Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em

Zusammenfassung

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Zusammenfassung

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Einleitung

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms^1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change⁴, the spread of invasive species⁵, and host-pathogen interactions^6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism^8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa^11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus^15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant^5,18 and contain more total lipids¹⁹ than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects^20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect²². In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause²³, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

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Protokoll

1. Larvenaufzucht von zwei A. albopictus Gruppen zum Erwachsenwerden

1. Stellen Sie zwei Photoperiode Schränke mit programmierbaren Beleuchtung bei 21 ° C für eine optimale Diapause Ausdruck ¹⁶ und ca. 80% relativer Luftfeuchtigkeit.
   1. Programmieren Sie einen Schrank für einen 16L: 8D-Licht: Dunkel-Zyklus (ein nicht-Diapause induziert LD Photoperiode). Stellen Sie das zweite Gehäuse für eine 8L: 16D Licht: Dunkel-Zyklus (Diapause induziert) ^13.
   2. "Licht an" Programm zur gleichen Zeit in beiden Schränke auf circadiane Zeit zwischen Photoperioden zu synchronisieren.
2. Berechnen Sie die Menge der Eier erforderlich sind, um das Experiment durchzuführen. Ziel für 300 bis 500 Eier pro Käfig. Mindestens drei replizieren Diapause Käfige und drei replizieren nicht Diapause Käfige für die RNA-Generation benötigt. Dieser beläuft sich auf 1,800-3,000 Eier pro Experiment ca..
   1. Hatch die Eier durch Eintauchen Ei Papiere in ca. 500 ml VE H ₂ O
   2. Hinzufügen ca. wie zuvor 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Grundfutter und Artemia beschrieben ^24. Decken Sie Behälter mit Mesh, und halten Sie die Masche an Ort und Stelle mit einem Gummiband.
   3. Platzieren Sie in der Photoperiode LD Schrank für ca. 24 Std.
3. Übertragungs geschlüpften Larven zu 10 x 10 x 2 cm Petrischalen mit ca. 90 ml gefüllt entionisiertem H ₂ O.
   1. Halten Sie ca. 30 Larven pro Schale. Übertragen Larven zu reinigen Gerichte jeden 48-72 Stunden, zum Beispiel jeden Montag, Mittwoch und Freitag (MWF) ^24.
   2. Feed ca. 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Boden Hundefutter und Artemia in VE-Wasser jeden MWF wie zuvor beschrieben ^24.
4. Bis drei Minuten vor vier Erwachsenen Käfige diese Einstellung für jedes Photoperiode Behandlung, wobei jeder Käfig einen biologischen Replikation.
   1. Von gegenüberliegenden Seiten des 9,5 l Eimer, schneiden Sie ein 10-für-14 cm Loch, und ein weiteres Loch mit 15 cm Durchmesser. Cover das erste mit Mesh. Geschnitten etwa eine Fußlänge eines orthopädischen Strumpf und kleben einem Ende um die Innenseite der anderen Bohrung.
   2. Schneiden Sie das Fußende der Strumpf aus und Knoten geschlossen - offen nur bei Zugriff auf das Innere des Käfigs erforderlich. Für den Käfig Deckel, schneiden Sie den gesamten Innenraum, so dass nur die Felge, und ersetzen Sie den Innenraum Kunststoff mit ^Mesh-24.
   3. Achten Sie auf die Photoperiode, replizieren Zahl, Käfig Startdatum und andere Informationen, die für das Experiment mit wasserfesten Stift auf der Seite des Käfigs.
5. Den Boden der Erwachsenen Käfige mit feuchtem Filterpapier. Befeuchten des Filterpapiers mit ausreichend entionisiertem H ₂ O, lokale Luftfeuchtigkeit im Käfigs zu erhöhen, aber vermeiden stehendes Wasser, das Eiablage auf dem Filterpapier ²⁴ stimulieren kann. Überprüfen Sie das Filterpapier täglich zum Trocknen, wieder nass, wenn notwendig.
6. Um eine ausreichende Eier für eine RNA-Bibliothek zu erstellen, mindestens 100 Frauen / 9,5 L cage, mit nicht mehr als 500 Mücken pro Käfig.
7. Sammeln Puppen MWF und in eine kleine Tasse sauber H ₂ O bei einer Dichte von nicht mehr als 50 Puppen pro 25 ml H ₂ O Übertragen Sie die Puppen cup einem Erwachsenen Käfig. Platz Käfige in der jeweiligen Photoperiode Schrank - A. albopictus Puppen sind lichtempfindlich ^15.
8. Stellen Sie sicher, dass täglich H ₂ O in Tassen ist sauber und klar, und entfernen abgestorbene Puppen, weil Aufbau von toten Puppen können Massensterben verursachen. Entfernen H ₂ O Tassen, nachdem alle Puppen entstehen.
9. Platzieren organische Rosinen auf dem oberen Gitter des Käfigs Zucker zur taucht Erwachsenen bereitzustellen. Überwachen Sie Rosinen, und ändern Sie sie alle 3-5 Tage, um Schimmel Ansammlung zu verhindern.

