Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren

Zusammenfassung

Entstehung der genetischen Resistenz gegen Kinase-Hemmer-Therapie stellt große Herausforderung für eine effektive Krebstherapie. Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen resistent gegen ein neu entwickeltes Medikament hilft bei der besseren klinischen Behandlung und der nächsten Generation Drug-Design. Hier beschreiben wir unser Protokoll für in-vitro-Screening und Validierung von resistenten Mutationen.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von BCR / ABL als Treiber Onkogen bei chronischer myeloischer Leukämie (CML) in Folge der Entwicklung von Imatinib, die in der Tat gezeigt, das Potential von Targeting-Kinase in Tumoren durch effektive Behandlung der CML-Patienten. Diese Beobachtung revolutioniert die Medikamentenentwicklung, die onkogenen Kinasen in verschiedenen anderen Krebserkrankungen, wie zum Beispiel, EGFR, B-RAF, KIT und PDGFRs verwickelt Ziel. Jedoch ist ein Hauptnachteil der Antikinase-Therapien die Entstehung von Resistenzen Mutationen wodurch das Ziel, reduzierte oder keine Affinität für das Medikament erfolgt. Das Verständnis der durch resistente Varianten hilft nicht nur bei der Entwicklung der nächsten Generation Inhibitoren, sondern gibt auch Impulse für die klinische Behandlung mit personalisierten Medizin verwendeten Mechanismen. Wir berichteten einen retroviralen Vektor basierte Screening-Strategie, um das Spektrum der Resistenz verleihen, Mutationen in der BCR / ABL, die bei der Entwicklung der nächsten Generation der BCR / ABL-Inhibitoren geholfen hat, zu identifizieren. Mit Ruxolitinib und JAK2 als Target Paar, beschreiben wir in vitro-Screening-Verfahren, die die Maus BAF3 Zellen, die die zufällige Mutation von JAK2-Kinase-Bibliothek nutzt.

Einleitung

Proteinkinasen sind wichtige regulatorische Enzyme des intrazellulären Signalübertragungswege, die scheinbar jeden Zellfunktion modulieren. Eine ordnungsgemäße Kontrolle der Kinase-vermittelten Signal ist von entscheidender Bedeutung, um die Homöostase und Entwicklung, die vor allem stützt sich auf angemessene Regelung der Kinasen, Phosphatasen und dessen Abbau durch UPS (Ubiquitin-Proteasom-System). Dereguliert Kinasen stehen im Mittelpunkt von vielen Krebsarten und in vielen menschlichen Krankheiten ¹ gebracht. Menschliche Genom kodiert mehr als 500 Proteinkinasen, die in Verbindung gebracht wurden, direkt oder indirekt, zu ~ 400 Krankheiten des Menschen ^2. Diese Beobachtungen unterstützt das Konzept zum therapeutischen Targeting von Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren ^3-5.

Der Nachweis der ABL-Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML), wenn der Beweis des Konzeptes für diesen Ansatz ^6,7. Diese Beobachtung nicht nur revolutioniert die Ameisei-Kinase-Therapie, sondern auch die Idee durchgesetzt, um die genetischen Läsionen in anderen Tumorerkrankungen zum therapeutischen Targeting, die Entdeckung von onkogenen Mutationen im JAK2 von Polycythaemia vera (PV) und Patienten mit myeloproliferative Neoplasien (MPN) führen könnten. Diese Entdeckung großes Interesse bei der Behandlung MPNs, indem sie auf JAK2 mit kleinen Molekül-Inhibitoren. Jetzt, fast ein Dutzend von JAK2-Inhibitoren sind in klinischen Versuchen und einer von ihnen wurde kürzlich zur Behandlung von Myelofibrose zugelassen. Während spezifische Ausrichtung der onkogenen Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren bei Krebserkrankungen zu bringen vielversprechende Ergebnisse, leidet es auch aus Entwicklungs Widerstand gegen die Behandlung. In der Tat, so weit, Patienten mit Kinase-Inhibitoren, wie Imatinib, Gefitinib, Erlotinib und Dasatinib behandelt wurden, entwickelten Resistenz-Mutationen vor allem durch den Erwerb von Mutationen in der Kinase-Domäne, zu der Droge zielt ^8-10. Widerstand infolge Genmutation hebt die Einschränkungen of gezielten Monotherapie gegen die onkogenen Kinasen, und steht für die nächste Herausforderung in der Entwicklung immer erfolgreiche Krebs-Chemotherapie. Mechanistische und funktionelle Konsequenzen von Resistenzen sollte eine Begründung für die Auswahl und Gestaltung der kostenlose Verbindungen für die Medikamentenentwicklung liefern. Mutationen durch in vitro-Screens, jedoch ein hohes Maß an Übereinstimmung mit den in Patienten gefunden gezeigt. Daher wird in-vitro-Screening auf Mutationen, die Medikamentenresistenz für eine gegebene Wirkstoff-Target-Paaren in klinischen oder präklinischen Entwicklung unterstützt verleihen beim Identifizieren der Widerstandsmuster, die wahrscheinlich klinischen Rückfall verursachen. Die Identifizierung dieser Mutantenformen ist nicht nur nützlich bei der Überwachung der Patienten, die Arzneimittelreaktion und Rückfall, sondern auch für die Gestaltung der robusteren nächsten Generation Inhibitoren wesentlich. Zum Beispiel die Entwicklung der nächsten Generation von BCR / ABL-Inhibitoren Nilotinib und Ponatinib, machte wegen der größeren mec wurden möglichhanistic Vereinbarungen gewonnenen Mutagenese, strukturelle und funktionelle Untersuchungen.

