pipettieren zu stark freisetzen könneneinige Zellen aus den 'eggcups'.
14. Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium nicht gebundenen Zellen zu entfernen.
    HINWEIS: In diesem Schritt ein Medikament von Interesse hinzugefügt werden können.
15. Fix-Zellen oder bereiten sie für Zeitraffer imaging.See Schritt 4.1.

3. Beobachtung von Active Cellular Dynamics in 'Eggcups': zytokinetischen Ringschluss

HINWEIS: In diesem Beispiel werden HeLa-Zellen, die mit MYH10-GFP und LifeAct-mCherry für Myosin und Aktin transfiziert sind jeweils Schlüssel aktive Moleküle in der zytokinetischen Ringschluss während Zellteilung beteiligt. Die Vorrichtung ist mit Mikrokavitäten von 25 um Durchmesser hergestellt. Für ihre Beobachtung wurde ein Epifluoreszenz inverses Mikroskop verwendet wird, mit einem 60x Öl-Objektiv (1,40 NA, DIC, Plan Apo) und GFP (Myosin) und TxRed (Aktin) Filter ausgestattet. Alternativ wurde ein aufrechter konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 25X oder 63X HCX IR APO L Wasser Ziel (0,95 NA). Aus diesem EXAmple, ist es sehr zu empfehlen Zellen zu synchronisieren , indem Sie den doppelten Thymidin Block, mitotischen Block oder mitotischen shake-off - Methode ^21-24 mit.
HINWEIS: Die Dicke der verwendeten PDMS für die "eggcups 'erlaubt die Verwendung einer Vielzahl von Zielen sowohl in invertierter und aufrecht positioniert Mikroskopen.

1. Place 'eggcups' in ein Mikroskop Halter und füllen Sie es mit 1 ml 10% FCS-L-15 Beobachtungsmedium. eine dünne Schicht von Mineralöl auf der Oberseite des medium.Select der 60X Öl-Objektiv Um zu vermeiden, Verdunstung, einen Glasdeckel auf der Oberseite des Halters oder anwenden.
   HINWEIS: L-15 - Medium ist ausreichend für Nicht-CO ₂ Atmosphären. Beachten Sie auch, dass einige Verbindungen von DMEM sind Autofluoreszenz. Wenn dieses Medium verwenden, empfiehlt es sich mit hoher Intensität Lampe die fluoreszierenden Verbindungen photobleach von 1-2 Stunden zu beleuchten.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Kunststoffdeckel mit, wenn sie mit der DIC-Bildgebung arbeiten.
2. Die Halterung mit 'eggcups' und Observation Medium in das Mikroskop. Konzentrieren Sie sorgfältig Hellfeld- Licht, bis die 'eggcups', und die Zellen sind in der gleichen Ebene der Beobachtung.
3. Öffnen Sie die Software und passen Sie die Parameter. Wählen Sie die Filter TxRed und GFP für Aktin und Myosin; die Expositionszeit für jeden Kanal eingestellt werden. Eine typische Erfassungsrate beträgt 5 sec für beide Kanäle.
   HINWEIS: Die Expositionszeit im Setup verwendet werden müssen angepasst je kann, Farbstoff oder andere Zellorganellen von Interesse.
4. Wählen Sie die Region von Interesse und suchen nach einem zytokinetischen Ring entweder mit dem GFP oder TxRed Kanal. genau im Fokus.
   HINWEIS: Der Ring schärfer in Myosin und leichter zu erkennen.
5. Führen Sie die automatische Erfassung in beiden Kanälen, bis der Ring vollständig geschlossen ist.
   HINWEIS: Einige können Photobleichens beobachtet werden. Passen Sie die Mikroskop-Parameter, um sie zu reduzieren.

4. Die Beobachtung der Festzellorganellen in die 'Eggcups'

Dieser Schritt kann vor oder nach dem Schritt # 3 durchgeführt werden. Zellen können direkt nach dem Zentrifugationsschritt befestigt werden und für das Organell von Interesse oder nach der Beobachtung im Mikroskop gefärbt. Dieses Beispiel zeigt die Färbung der Golgi Apparat, Kern und Aktin-Fasern auf NIH3T3 Fibroblasten in "eggcups '.