2. Wartung der Erwachsene zu Paarung und Eierproduktion zulassen

1. Pflegen Käfigen bei hoher Feuchtigkeit (ca. 80%) durch Auskleiden der Käfigunterteil mit einem feuchten Filterpapier, und den Zugriff auf Nicht-schimmelig Rosinen, wie oben beschrieben (Abschnitons 1.5 und 1.9).

3. Blut-Fütterung

1. Bereiten Sie sich darauf Blutzufuhr Weibchen zwischen zwei bis sechs Tage nach dem Schlüpfen, um sicherzustellen, dass Frauen haben mindestens acht eindeutige kurze Tage ausgesetzt worden, bevor der Eiablage beginnt für nahezu 100% Diapause Eier ^14.
2. Bereiten Sie die Hemotek Membran Zuführsystem. Stecken Sie die Zuführungseinheiten in die Stromversorgung. Die Temperatur einer jeden Einheit auf 37 ° C mit der Stellschraube. Mit einem elektronischen Thermometer und Sonde, um die Temperatur der Zuführungseinheit während der Kalibrierung zu messen.
3. Bereiten Sie die Mahlzeit Reservoir. Dehnen Sie ein Quadrat von Kollagen Fütterung Membran über der Öffnung der Mahlzeit Behälter und sichern Sie sie mit einem O-Ring. Die Ecken, um Falten zu entfernen Ziehen; schneiden Sie die überschüssige Membran mit einer Schere.
   HINWEIS: Collagen Membran kann nicht gut für alle Mückenarten zu arbeiten, und es kann notwendig sein, verschiedene Arten versucht, die optimale Membran zu finden, wenn die Arbeit mit einemaußer A. Arten albopictus. Parafilm funktioniert gut mit Culex pipiens.
   1. Wenn Blut wird bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung gefroren gelagert, Tauwetter.
   2. Halten Sie den Behälter, so dass die Membran nach unten zeigt, werden nicht unterstützt, und die Einfüllöffnungen nach oben zeigt. Verwenden einer Transferpipette oder Spritze, um das Reservoir mit etwa 3 ml Vollblut von Hühnern, Natriumcitrat als Antikoagulans einfüllen. Siegel Einfüllöffnungen mit Kunststoffstopfen.
4. Befestigen Sie das vorbereitet Reservoir zur Zuführung durch Aufschrauben auf das Gestüt auf der Wärmeübertragungsplatte auf der Unterseite des Förderers. Kehren Sie die Zuführung und setzen Sie ihn auf dem Käfig, Membranseite nach unten, so dass Mücken können durch die Maschen des Käfigs zu ernähren. Halten Sie die Zuführung auf den Käfig ca. 45 min zu Fütterung zu maximieren.