Früher haben wir die Ergebnisse unserer Bildschirm mit Zufallsmutagenese von BCR / ABL, das Spektrum der Mutationen, die Resistenz gegen Inhibitoren wie Imatinib ^11,12, PD166326 ¹² und ¹³ zeigen, AP24163 wiesen. Die Ergebnisse nicht nur identifiziert, die Mutationen, die klinische Festigkeit und Krankheitsrückfall, aber auch das mechanistische Verständnis der Arzneimittelresistenz und Grundsätze für die Kinasefunktion ^11,14 vorgesehen. Hier finden Sie zusätzliche methodische Details, mit Ruxolitinib und JAK2 als Target-Paar, um eine breitere Anwendung dieser Screening-Strategie zu ermöglichen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden nach dem National Institute of Health Richtlinien für die ethische Behandlung und Pflege von Tieren durchgeführt, und nach einer genehmigten IACUC Tiernutzung Protokoll.

1. Zell Line Maintenance

1. Kultur BAF3-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml und 100 ug / ml) und verbrauchtes Zuchtmedium der WEHI-Zellen. Wachsen HEK293T-Zellen in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml und 100 ug / ml). Pflegen Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 enthielt.

2. Plasmidkonstruktion

1. Klonen Sie die Maus JAK2 und seine onkogene Isoform JAK2 V617F-in pMSCV-puro-GW by LR Clonase mit Standard-Rekombination Klonierungsverfahren.
2. Für die Konstruktion der Luciferase-Expressionsvektor (pMSCV-Luc-Kirsche-GW) vi in verwendet invo Bildgebung zu verstärken Luciferase aus pLVX-Tet-ON-Vektor durch PCR unter Verwendung von Primern (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG und LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) folgte mit Klonen in pENTR-SD-TOPO zu pENTR-Luc, die verwendet wird, zu erzeugen um die Luciferase-Gen in retroviralen Vektor, pMSCV-Kirsche-GW durch Rekombination vermittelten Klonen mit LR Clonase übertragen.