1. Die Fixierung der Zellen in der 'Eggcups'
   1. Vorbereitung 3% Paraformaldehyd (PFA) und warm bei 37 ° C. Entfernen Sie die 'eggcups' Probe aus dem 50-ml-Röhrchen (oder dem Mikroskop Halter) und legen Sie sie in einer P35 Petrischale. Spülen Sie einmal mit PBS 1x.
      HINWEIS: Protokolle für die Herstellung von 3% Paraformaldehyd sind weit anderswo erhältlich.
      VORSICHT: Nitril Handschuhe und Augenschutz bei der Herstellung von PFA.
   2. Entfernen Sie die PBS vollständig und legen 1 ml 3% PFA und Inkubation für 17 min. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 1 ml PBS 1X. Permeabilisieren Zellen unter Verwendung von 1 ml von 0,5% Tritauf 3 min und zweimal waschen mit PBS 1x 5 min.
2. Anfärben von Zellen in 'Eggcups'
   1. Inkubiere Zellen für Golgi-Apparat Färbung mit dem primären Antikörper polyklonalen Kaninchen-anti-Giantin in einer 1: 500-Verdünnung in PBS. Legen Sie ein 100 & mgr; l Tropfen Antikörperlösung auf eine Kunststofffilmblatt und Inkubation der Zellen innerhalb der 'eggcups' den Kopf für 45 min.
      Hinweis: Schützen Sie die Probe mit einem Deckel zu Austrocknen zu verhindern.
   2. Lösen Sie sorgfältig die 'Eggcups' und legen Sie sie in eine P35 Petrischale. Spülen Sie 3-mal, jeweils 5 min mit PBS 1x.
   3. Bereiten Sie einen Cocktail in PBS mit dem sekundären Antikörper Cy3 Ziege-Anti-Kaninchen (1: 1000) und mit Phalloidin Alexa Fluor 488 (1: 200) zum Färben von Aktin-Stressfasern.
   4. Inkubieren Zellen mit einer 100 & mgr; l Tropfen Antikörperlösung auf eine Kunststofffilmblatt und inkubieren Zellen im Inneren der 'eggcups' den Kopf für 45 min.
   5. Veröffentlichung sorgfältig die 'eggcups 'und sie in eine P35 Petrischale legen. Spülen Sie 3-mal, jeweils 5 min mit PBS 1x.
   6. Inkubieren Zellen für Kernfärbung 100 & mgr; l Tropfen von 1 & mgr; g ml ^-1 DAPI in PBS auf eine Kunststofffilmblatt und inkubieren Zellen im Inneren der 'eggcups' den Kopf für 45 Minuten setzen. Dieser Schritt kann mit Schritt 4.2.3 durchgeführt werden.
   7. Lösen Sie sorgfältig die 'eggcups' und legen Sie sie in eine P35 Petrischale. Spülen Sie 3-mal, jeweils 5 min mit PBS 1x.
   8. Berg-Zellen 15 & mgr; l Glycerin mit: PBS (1: 1 v / v) auf einem Standard-Mikroskopobjektträger aus Glas und versiegeln Sie die Probe mit Nagellack ein Austrocknen zu verhindern.
      HINWEIS: In Abhängigkeit von der Dicke "eggcups ', Montage schwierig sein kann. Es wird empfohlen, die Probe in eine P35 Petrischale zu speichern dann in PBS, vor dem Austrocknen geschützt.
3. Mikroskop Beobachtung
   HINWEIS: Für dieses Beispiel ein aufrechter konfokales Mikroskop verwendet wird, mit PMT und Hybrid-Detektoren ausgestattet. A 25X oder 63 X HCX IR APO L Wasser Ziel (0,95 NA) wurde ein weites Feld der Probe zu liefern ausgewählt und zeigen die Anwendbarkeit der Vorrichtung für High-Content-Screening-Anwendungen.
   1. Wählen Sie das 25X oder 63X Wasser Ziel.
      HINWEIS: Unterschiedliche Ziele können je nach Anwendung und Signal verwendet werden. Aber Nutzung der hohen numerischen Apertur Ziele wird empfohlen.
   2. Legen Sie die feste Probe mit den 'eggcups' und konzentrieren sich sorgfältig Hell- Licht (Phasenkontrast oder DIC), bis die 'eggcups' und Zellen sind in der Ebene der Beobachtung.
   3. Öffnen Sie die Software und passen Sie die Parameter. Wählen Sie die Filter GFP, Cy3 und DAPI für Aktin, Golgi und Kern Beobachtung sind; die Expositionszeit für alle Kanäle einstellen.
      HINWEIS: Die Belichtungszeit in Abhängigkeit von der Einrichtung angepasst werden müssen können.
   4. Wählen Sie und die Region von Interesse zu konzentrieren; Start der Bildaufnahme (siehe Abbildung 3).

