Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Zusammenfassung

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Zusammenfassung

BDNF spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Facetten neuronale Überleben, Differenzierung und Funktion. Strukturelle und funktionelle Defizite der Axone werden zunehmend als eine frühe Funktion von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit (HD) angesehen. Noch unklar ist der Mechanismus (en), durch die axonale Verletzung induziert wird. Wir berichteten über die Entwicklung einer neuen Technik zur Herstellung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Quantenpunkt-markierten BDNF (QD-BDNF) wurde durch Konjugation Quantenpunkt 655 bis mBtBDNF produziert. Eine mikrofluidische Vorrichtung wurde verwendet, um die Axone von Neuronen Zellkörper zu isolieren. Zugabe von QD-BDNF auf die axonalen Fach erlaubt die Live-Darstellung von BDNF Transport in Axonen. Wir zeigten, dass QD-BDNF retrograd bewegt wesentlichen ausschließlich mit wenigen Pausen, bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s herzustellen. Dieses System kann verwendet werden, um mich zu untersuchennismen der axonalen Funktion gestört in AD oder HD, wie auch andere degenerative Erkrankungen.

Einleitung

Neuronen sind stark polarisiert Zellen, deren lange und oft sehr ausgearbeiteten Prozesse sind von grundlegender Bedeutung für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion neuronaler Schaltkreise. Das Axon spielt eine wichtige Rolle bei der Durchführung Ladungen zu und von Synapsen. Proteine ​​und Organellen in der Zelle synthetisiert Soma müssen durch Axone transportiert werden, um die präsynaptischen Terminal zu erreichen, um neuronale Funktion unterstützen. Entsprechend empfangenen Signale an distalen Axone müssen transduziert werden und zu der Soma. Diese Verfahren sind für das neuronale Überleben, Differenzierung und Wartung. Dadurch axonalen Transport in manchen Neuronen müssen über Entfernungen mehr als 1000-mal der Durchmesser des Zellkörpers durchgeführt werden, ist die Möglichkeit, ohne weiteres vorstellbar, dass auch kleine Mängel konnten deutlich beeinflussen und neuronalen Schaltungsfunktion.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ein Mitglied der Neurotrophin-Familie von Wachstumsfaktoren in mA vorliegtny Hirnregionen, einschließlich Hippocampus, Großhirnrinde und des basalen Vorderhirns. BDNF spielt eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung und Gedächtnis-Bildung durch Unterstützung des Überlebens, der Differenzierung und der Funktion von Nervenzellen, die in der kognitiven Schaltungen teilzunehmen. BDNF an seinen Rezeptor bindet, der Tyrosinkinase TrkB am Axonendigung wo es aktiviert TrkB-vermittelte Signalwege, einschließlich der Mitogen-aktivierte Proteinkinase / extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinase (MAPK / ERK), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Phospholipase C-gamma (PLC & ggr). Die Proteine, die in diesen Signalwegen beteiligt sind, auf endozytischen vesikulären Strukturen verpackt, um das BDNF / TrkB Signal Endosomen ^1-6, die dann retrograd in die neuronalen Soma transportiert zu bilden.