4. Anregung Eiablage

1. Vier bis fünf Tage nach der Blutmahlzeit, rüsten jeden Käfig mit einem dunkel gefärbten 50 ml cmit rohen Samenkeimung Papier (Ei Papier) oder strukturierte nicht-gebleichten Papiertuch ausgekleidet und füllen auf halbem Weg mit VE-Wasser ^9. Wenn mehr als 250 Mücken sind in einem Käfig, verwenden Sie zwei Tassen.
   HINWEIS: Bei kleinen Käfigen oder Einzel weibliche Fläschchen kann "Heu-Infusion" in Eiablagebehälter Eiablage durch den Geruch der mikrobiellen Flora ²⁵ zu erhöhen.

5. sammeln und speichern Eggs

1. Beginnen Eiersammlung innerhalb von 4-5 Tagen von blutsaugenden, weil die Eierproduktion Spitzen typischerweise etwa fünf Tage nach Blut Fütterung und dann nachlässt in der nächsten Woche.
2. Vary Eiersammlung Frequenz auf Notwendigkeiten des Experiments. Für allgemeine Zwecke, sammeln Eier Papiere auf einer MWF Zeitplan. Entfernen Ei Papiere aus jedem Käfig und ersetzen mit frischem Papier. Zeigen kürzlich entfernt Papiere in Petrischalen und lagern in SD Photoperiode Schrank auf verwirrende Auswirkungen ei der Lagerung zu vermeiden.
3. Lassen Sie Eier Papieren neu Haupt nass für 2 Tage nach der Eiablage an serösen Nagelhautbildung, die Ei Austrocknung Widerstand ²⁶ erhöht ermöglichen.
4. Etwa 48 Stunden nach der Sammlung, trockene Eier im Freien. Trocknen Sie das Papier, so dass es schlaff und leicht feucht anfühlen, aber nicht so feucht, dass das Papier dunkel von H ₂ O oder stimuliert Schlüpfen der Eier.
   HINWEIS: Ein 6.5 "x 4" Papier kann etwa 3,5 Stunden dauern, um zu trocknen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu über-trocken Ei Papiere, da dies in Ei Austrocknung ²⁷ führen.
5. Reserve zusätzliche Eier sowohl von LD und SD-Photoperioden zu Diapause Häufigkeit zu beurteilen und interpretieren die photoperiodische Effekt (siehe Mess Diapause, Abschnitt 6).
6. Für langfristige Lagerung, halten Ei Papiere bei 21 ° C und ca. 80% Luftfeuchtigkeit in Petrischalen. Halten Sie Petrischalen in einer Tupperware Vorratsbehälter mit einer Flasche Wasser auf lokale Feuchtigkeit zu halten, wie der Embryonalentwicklung dauert vier bis fünf Tage bei 21 ° C.

ove_title "> 6. Messen Sie Diapause Inzidenz

1. Verwenden Sie zusätzliche vorbehalten Embryonen (siehe Stimulieren Eiablage, Abschnitt 4), die 7 bis 20 Tage alt, um die Diapause Antwort zu quantifizieren sind.
2. Notieren Sie sich die Anzahl der auf jedem Ei papier Eier.
3. Stimulieren Sie Eier, die von Notlaufeigenschaften einzelnen Ei Papiere in einem 90 ml Petrischale mit ca. 80 ml ​​VE H ₂ O schlüpfen In etwa 0,25 ml Lebensmittel Gülle.
4. Nach 24 Stunden tally die Anzahl der schraffierten ersten Larvenstadium. Legen Sie die Petrischale auf eine schwarze Oberfläche zu Larven zu visualisieren und legen Sie eine Lichtquelle auf einer Seite der Schale. Die Larven werden von der Lichtquelle weg bewegen, was eine klare Bilanz von einzelnen Larven. Entfernen Sie einzelne Larven mit einer Pipette beim Zählen erzählt einzelnen Larven zu verhindern.
5. Platz Ei Papiere in eine neue Petrischale und wieder trocken. Re-Eier brüten nach ca. 1 Woche wieder übereinstimmen Eiern geschlüpft Verwendung des vorstehenden Verfahrens.
6. Platz Ei Papiere mit dem restlichen u n-geschlüpften Eier in neue 90 ml Petrischalen mit ca. 80 ml ​​Bleichlösung ^28. Sicherzustellen, dass die Eier Papiere vollständig in der Bleichlösung eingetaucht und lassen im Abzug über Nacht, um den Geruch der Bleich vermeiden.
   HINWEIS: Bleichlösung kann für ~ 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden, sollte aber ansonsten frisch hergestellt werden.
7. Überprüfen Sie Eier mit einem Lichtmikroskop als Bleich das Chorion zu löschen und Visualisierung von embryonierten, un-geschlüpften Eiern. Wenn das Ei embryonierten, wird das Ei eine cremefarbene, mit den Augen als zwei kleine schwarze Punkte gegenübereinander auf der Rückenseite erscheinen. Tally die Anzahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern ^13.
8. Bestimmen Diapause Einfall mit der folgenden Formel:% Diapause = keine. embryonierte un-Eier ausgebrütet / (Nr. geschlüpften Eier + Nr. embryonierte un-Eier ausgebrütet) x 100 ^13.