tle "> 5. Die Anpassung für die Beobachtung von Hefezellen und C. elegans Embryo

1. Fission und Budding Hefezellen
   HINWEIS: In diesem Beispiel wird Spalthefezellen, die mit RLC1-mCherry und CHD-GFP für Myosin und Actin, jeweils markiert. Die angehenden Hefezellen sind nicht fluoreszierend hier markiert. Für Spalthefe Beobachtung wurde eine invertierte Kreiselscheibenapplikators konfokales Mikroskop verwendet. A 100X HCX PL APO CS Öl-Objektiv (1,4 NA) wurde für alle Akquisitionen verwendet. Alternativ wurden die Zellen auch einen invertierten Phasenkontrastmikroskop mit einer 20X Phasenkontrastluftziel ausgestattet beobachtet unter Verwendung LCPlanFl (0,4 NA). In diesem Beispiel ist das Protokoll für die beiden Zelltypen identisch.
   1. Bereiten Sie die 'eggcups' Oberfläche wie oben beschrieben. Für Spaltung und Hefezellen Knospung, bereiten Hohlräume von 5 & mgr; m im Durchmesser (siehe Tabelle 1). In diesem Fall braucht die Oberfläche nicht mit Adhäsionsproteine ​​funktionalisiert werden müssen.
      HINWEIS: Die Füllung can unter Verwendung von konischen 'eggcups' optimiert werden. Diese Form fängt und hält die Zellen während der Spülschritt Freisetzung nach der Zentrifugation zu vermeiden. Prozentsatz Füllung ist bei etwa 80% optimal. Diese konischen 'eggcups' kann mittels Deep Reactive Ion Etching ¹³ hergestellt werden.
   2. Kultur von Hefezellen in der richtigen Kulturmedium (siehe Tabelle 1) , bis eine optische Dichte (OD) im Bereich von 0,2 und 0,8 erreicht. Beschallen die Kultur von Hefezellen Aggregate zu entfernen.
   3. Legen Sie Hefezellen in 'eggcups' durch Zentrifugation. Für die Zentrifugation wurden 4 ml der kultivierten Zellen in dem entsprechenden OD wird mit 'eggcups' auf den Röhrchen zugesetzt. Nach der ersten Zentrifugation leicht schütteln die Röhre Zellen erneut zu suspendieren, die nicht in den "eggcups 'sind, während die Zellen in den" eggcups' nicht gestört werden. Ohne das Rohr, Zentrifuge wieder zu öffnen und zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. Dies gewährleistet die Abscheidungsvon Zellen aus der Kultur in die leeren Mikrokavitäten und den Füllgrad zu erhöhen.
      HINWEIS: Wenn mit Hefe funktioniert, ist es empfehlenswert, während der Experimente die Zentrifuge auf die Arbeitstemperatur vorzuheizen
      HINWEIS: Das Protokoll hier angehalten und später bis 12 Stunden fortgesetzt werden kann. In diesem Fall speichern die Probe bei der Arbeitstemperatur und bedecken sie die Verdampfung zu verhindern.
   4. Setzen Sie 'eggcups' in einem Mikroskop Halter und füllen Sie den Halter mit Filter sterilisierte Medium für die Bildgebung. Jetzt Spülen der Zellen mit dem gleichen Medium, bis die schwebenden Hefezellen effizient entfernt werden. Achten Sie darauf, nicht in Zellen 'eggcups' während des Spülvorgangs zu stören.