Mikrofluidische Kulturkammer ist eine sehr nützliche Plattform für die Untersuchung der Biologie axonalen unter normalen Bedingungen als auch bei der Einstellung von Verletzungen und Krankheits ^7,8. Durch die Isolierung Axoneaus den Zellkörpern, hat das Gerät darf man speziell in Transport Axone ^8-10 studieren. Die PDMS basiert mikrofluidische Plattformen mit 450 um Mikronut Barrieren in dieser Studie verwendet wurden kommerziell erworben (siehe Materialien Tabelle). BDNF Transport zu untersuchen, entwickelten wir eine neuartige Technologie, um monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF) zu erzeugen. Wir nutzten die Biotin-Akzeptor-Peptid, AP (auch als AviTag bekannt). Es ist ein 15-Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest, der spezifisch an Biotin durch den Escherichia coli-Enzym-Biotin-Ligase BirA ligiert werden kann, enthält. Fusionierten wir die AviTag an den C-Terminus der Maus pre-proBDNF cDNA durch PCR (Abbildung 1a). Das Konstrukt wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3.1 myc-His-Vektor kloniert. Wir geklont auch die bakterielle DNA in die BirA pcDNA3.1 myc-Vektor sein. Die beiden Plasmide wurden transient in HEK293FT Zellen co-transfiziert, um beide Proteine ​​exprimieren. BirA katalysiert die Ligation von Biotin spezifisch an das Lysin liegen im AviTag am C-Terminus von BDNF in einem Verhältnis 1: 1 bis monobiotinylierte BDNF-Monomers. Biotinylierte, reifen BDNF mit einer Molekularmasse von ~ 18 kDa wurde gewonnen und aus den Medien unter Verwendung von Ni-Harz (1C) gereinigt. Die Biotinylierung von BDNF war vollständig, wie durch die Unfähigkeit beurteilt unmodifizierten BDNF durch Immunoblotting (Figur 1D) zu erfassen. Streptavidin konjugierten Quantenpunkte, QD 655, wurden verwendet, um zu kennzeichnen, um mBtBDNF QD-BDNF zu machen. Die Anwesenheit des AviTag nicht mit der Aktivität von BDNF stören die mBtBDNF konnte phosphorylierten TrkB (1E) zu aktivieren und stimulieren das Neuritenwachstum (1F), um das Ausmaß des rekombinanten menschlichen BDNF (rhBDNF). Immunfärbung gezeigt, dass QD-BDNF kolokalisiert mit TrkB in Hippocampus-Axone, die anzeigt, dass QD-BDNF bioaktiv (1G). Um die BDNF Transport zu untersuchen, wurde QD-BDNF zu distalen Axon Fach hinzugefügtMikrofluidik-Kulturen mit Rattenhippocampusneuronen E18 (2A). QD-BDNF retrograden Transport in Axonen wurde von Echtzeit-Live-Bildgebung des roten Fluoreszenzmarkierung (Trag Videos S1, S2) erfasst. Durch die Analyse der erzeugten kymograph, QD-BDNF beobachtet wurde retrograd mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s (3A) transportiert werden. GFP oder mCherry-markierten BDNF wurden zur axonalen Bewegung von BDNF zu verfolgen. Die Hauptnachteile sind, dass sie nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Auch die Gegenwart von sowohl anterograden und retrograden BDNF Bewegungen macht es schwierig, zu beurteilen, ob die retrograd transportiert BDNF war in einem Neurotrophin / Rezeptor-Komplex.

In diesem Video zeigen wir die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. Die ultrabrightness und ausgezeichnete Photoquantenpunkte makes es möglich, langfristige Verfolgung von BDNF Transport durchzuführen. Diese Techniken können genutzt werden, um Studien der axonalen Funktion in AD, HD, und andere neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern.

Protokoll

Chirurgische und Tierverfahren werden streng nach dem NIH-Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente, die die Verwendung der Tiere werden von UCSD Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Plasmid Klonierung, Expression und Reinigung von Mono-biotinyliert BDNF (mBtBDNF)

HINWEIS: Konstruieren Sie vor-und proBDNFavi BirA cDNA in pcDNA3.1-Vektor und coexprimieren in HEK293FT Zellen ^10. Reinigen mBtBDNF mit Ni-NTA-Kügelchen nach bisher veröffentlichten Verfahren zur Herstellung von reifen und biologisch aktive monobiotinylierte Nervenwachstumsfaktor (mBtNGF) ^10.

2. Herstellung von Mikrofluidik-Chambers

Mikrofluidik-Neuronenkultur-Vorrichtung ermöglicht es, fluidisch zu isolieren Axone von Neuron Zellkörper. Montieren Kammern mit frisch beschichtete Deckgläser Recht vor jeder Sektion. Mikrofluidischen Kammern verwendetin diesem Protokoll sind kommerziell erhältlich (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle). Handwäsche und wiederverwendet werden kommerziell erworben Kammern bis zu 5-6x.