7. RNA-Extraktion aus Eier / Larven pharate

NHALT "> Hinweis: Verwenden Trizol in einer Sterilbank.

1. Pinsel Mücke Eier enthalten entwickelnden Embryonen oder pharate Larven an bestimmten Entwicklungszeitpunkten vom Ei Papiere Glasschleifer mit einer Kamelhaarbürste. Schleifen Sie die Eier in Trizol (1 ml pro 50 bis 100 mg Gewebe), bis sie vollständig pulverisiert. Verwenden Sie mindestens 400 Eier pro Bibliothek, um eine ausreichende RNA ergeben.
   1. Alternativ Snap freeze Eier in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C in Mikrozentrifugenröhrchen für bis zu einem Monat vor dem Mahlen in Trizol gespeichert.
2. Führen RNA-Extraktion in Trizol gefolgt von Isopropanolfällung nach Herstelleranweisungen.
3. Behandeln Sie die Bank mit RNase Dekontaminationslösung oder andere Mittel, um alle restlichen Nukleasen zu entfernen, um RNA-Abbau zu vermeiden.
   1. Behandeln Sie die extrahierte RNA mit DNase. Nach den Anweisungen des Herstellers, Inkubation der RNA-Proben mit DNase für 30 min bei 37 ° C. Verwenden Sie 1 und #181; l DNase für bis zu 10 & mgr; g RNA in einer 50 ul Reaktion. Erhöhung der Menge an DNase, wenn es mehr als 10 & mgr; g RNA in einer Reaktion.
   2. Inaktivierung von DNase durch Zugabe von 5 ul suspendiert DNase-Inaktivierung Reagenz. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur, dreimal während der Inkubationsperiode (leichter Verwirbelung).
   3. Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1,5 min. Die überstehende, die die behandelten RNA Proben in frische Röhrchen zur anschließenden Schritten.
4. Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA-Proben mittels Fluorometrie. Senden Sie die Proben auf eine Spezialanlage mit geeignete Instrument für diese Aufgabe. Die Anlage wird auf dem Chip-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Größe der RNA-Spezies in der Probe durch Fluoreszenzfarbstoff in der Chip instilliert visualisiert bestimmen. Die Ergebnisse werden als ein Elektropherogramm zurückgegeben.
   1. Bestimmung der Integrität der Gesamt-RNA-Proben durch das Vorhandensein oder Fehlen von Abbauprodukten, wie durch das Vorhandensein o belegenf Peaks zwischen 18S und 5S rRNA Peaks auf der resultierenden Elektropherogramm (1B).