   5. Wählen Sie das 100X Öl-Objektiv und sorgfältig zu konzentrieren. Öffnen Sie die Software und passen Sie die Parameter. Für Spalthefe, wählen Sie den Filter GFP und TxRed für Aktin und Myosin und die Expositionszeit für beide Kanäle einzustellen. Eine typische Erfassungsrate beträgt 3 sec.
      HINWEIS: Je nachdie Fluorophore, die Art der Kennzeichnung und der Set-up, Belichtungszeit variiert für andere Systeme.
2. C. elegans Embryo
   HINWEIS: In diesem Beispiel wird C. elegans Embryonen 25-30 & mgr; m breit und 50 bis 55 & mgr; m lang. Die Embryonen kultiviert wurden angezeigt , wie in ^25. Ein einfaches visuelles Protokoll, wie C. zu manipulieren elegans kann in ²⁶ gefunden werden. Die Beobachtung wurde unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop mit einem 40-fach Luftziel 0,55 NA ausgestattet war.
   1. Bereiten Sie die 'eggcups' Oberfläche wie oben beschrieben , und 25 & mgr; m im Durchmesser (siehe Tabelle 1). In diesem Fall braucht die Oberfläche nicht mit Adhäsionsproteine ​​funktionalisiert werden müssen.
   2. Kultur der C. elegans Embryonen in der richtigen Kulturmedien (siehe Tabelle 1).
   3. Legen Embryonen in 'eggcups' durch Zentrifugation wie oben beschrieben, unter Verwendung von Reinstwasser als Kulturmedium (Abschnitt 2,6-2,12 sehen).
      HINWEIS: Die Embryonen wurden für die Dauer des Experiments normalerweise in Reinstwasser 'verhalten'. Als Alternative kann eine physiologische M9 Puffer für Langzeitexperimente.
   4. Spülen Sie die Probe wie oben beschrieben (siehe Abschnitt 2.14). Legen Sie die 'eggcups' in ein Mikroskop Halter. Wählen Sie das Luftziel 40X und sorgfältig zu konzentrieren. Öffnen Sie die Software und passen Sie die Parameter. Wählen Sie eine Erfassungsrate von 3 sec.

Ergebnisse

Die 'eggcups' (EG) sind eine neue hohen Gehalt-Screening-Methode, die die Visualisierung von orientierten Zellen und Embryonen in einer 3D-Umgebung ermöglicht. Darüber hinaus werden einige zelluläre Prozesse, die in Standard - 2D (flach) Kulturen zu beobachten schwierig sind, können durch diese neue Methode zu beobachten. 1a zeigt eine Zusammenfassung des Verfahrens für die EG - Mikrofabrikations (siehe auch Abschnitt 1 in der oben beschriebenen Protokoll ). Das Verfahren ist einfach, schne...

Diskussion

Replica Formen wurde verwendet, um die "eggcups 'herzustellen. Der Herstellungsprozess muss nicht ein sauberes Zimmer; es ist leicht und einfach, auch wenn einige der Praxis erforderlich sein kann. Insbesondere die PDMS-Stempel Loslassen ist der wichtigste Schritt, um einen großen Bereich von hoher Qualität "eggcups 'zu erzeugen. Aus diesem Grund hat besondere Sorgfalt in diesem Schritt genommen werden. Wenn dieser Schritt wiederholt fehlschlägt, sollten Sie die Plasma-Reiniger Parameter an die Sila...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2