Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Verhalten der Erwachsenen aus einer seitlichen Perspektive

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik, um hochwertige digitale Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive zu erwerben.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige experimentelle Modellsystem zur Untersuchung der Funktion des Nervensystems. Gen-Mutationen, die Funktionsstörungen des Nervensystems verursachen produzieren häufig lebensfähigen Larven und Erwachsene, die Fortbewegung defekt Phänotypen, die schwierig ist, ausreichend mit Text beschreiben oder vollständig mit einem einzigen fotografischen Bild darstellen, sind zu haben. Aktuelle Modi des wissenschaftlichen Publizierens, unterstützen jedoch die Vorlage von digitalen Video-Medien als ergänzendes Material, ein Manuskript zu begleiten. Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video beider Drosophila Larven und erwachsene Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Video der Larven und erwachsene Fortbewegung aus einer Seitenansicht ist von Vorteil, weil sie die Beobachtung und Analyse der feinen Unterschiede und Variationen in abweichenden Lokomotive Verhaltensweisen. Wir haben erfolgreich die Technik zur Visualisierung und Quantifizierung aberrant kriechen Verhaltensweisen in Drittlarvenstadium, zusätzlich zu Erwachsenen Phänotypen und Verhaltensweisen einschließlich Pflege.

Einleitung

Die gemeinsame Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist eine leistungsfähige experimentelle Modellsystem zur Untersuchung der Funktion des Nervensystems ^1-3. Evolutionären Erhaltung der Struktur und Funktion des Nervensystems beim Menschen, als auch einfache genetische Manipulation und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen macht Drosophila die Premiere Organismus der menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen ⁴ modellieren. Gen-Mutationen, die Funktionsstörungen des Nervensystems verursachen führen oft in lebensfähigen Mutanten Larven und adulte Drosophila mit eingeschränkter Fortbewegung. In Nervensystem Mutanten beobachteten Phänotypen sind reduzierte Geschwindigkeit der Fortbewegung, anomale Koordination und spastischen Bewegungen bei Erwachsenen, als auch Defizite in peristaltische Kontraktion der Muskulatur der Körperwand und teilweise Lähmung der Larven. Diese Phänotypen in der Entwicklung von Hochdurchsatz-genetischen Screens und Fortbewegung Assays Mutante Larven ⁵ ausgenutzt, 6 und Erwachsenen ^7-10 Drosophila bei der Quantifizierung der Fortbewegung Wertminderung und die Identifizierung für die Funktion des Nervensystems notwendigen Gene abzielen. Während diese Ansätze sind äußerst nützlich für die Quantifizierung Larven und Erwachsenen Lokomotive Verhaltensweisen, versagen sie auf qualitative Informationen über die einzelnen spezifischen abweichendes Verhalten zu vermitteln. Zum Beispiel, während Mutante dritten Larvenstadium kann die Fortbewegung veränderten Parameter in einem Verhaltenstest zeigen, kann es unklar sein, wenn dies das Ergebnis von Veränderungen in rhythmischen Kontraktionen während der Schlauch Crawling Zyklus, allgemeine Mangel an Koordination oder teilweise Lähmung der hinteren Körper Wandmuskulatur. Hier beschreiben wir eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Lokomotive Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Digitale Videosignale von einer seitlichen Perspektive erworben erlaubt die direkte Beobachtung und Analyse der feinen Unterschiede in Locomotive Verhaltensweisen von einem aussageSeitenAnsicht Orientierung.

Protokoll

1. Die Stereomikroskopsystem

Anmerkung: Obwohl dieses Protokoll einfach an praktisch jedem Stereomikroskopsystem mit der Fähigkeit zum Erfassen Video in einer Digitalkamera gekoppelt ist, werden die Details von der in unserem Labor verwendet (Tabelle Materialien / Equipment) System.

1. Erwerben Sie digitale Videos mit einer trinokularen Stereomikroskop zu einem kommerziellen Digitalkamera gekoppelt ist.
2. Zur Kopplung des kommerziellen Digitalkamera an den trinokularen Anschluss des Stereo-Mikroskop, entfernen Sie die ½x C-Mount-Anschluss der Photozelle des Stereomikroskops und ersetzen Sie es mit einem 1X C-Mount.
3. Montieren Sie eine Digitalkamera Koppler (43 mm Gewinde) an die 1X C-Mount.
4. Halterung zwei Abwärts-Ringe, 58 mm bis 48 mm und 48 mm bis 43 mm, zu der Kamera-Koppler, um die Verbindung von der Digitalkamera Koppler an einem Linsenadaptersatz für die digitale Kamera brücken.
5. Montieren Sie die Digitalkamera an den Objektiv-Adapter-Kit.
6. Erwerben Video mit dem Mikroskop Vergrößerung und optischen Zoom der Digitalkamera-Set für eine kombinierte Vergrößerung von ca. 12x (30 Bilder pro Sekunde, 640 x 480 Pixel). Hinweis: Die Vergrößerung des Stereomikroskops muss in Übereinstimmung mit der neu rekonfiguriert 1X C-Mount-Anschluss des trinokularen kompensiert werden.