1. Handwäsche mikrofluidischen Kammern in 1% Alconox. Dreimal mit Milli-Q-Wasser spülen für 30 Minuten jeweils. Handwaschkammern wieder in 70% Ethanol.
2. Legen Sie Kammern auf Parafilm in der Sterilbank trocknen. Strahlen und sterilisieren Sie beide Seiten der Kammern für 20 min unter UV. Speicher sterilisiert Kammern in einer sterilen 15-cm-Schale mit Parafilm verschlossen und bei Raumtemperatur.
3. Platz 24 x 40 mm Nr 1 Deckgläser in einem Glasbehälter. Weichen Sie die Deckgläser in 35% Salzsäure über Nacht auf einem Rotator. Am folgenden Tag, spülen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 30 Minuten mit Wasser.
4. Sterilisieren Sie die Deckgläser eine nach der anderen durch Eintauchen jedes Deckglas in 100% Ethanol und flammenden über einem Bunsenbrenner. Trocken lagern Deckgläser in einer sterilen Petrischale und halten Sie sie bei Raumtemperatur bis zur Beschichtung.
5. Legen out die Deckgläser in einer 15 cm Kulturschale. Mantel jedes Deckglas mit 0,7 ml 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) und Inkubation in der Haube bei Raumtemperatur.
6. Nach 1 Stunde, spülen Sie die Deckgläser dreimal mit sterilem Wasser. Trockendeckgläser mit Vakuum und findet jedes Deckglas in eine 6 cm Kulturschale.
7. Um die mikrofluidische Kammer montieren, platzieren Sie die Kammer mit Mikrorille Seite an der Unterseite auf die PLL beschichtete Deckglas mit Vorsicht die Mikrorillen nicht zu berühren. Sanft in die Kammer gedrückt, mit einer Pipettenspitze, um sicherzustellen, wurde die Kammer dicht verschlossen.

3. Dissection neuronaler Kultur und Platte auf Chambers

1. Legen Sie zwei E17-E18 Rattenhippokampi (ein Gehirn) in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Puffer Dissektion (HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium seziert, mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10 mM HEPES. Spülen die Gewebe 3x mit 5 ml Dissektion Puffer jeder Zeit. Entfernen Sie die Dissektion Puffer so viel wie möglich und fügen Sie 900 ml frisches dissection Puffer.
2. , Um das Gewebe zu verdauen, 100 l 10x Trypsin (2,5%) in die Dissektion Puffer 1x Arbeitskonzentration zu machen. Legen Sie die konische Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Nach 10 min wurde der Verdau wird mit 100 ul 10 mg / ml DNase I bis zu einer Endkonzentration ca. 1 mg / ml.
3. Mit Hilfe eines feuerpolierten Pasteur Glaspipette, sanft verreiben das Gewebe durch Auf-und Abpipettieren 5-10x. Gleich nach Verreiben, löschen den Trypsin mit 2 ml Agarmedium (Neurobasal mit 10% FBS, 2 mM Glutamax, 2% B27).
4. Verlassen Sie die Probe in der Haube für 5 min auf alle Ablagerungen der Gewebe ermöglichen, auf den Boden niederzulassen. 2 ml Überstand vorsichtig entfernen in eine saubere sterilen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Das Pellet in 50 ul Plattierungsmedien
5. Zählen Sie die Zellen mit Zählkammer. Last 15-20 ul Zellsuspension (~ 40.000 Zellen) in einem Abteil des mikrofluidischen Kammer. Legen Sie die Kammerin den Inkubator für 10 Minuten, damit sich die Zellen an den Deck befestigen. Nach 10 Minuten, fügen Sie mehr Plattenmedien zu füllen beide Fächer der Kammer.
6. Am zweiten Tag der Präparation vollständig die Plattenmedien mit wartungs Medien ersetzen (Neurobasal mit 2 mM Glutamax, 2% B27) sowohl in der Zellkörper und das Axon Fach. Axone von den Neuronen im Hippocampus zu starten, um die Mikrorillen in Tag 3 überqueren und erreichen das Axon Raum zwischen Tag 5-7. Während dieser Zeit ersetzen die Hälfte der Kulturmedien mit frischem Erhaltungsmedium alle 24 ~ 48 Stunden.