8. RNA Sequenzierung

1. Senden der Gesamt-RNA-Proben mit einer ausreichend hohen Qualität (1A) und Menge (in der Regel> 3 ug pro Bibliothek) an eine kommerzielle Ordnungszentrum für den Bau von angereichertem Paired-End mRNA-Bibliotheken und mRNA-Sequenzierung nach Standardprotokollen.
2. Wenn mehr als eine Spur wird für die Sequenzierung eines einzigen Experiment verwendet wird, aufgeteilt einzelnen Bibliotheken in zwei Fahrspuren für die Sequenzierung für technische Unterschiede zwischen den Fahrspuren während der Sequenzierung zu berücksichtigen.

9. Illumina lesen Reinigung

ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Bioinformatik Teil dieses Protokolls. Für eine vollständige Liste aller Programme und Ressourcen in der Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll verwendet, auf die Tabelle 1 verwiesen. InAußerdem STADT Datei 1 enthält Befehlszeilenbeispiele für jede der folgenden Bioinformatik Protokollschritte.

1. Verwenden ssaha2 ²⁹ (Tabelle 1), um Gruppen aus 95% Identität oder höher, um der NCBI UniVec Core-Datenbank identifiziert (Tabelle 1), A. albopictus rRNA-Sequenz (GenBank # L22060.1) und Sequenzierung Adaptern (detaillierte Befehlszeilenbeispiele in STADT Datei-1 zur Verfügung gestellt). Entfernen Lesepaare mit Streichhölzern mit Perl oder eine ähnliche Scripting-Tool, beispielsweise durch Anpassung der bereitgestellten Perl-Skript (Supplemental Datei 2).
2. Reinigen Sie verbleibende liest mit dem SolexaQA Paket ³⁰ (Tabelle 1; Supplemental Datei 1): schneiden Regionen mit phred Punktzahl Äquivalent von weniger als 20 mit den Standardeinstellungen des DynamicTrim.pl.
   1. Entfernen Sie liest die kürzer als 25 bp mit LengthSort.pl auf Vorwärts- und Rückwärts liest gleichzeitig. Bewerten Sie die Qualität der fastq gereinigt Dateien mit FastQC (Tabelle 1 ) - insbesondere, ob die pro-Basensequenz Qualität und die pro-Sequenz, Qualitätswerte sind über 20.

10. Digitale Normalisierung

1. Führen Sie eine Runde von digitalen Normalisierung auf dem gereinigten liest mit Hilfe des Khmer-Werkzeug ³¹ (Tabelle 1; Supplemental Datei 1), insbesondere normalize-by-median.py (mit k-mer Größe 20, eine Abdeckung Cut-off von 20, und x = 1e10).
2. Alternativ, wenn eine Maschine mit hoher RAM zur Verfügung steht (Hunderte von GB), verwenden Sie Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl Skript (Tabelle 1).

11. De Novo Transkriptom Assembly

1. Beim Zugang zu einem Computer oder einem Computer-Cluster mit bis zu 256 GB RAM und 24 CPUs, abhängig von der Größe der Anordnung.
2. Verwenden Trinity ³² (Tabelle 1; Supplemental Datei-1), um die digital normalisierte Lese in Contigs gesetzt zu montieren. So verkleinernSpeichernutzung, verwenden --min_kmer_cov 2.

12. Montage Bewertung

1. Führen assemblathon_stats.pl vom Assemblathon2 Projekt ³³ auf der Fläche zu Trinity-Ausgang. Dieses Skript führt Grundrechenarten relevant Auswertung Montagequalität, wie die Anzahl der Gerüste, N50, Montage Zusammensetzung und (Tabelle 1; Supplemental Datei 1).

13. Markieren des Assembled Transkriptom

1. Führen BLASTX (Tabelle 1) der Anordnung gegenüber einem Referenzprotein-Set; für Moskitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens und Aedes aegypti eignen Referenzen. Genauer gesagt, formatieren Sie das Referenzprotein fasta Datei für Explosion, gefolgt von blastx (Supplemental Datei 1).