2. Imaging Drosophila Dritte Larvenstadium

1. Band ein Permanent-Marker auf die schwarze Tischplatte von einem Stereomikroskop mit einer digitalen Kamera gekoppelt, so dass die Seite der Marker Kappe nimmt etwa ⅓ auf ¼ der vertikalen Bereich der in der Kamera LCD-Monitor beobachtet Blick. Verwenden Sie Marker Spitzen wie die Bühne, um Larven Bildgebung durchzuführen, weil sie in einer Auswahl von Farben, die Farbcode verwendet werden kann und differenzieren die Genotypen von Larven, die abgebildet sind.
2. Grenzen den Bereich der in der Digitalkamera LCD-Monitor auf der Oberfläche des Markers oben beobachtet Ansicht mit einer feinen SpitzeMarker.
3. Wählen Sie einen dritten Larvenstadium zu Bild. Die Kriterien für die Auswahl der dritten Larvenstadium war Körperlänge Austritt aus der Nahrungsmittelquelle während des Larven Phase des Lebenszyklus, die Anwesenheit von vorderen und hinteren Luftlöcher, und die Struktur der Unterkiefer Haken des Mundvorrichtung ^11. Stellen Sie sicher, die Larve ist sauber durch Waschen Sie es gründlich in Wasser.
4. Beleuchten den Permanentmarker obersten Stufe von oben mit Licht aus einem Glasfaser-Beleuchtungssystem. Stellen Sie den Winkel des einfallenden Lichts, um eine optimale Ausleuchtung sorgen.
5. Fokussieren Sie das Mikroskop auf dem Rand des Permanentmarker Spitze. Beginnen Erfassen digitaler Video.
6. Legen Sie die Larve auf der Seite der Marker Kappe ca. 75 ° von der vertikalen Achse, etwas außerhalb des Blickfeldes, mit dem vorderen der Larve zugewandten Sichtfeld (Abbildung 1). Hinweis: Die Platzierung der Larve auf der Seite des Markers Kappe ermöglicht die Kamera auf Bewegung thE-Larve aus einer seitlichen Perspektive. Es hilft, die Larve mit Wasser feucht zu halten, damit sie nicht herunterfallen die Seite der Marker Kappe. Vorsicht ist jedoch, nicht zu viel Wasser, wie übermäßige Mengen werden der Larve halten, wie es über das Feld kriecht.
7. Sanft zu stoßen und prod die Larve mit einem kleinen Pinsel, um sie zu zwingen, in das Blickfeld zu kriechen. Geduld, da die Larven nur selten zusammenarbeiten und müssen oft an den Ausgangspunkt zurückgebracht werden viele Male, bevor sie gerade über das Feld zu kriechen.
8. Rekord ca. 10-15 min ununterbrochenen digitalen Videomaterial und Pflanzen und entfernen Sie alle unnötigen Material nach der Übernahme mit digitalen Video-Editing-Software.

3. Imaging Erwachsene Drosophila

1. Legen Sie eine einzelne erwachsenen Drosophila in einer Wegwerf 1,5 ml Polystyrol spektroskopischen Küvette.
   Hinweis: CO ₂ Betäubung von erwachsenen Drosophila unmittelbar vor einer BehavtensAnalyseProtokoll kann Ergebnisse ¹² beeinträchtigen. Es wird empfohlen, dass erwachsene Drosophila eine 24-Stunden-Zeitraum gegeben, um von CO ₂ Betäubung erholen, bevor Sie in einem Verhaltenstest ¹³ werden.
2. Stecken Sie das Ende der Küvette mit einem kleinen Wattebausch. Sicherstellen, dass der Wattebausch ist fest genug, um die große Kappenraum besetzen verpackt und beschränkt die Fliege auf das reduzierte Volumen Fach der Küvette.
3. Setzen Sie die Küvette auf der weißen Tischplatte von einem Stereomikroskop und richten das reduzierte Volumen Fach der Küvette mit dem Gebiet der in der Digitalkamera LCD-Monitor beobachtet Blick.
4. Beleuchten die Küvette von oben mit Licht aus einem Lichtwellenleiter-Beleuchtungssystem. Stellen Sie den Winkel des einfallenden Lichts, um eine optimale Ausleuchtung sorgen.
5. Fokus des Mikroskops und beginnen Erfassung digitaler Video.
6. Rekord ca. 30-45 min ununterbrochenen digitalen Videomaterial und Pflanzen und entfernen Sie alle unnötigenVideo nach dem Erwerb mit digitalen Video-Editing-Software.

Ergebnisse

Wir haben erfolgreich diese Technik zur Erfassung und Quantifizierung der Larven Verhaltensphänotyp mit Verlust der Funktion des Gens Stathmin (Figur 2) ¹⁴ verbunden. Das Gen kodiert für ein Stathmin Mikrotubuli regulatorisches Protein, das Tubulindimeren Partitionen von Pools von löslichen Tubulin und Mikrotubuli bindet und fördert ihre Demontage ^15,16. Stathmin Funktion ist erforderlich, um die Integrität des Mikrotubuli in den Axonen von peripheren Nerven ...

Diskussion

Drosophila melanogaster 's Stärke als ein Modellsystem für die Untersuchung Funktion des Nervensystems stammt weitgehend aus der Konvergenz der mächtigen genetische Werkzeuge zur Verfügung, und die breite Palette von robusten Verhaltenstests entwickelt. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und allgemein zugänglich Mikroskopietechnik für den Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video von Drosophila Erwachsenen-und Larven Lokomotive Phänotypen aus einer seitlichen Perspektive. Wi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trinocular Stereozoom Microscope	Olympus Corporation	SZ6145TR	½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mount	Leeds Precision Instruments	LSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)	Qioptiq Imaging Solutions	25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down Ring	B&H Video	GBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10	LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital Camera	Canon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene Cuvette	Denville Scientific	U8650-4