4. axonalen Transport von QD-BDNF

1. Vor der Live-Imaging von QD-BDNF axonalen Transport, Abbau von BDNF sowohl die Zellkörper und Axon Fächer des mikrofluidischen Kammer gründlich beide Fächer mit BDNF-frei, Serum kostenlos Neurobasal Medien alle 30 Minuten für 2 Stunden.
2. Während BDNF Erschöpfung, bereiten Sie die QD-Konjugate BDNF. Mischungs 50 nM biotinyliertem mono-BDNF-Dimer mit 50 nM QD655-Streptavidin-Konjugate in Neurobasalmedium Medien und Inkubation auf Eis für 60 min.
3. Entfernen Medien im Axon Fach und 300 ul QD-BDNF mit einer Endkonzentration von 0,25 nM für 4 h bei 37 ° C aufweist. Um die Streu von QD-BDNF in den Zellkörper Raum zu minimieren, ist es sehr wichtig, um ein höheres Niveau der Medien in der Zellkörperraum immer halten als im Axon Fach. Abwaschen ungebundenen QD-BDNF nach Inkubation vor Live-Bildgebung.
4. Führen Sie die Live-Darstellung von QD-BDNF Transport mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Öl Objektiv ausgestattet. Aufwärmen des Umfangs und der Klimakammer befestigt sein, um eine konstante Temperatur (37 ° C) und CO ₂ (5%). Verwenden Sie einen Satz von Texas rot Anregung / Emission, um den Würfel QD655 Signal sichtbar zu machen.
5. Erwerben und zu erfassen Zeitraffer-Bilder innerhalb der Mitte Axone mit der Geschwindigkeit von 1 Bild / s für insgesamt 2 min mit einer CCD-Kamera. Verwendung Mikrorillen ohne Axone that keine QD und somit kein Signal als Kontrolle für die Infiltration.
6. Analysieren BDNF Transport mit jedem Bildanalyse-Software oder NIH ImageJ.

Ergebnisse

Herstellung und Reinigung von biologisch aktiven Mono-biotinylierten BDNF

Der Expressionsvektor der BDNF mit einer AviTag Sequenz (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fusioniert wurde nach einem früher veröffentlichten Protokoll ¹⁰ erstellt. Die Molekularmasse des vollständigen Fusionsprotein wurde vorhergesagt ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) monobiotinyliertes reifen BDNF mit einer vorhergesagten Molekü...

Diskussion

In dieser Studie wurde die Entwicklung einer neuen Technik berichten wir produzieren biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Durch Konjugieren des Proteins Quantenpunkt Streptavidin, und unter Verwendung eines Mikrofluidkammer ermöglicht das Verfahren eine bis axonalen Transport von BDNF in primären Neuronen mit Einzelmolekülempfindlichkeit, in Echtzeit und mit räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen. Die hier verwende...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum pfx DNA polymerase	Invitrogen	11708021
EcoRI	Fermentas	FD0274
BamHI	Fermentas	FD0054
HEK293FT cells	Invitrogen	R70007
DMEM-high glucose media	Mediatech	10-013-CV
D-biotin	Sigma	B4639
TurboFect	Fermentas	R0531
PMSF	Sigma	P7626
Aprotinin	Sigma	A6279
Ni-NTA resins	Qiagen	30250
Protease inhibitors cocktail	Sigma	S8820
Silver staining kit	G-Biosciences	786-30
Human recombinant BDNF	Genentech
Microfluidic chambers	Xona	SND450
24 x 40 mm No. 1 glass coverslips	VWR	48393-060
Poly-L-Lysine	Cultrex	3438-100-01
HBSS	Gibco	14185-052
DNase I	Roche	10104159001
Trypsin	Gibco	15090-046
Neurobasal	Gibco	21103-049
FBS	Invitrogen	16000-044
GlutaMax	Invitrogen	35050-061
B27	Gibco	17504-044
QD655-streptavidin conjugates	Invitrogen	Q10121MP
anti-Avi tag antibody	GenScript	A00674
streptavidin-agarose beads	Life Technology	SA100-04
Trichloroacetic acid	Sigma	T6399
HRP-streptavidin	Thermo Scientific	N100
anti-pTrkB antibody	a generous gift from Dr M. Chao of NYU
anti-TrkB antibody	BD Science	610101