3. Herstellung von Zufallsmutation Bibliothek, Screening und Identifizierung der Mutationen

3.1) Zufallsmutagenese

1. Klon voller Länge von JAK2 Wildtyp und die Mutation V617F in pMSCV-puro-GW retroviraler Vektor mit einem handelsüblichen Rekombination Klonen Technologie.
2. Verwenden Sie 1 ug JAK2 V617F-Plasmid-DNA zu transformieren, XL-1 Red, E. coli-Zellen, die in DNA-Reparaturmechanismen defekt und dass sie daher zufällige Mutationen während der Replikation zu integrieren ist. Genauer gesagt, mischen 50-100 ng DNA (mehr als 100 ng DNA verringert Transformationseffizienz) mit 100 & mgr; l kompetente Zellen in ein vorgekühltes Polypropylen Rohr und auf Eis für 30 min inkubiert, leicht schwenken alle 5 min. Für eine gute Bibliothek Berichterstattung verwenden vier vor sechs Röhren kompetenter Zellen.
   HINWEIS: Mehr als 100 ng DNA verringert Transformationseffizienz
3. Eintauchen der Röhre in ein Wasserbad bei 42ºC einem Hitzeschock von 45 sec und Inkubation auf Eis für 2 min. Als nächstes wird mit 1 ml SOC-Medium (2,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 und 0,4% D-Glucose). Das Röhrchen bei 37 ° C unter Schütteln bei 225-250 rpm für 90 min.
4. Platten Zellen aus jedem Röhrchen auf vier 10 cm-LB-Agarplatten enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. Die Platten für 16 inkubieren - 24 h bei 37 ° C.
5. Nach sichtbaren Kolonien, sammeln sie durch Abschaben der Platten mit einer sterilen Platte Schaber. Pool-Zellen von jeder Platte und Plasmid-DNA-Isolat mit einem handelsüblichen Plasmid-Extraktions-Kits.
   HINWEIS: In der Regel Kolonien sind kleiner und nehmen 18-24 h zu seinsichtbar, da es sich langsam wachsende Bakterienstämme. Zu diesem Zeitpunkt beurteilt die Heterogenität von Mutationen in der Bibliothek durch Restriktionsverdau mit häufig vorkommenden Schnittstellen, wie Sau3A1 oder Taq1 oder Sequenzierung.

3.2) Herstellung von Retrovirale Überstände und Transduction

1. Einen Tag vor der Transfektion Platte 4 x 10 ⁶ HEK 293T Zellen auf 100-cm-Schalen in DMEM, enthaltend 10% FCS, Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
2. Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium und Transfektion der Zellen mit mutierten pMSCV-JAK2-V617F-Bibliothek. Für jede 10-cm-Platte, nimm 10 & mgr; g DNA (5 ug der Plasmid-Bibliothek und 5 ug von retroviralen Verpackungsplasmid, pCLEco) mit 40 ul FuGENE auf ein Gesamtvolumen von 400 & mgr; l unter Verwendung von serumfreiem DMEM-Medium. Inkubieren der DNA und Lipidmischung für 20 min bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten wird die DNA-Lipid-Komplex tropfenweise auf der Oberseite der HEK293T-Zellen.
3. Nach sechs Stunden, ändern Sie das Transfektionsmedium with frisches Medium und Inkubation der Platten für 48 Stunden bei 37 ° C für die Virusproduktion. Nach 48 Stunden Inkubation gesammelt viralen Überstände durch ein 0,45 um Acrodisc-Filter filtriert.

3.3) Selektion resistenter Klone In-vitro-

1. Für arzneimittelresistente JAK2 V617F-Mutanten, transduzieren 100 Millionen BaF3-Zelle mit 100 ml Virusüberstände mit einem Virustiter von 0,5-1 x10 ^6. Genauer mischen 10 ⁸ Zellen mit 100 ml Virusüberstand bis zu einem Gesamtvolumen von 300 ml unter Verwendung von RPMI-Medium, das 10% Serum und 24 & mgr; g / ml polyberene (Endkonzentration ployberene beträgt 8 & mgr; g / ml). Verteilen Sie diese Zellenmischer in mehreren sechs Well-Platten (4-5 ml pro Vertiefung).
2. Zentrifugieren der Platten bei 1.250 xg für 90 min bei 25 ° C. Nach der Zentrifugation inkubiert, die Platten bei 37 ° C für 24 Stunden.
3. Am nächsten Tag, bündeln die Zellen untereinander und mit Ruxolitinib und Medium mit weichem Agar mischen und in si verchromtx-Well-Platten. Für jede Arzneistoffkonzentration, Mischungs 10 ml transduziert BAF3-Zellen (10-20 Millionen Zellen) mit der entsprechenden Menge an Ruxolitinib in ein 50 ml Röhrchen. Stellen Sie die Lautstärke auf 40 ml mit RPMI mit 20% Serum. 10 ml 1,2% Agar zu den Zellen, mixcarefully und Platte in sechs Well-Platten.
4. Die Platten bei 37 ° C inkubieren, für zwei Wochen. Wählen Sie die resistenten Kolonien mit 0,2 ml Pipettenspitzen und Subkultur sie einzeln in 24-Well-Platten für 3-4 Tage.
5. Ernte der beständigen BAF3-Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Isolieren der genomischen DNA mit einem handelsüblichen Isolierung genomischer DNA Kit. PCR zu amplifizieren voller Länge JAK2 cDNA von 100 ng genomischer DNA unter Verwendung der Primer (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG und mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) und langfris Vorlage erweitern High Fidelity PCR-Systeme.
6. Trennen der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese. Verbrauchsteuern Das 3,4 kb-DNA-Bande, die JAK2 Codierrahmen und zu isolieren, die DNA-mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit. Sequenz der vollen Länge der cDNA mit 8 internen Primer (P1 - P8) überspannt die codierende Sequenz und Analyse-Sequenzen unter Verwendung kommerzieller Software.