14. Karte Liest der Versammlung Mit RSEM ³⁴ (Tabelle 1)

1. Erstellen Sie eine Datei "transcript-to-Gen-Karte", in dem dererste Spalte enthält die Referenz-Gen-IDs und die zweite Spalte die Fläche zu IDs. In einem Spreadsheet-Editor, tauschen die ersten und zweiten Spalte von der BLASTX Ausgang, und schreiben Sie diese Spalten in eine TXT-Datei. Verwenden Sie die Linebreak-Programm um Zeilenumbrüche in der resultierenden Textformat an den Unix-Format zu konvertieren.
2. Erstellen Sie eine Referenzdatensatz aus der Transkriptom fasta Datei mit dem RSEM-Vorbereitung Verweis Skript, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.
3. Berechnen Sie die Expressionswerte für jede Bibliothek mit dem Befehl RSEM-calculate-Ausdruck, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. Wie liest, verwenden Sie die gepaart fastq Dateien aus dem Lesereinigungsschritt (Schritt 9.2) ergibt.
   1. Wenn RNA aus einer biologischen Replikation wurde für die Sequenzierung in zwei Bahnen aufgeteilt, umfassen sowohl fastq Dateien im Ausdruck Berechnung, um eine einzelne Datei zu generieren.
4. Konvertieren Sie die Ausdruck ergibt sich aus jeder Bibliothek zu einer Matrix leicht von anderen p verarbeitetROGRAMME mit dem mitgelieferten Skript RSEM-generate-Data-Matrix, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt.

15. Differential Expressionsanalyse

1. Installieren R und Kantenschneider (Tabelle 1).
2. Verwenden read.delim die RSEM Ergebnisse aus Schritt 14.3 (Supplemental Datei-1) zu laden. Falls erforderlich, ergänzen die Zähler auf die nächste ganze Zahl.
   HINWEIS: Der Kantenschneider Leitfaden empfiehlt die Begrenzung der Datenmenge, um Gene mit hoch genug zum Ausdruck Bedeutung zu erkennen.
3. Um die Daten für Edger zu formatieren, erzeugen eine DGEList Objekt aus der geladenen Datei (Supplemental Datei 1). Dann normalisieren die Daten mit TMM Normalisierung (Supplemental Datei 1). Schätzen Sie die gemeinsame und tagwise Dispersionen der Daten (Supplemental Datei 1).
4. Identifizieren differentiell exprimierte Gene mit einem Benjamini-Hochberg korrigierten p-Wert <0,05 (Supplemental Datei 1). Zeichnen Sie die Verteilung der log-fach Wechsel vs. Fülle (Supplemental Datei 1).

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Ergebnisse

Fluorometrie zweier repräsentativer RNA Proben zeigten zwei Banden bei ca. 2000 nt (1A, B). Das Insekt 28S ribosomale RNA aus zwei Polynucleotidketten durch Wasserstoffbrücken, die sich leicht durch kurzes Erhitzen oder Agenten, die Wasserstoffbrückenbindungen ³⁵ stören gestört zusammengehalten zusammen. Die resultierenden beiden Komponenten ungefähr die gleiche Größe wie der ribosomalen RNA 18S. Die zweite RNA-Probe zeigte eine hohe Abbauwerte (1B).

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Diskussion

Dieses Protokoll stellt Methoden, um differentiell exprimierte Gene aufgrund entdecken induzierte Diapause in A. photoperiodisch albopictus. Das Protokoll ist, dass es auf einzigartige Weise Moskito Aufzucht und Bioinformatik-Techniken, um alle experimentelle Aspekte eines molekularen Physiologie Programm zugänglich Anfänger machen signifikante - insbesondere für diejenigen, die sich auf die photoperiodische Diapause Antwort. Bestehende Verfahren, nach unserer Kenntnis nicht bieten so viele Details ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Controlled environment room	Thermax Scientific	N/A	Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb	Philips	392183	4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Filter Paper 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L Bucket	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings	Albahealth	23650-040	product no. 081420
Organic Raisins	Newman's Own	UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)	Fisher Scientific	03-007-52	The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels	Seventh Generation	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder	Corning Incorporated	7727-2	These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent	Sigma Aldrich	T9424	Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder	Hemotek	5W1	This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.