4. In-vitro-Validierung Beständig Mutationen

Viele Zellklone tragen mehr als eine Mutation, um den Beitrag jeder Mutation in Resistenzphänotyp testen erzeugen ausgewählten Varianten durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung pMSCV-JAK2V-617F-Plasmid als Matrize.

1. Führen ortsgerichtete Mutagenese auf pMSCV-JAK2-V617F-Plasmid mit einem handelsüblichen Mutagenese-Kits und Oligonukleotide entwickelt, um Punktmutationen erstellen. Bestätigen Sie die Identität der Mutante Klone durch Sequenzierung.
2. Transduzieren BAF3 Zellen mit Retroviren unter Verwendung mutierten Plasmide folgte mit Auswahl mit Puromycin bei 1 ug / ml.
3. Platte 10 ⁴ BAF3-JAK2 V617F-Zellen (50 ul RPMI mit 10% FCS) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Getrenntly werden 50 ul der Ruxolitinib haltigen Medien zu den Vertiefungen in der Platte (Endkonzentration: 0, 1, 3, 5, 10, und 20 & mgr; M), und Inkubieren der Platten für 60 Stunden bei 37 ° C.
4. Beurteilen Zellviabilität durch Zugabe von 10 & mgr; l WST-1 Reagens zu jeder Vertiefung mit einer Inkubation bei 37 ° C für 2-4 Std. Nehmen Absorption bei A450 mit einem Plattenlesegerät. Führen Sie alle Tests in dreifacher Ausfertigung und Grundstück gemittelte Extinktion gegen INCB018424 Konzentrationen. Führen Sie eine Best-Fit-sigmoidalen Kurve mit einem nicht-linearen Kurvenanpassungsalgorithmus. Note die Arzneimittelkonzentration, die zu 50% Lebensfähigkeit der Zellen als zelluläre IC50.
5. Als nächstes Platte sechs Millionen BAF3-Zellen, die JAK2 Varianten in sechs Lochplatten in RPMI-Medium mit 10% Serum mit ansteigenden Konzentrationen von Ruxolitinib und für 4-6 h bei 37 ° C inkubiert.
6. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für fünf Minuten bei 4 ° C. In 20 mM Tris-Cl Waschen der Zellen einmal mit PBS und Lyse (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 2 mM Natriumvanadat, und 5% Glycerol mit Protease-Inhibitor-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren ergänzt wird. Beschallen die Zellsuspension für 1 min, gefolgt von der Zugabe von 5x Gel-Ladepuffer (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM Benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM Natriumvanadat , Protease-Cocktail, 50% Glycerin und 0,001% Bromphenolblau) und Denaturierung bei 70 ° C für 5-10 min.
7. Lösung der Proteine ​​auf einem 8% SDS-Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen. Führen Immunoblotting mit monoklonalen Maus anti-phopsho STAT5. Isolieren Sie die Flecken und sondiert mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-SATA5 Antikörper. Visualisieren Sie die Bänder unter Verwendung von ECL-Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.

5. In-vivo-Validierung

1. Transduzieren BAF3 Zellen Luciferase und Kirsch Ausdruck (transduziert mit Retroviren aus pMSCV-Luc-cher gemachtry GW) mit Viren, die JAK2 V617F-und resistente Varianten. Wählen Sie die Zellen, die Puromycin-Selektion für die Expression von JAK2 und sein Widerstand Varianten überleben.
2. Injizieren zwei Millionen aktiv wachsenden BAF3-Luc / Kirsch tragenden Zellen JAK2 V617F-und seine resistente Varianten in 200 ul PBS bis 6 Balb / C-Mäusen über eine Schwanzvenen-Injektion.
3. Nach drei Tagen Zelltransplantationen, spritzen die Mäuse mit Ruxolitinib (100 mg / kg) zweimal täglich für zwei Wochen.
4. Führen Luciferase basierenden Biolumineszenz-Bildgebung mit einem Bildgebungssystem. .
   1. Kurz gesagt, bereiten Luciferin durch Auflösen von 300 mg auf 25 ml sterilem deionisiertem Wasser, aliquoten in kleineren Mengen und zu speichern.
      HINWEIS: Shop Luciferin bei -80 ° C und vor Licht geschützt bis zur Verwendung.
   2. Volumina von 250 ul jeder Maus durch IP 125 mg / kg in jeder Maus zu erzielen. Anesthetize die Mäuse von derselben Unternehmensgruppe zusammen mit inhalativen Isofluran (1,5% -2,0%) in einer verschlossenen Box. Bewerben Tierarzt Salbe auf the Auge bis zur Trockenheit zu verhindern.
      HINWEIS: Die Zeit für Mäuse genommen zu schlafen (10-15 min) erlaubt Luciferin Aktivität zu Spitze. Halten Sie die Zeit konsistent zwischen den Gruppen der Variation zu vermeiden.
5. Übertragen Sie die Maus sofort auf Imaging-Kammer Bühne und Aufrechterhaltung einer Narkose bei 1,5-2% Isofluran bei bildgebenden Verfahren. Bild Mäusen mit sequentieller 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 und 300 s Belichtung. Machen Sie Bilder und zu quantifizieren Biolumineszenz-Intensität mit der Bildaufnahme und Analyse-Software. Nach Bildgebung zurückzukehren die Mäuse wieder in seinen Käfig.
6. Für In-vivo-Chimärismus Ernte Gesamtknochenmark-Zellen. Euthanize die Mäuse mit CO ₂ für 5 min mit zervikaler Dislokation. Ernten Sie die Knochen und zerschlagen in 4 ml kaltem PBS, um das Knochenmark zu sammeln. Analysieren Sie die Kirsche Prozent positiver Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop und quantifiziert mittels FACS. Sammeln zwanzigtausend Veranstaltungen von jeder Probe.

Ergebnisse

Entstehung von genetischen Mutationen wirft große Herausforderung für die gezielte Anti-Kinase-Therapie. Mutationsstudien, neben der Bereitstellung von Mechanismen und funktionelle Erkenntnisse, die maßgeblich an der Auswahl und Gestaltung der nächsten Generation der Medikamentenentwicklung sind, ermöglicht auch eine bessere klinische Behandlung und können in Zukunft mehr hilfreich für personalisierte Behandlung. In diesem Experiment zeigen wir Screening Ruxolitinib Resistenzmutationen in JAK2 V617F-Kinase

Diskussion

Der klinische Erfolg von Imatinib in der Behandlung von CML zeigten nicht nur das Potenzial der gezielt die rouge Kinasen von niedermolekularen Inhibitoren, sondern auch aufgedeckt Grenzen der zielgerichteten Therapie: klinischen Rückfall und Entstehung von Resistenzen Mutationen im Zielgen. Identifikation von Resistenzmutationen hilft bei der besseren klinischen Management und die Entwicklung der nächsten Generation von Inhibitoren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Arzneimittel-resistente Mutationen im Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell and Tissue culture
BaF3 Cells	ATCC
HEK293T cells	ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW	A gift from Ross Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW	Made in house
pMSCV-V617F-Cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW	Made in house
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW	Made in house
pMSCV-Luciferase-puro.GW	Made in house
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1X	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/ml stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
INCB018424 (Ruxolitinib)	ChemieTeK	941678-49-5
WST-1	Roche	11644807001
0.45 micron disc filter	PALL	2016-10
70 micron nylon cell strainer	Becton Dickinson	352350
Bacterial Culture
XL-1 red E. coli cells	Agilent Tech	200129
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/ml stock solution
Bacto agar	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Kits
Dneasy Blood& tissue kit	Qiagen	69506
Expand long template PCR system	Roche	1168134001
Wizard Sv gel and PCR clean up system	Promega	A9282
Pure Yield plasmid mini prep system	Promega	A1222
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells	Invitrogen	12535029
Gateway  LR Clonase Enzyme mix	Invitrogen	11791019
Mouse reagents
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade	Promega	P1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor centrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD		This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting