Mess Lokale Anaphylaxie bei Mäusen

Zusammenfassung

Allergischen Reaktionen, gekennzeichnet durch die Aktivierung von Mastzellen und Basophilen, durch die Quervernetzung von IgE und Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren zurückzuführen. Eine quantitative Beurteilung von allergischen Reaktionen können mit Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären Permeabilität nach Allergenprovokation überwachen erreicht werden.

Zusammenfassung

Allergische Reaktionen sind das Ergebnis der Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und die nachfolgende Freisetzung von vasoaktiven und proinflammatorische Mediatoren. Exposition gegenüber einem Allergen in einem sensibilisierten Individuum kann in der klinischen Symptome, die von leichten Hautrötung bis zu lebensbedrohlichen Anaphylaxie variieren führen. Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt worden, um die Mechanismen, die allergische Reaktionen zu verstehen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Veränderungen der vaskulären Permeabilität, um lokalisierte allergische Reaktionen zu quantifizieren. Die lokale Anaphylaxie-Assay wurde in den 1920er Jahren berichtet, und hat sich von der von Kojima et al Technik angepasst. 2007. ¹ In diesem Test Mäuse-OVA sensibilisiert sind im linken Ohr mit Vehikel und im rechten Ohr mit OVA in Frage. Dies wird durch eine intravenöse Injektion von Evans Blue-Farbstoff gefolgt. Zehn Minuten nach der Injektion von Evans Blue, wird das Tier getötet und der Farbstoff, der in den Gefäßen hatin den Ohren wird über Nacht in Formamid extrahiert. Die Absorption der extrahierten Farbstoffs wird dann mit einem Spektrophotometer quantifiziert. Diese Methode zuverlässig eine visuelle und quantifizierbare Manifestation einer lokalen allergischen Reaktion.

Einleitung

Typ-I-Hypersensitivität durch Antigen-induzierte Vernetzung von IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen vermittelt. Dies führt zu zellulären Degranulation und Freisetzung vasoaktiver und proinflammatorische Mediatoren, wie Histamin, Tryptase und Plättchen-aktivierender Faktor ^2. Nach der Veröffentlichung der vorgeformten Mediatoren während der Degranulation, Mastzellen zu synthetisieren und frei Prostaglandinen und Leukotrienen, die Gefäßdurchlässigkeit ³ weiter zu erhöhen. Die ersten klinischen Reaktion schnell erfolgt und wird als eine "sofortige Reaktion" bezeichnet. In der Haut, ist eine Quaddel-und-Flare Reaktion innerhalb von Minuten nach Antigenexposition gut sichtbar. In Abhängigkeit von der Dosis der Herausforderung ist es möglich, ein "Spätphasenreaktion" ein paar Stunden später zu beobachten. Spätphase Schwellung ist durch lokalisierte Ödeme und die Rekrutierung von Leukozyten in das Gewebe ^2. Histamin, allgemein als der Hauptmediator sein, die anallergische Sofortreaktionen, wirkt auf Histamin-Rezeptor-1 (HR1) bezogen auf die Gefäße und Histamin-Rezeptor-2 (HR2) bezogen auf die glatte Muskulatur. Die kombinierte Wirkung erhöht den Blutfluss und die vaskuläre Permeabilität in der Entzündungsstelle ^4.

Eine Vielzahl von Tiermodellen für Allergie haben, um die Mechanismen bei allergischen Entzündungen beteiligt, darunter Modelle von allergischem Asthma, systemische Anaphylaxie, und lokale Anaphylaxie studieren entwickelt. Intravenöse Verabreichung Farbstoff verwendet wurde, um lokalisierte allergische Reaktionen in Tiermodellen für fast ein Jahrhundert zu messen, mit Veröffentlichungen, die diese Technik aus dem 1920er Jahren ^5. Kaninchen und Meerschweinchen waren die ersten Tiermodelle verwendet werden, um sofortige Überempfindlichkeitsreaktionen zu testen, und die empfindlichsten Antworten wurden in der Regel im Ohr ^5,6 gefunden. Der Test wurde später für den Einsatz in Ratten und Mäusen ^{7 8} validiert.

Historischeine Vielzahl von experimentellen Methoden verwendet worden, einschließlich der Injektion des Antigens vor der Injektion von Farbstoff Injektion von Farbstoff vor der Injektion des Antigens, und gleichzeitiges Einspritzen von Farbstoff und Antigen. Intravenöse Verabreichung Farbstoff als ein Mittel zum Messen allergischen Reaktionen ist ein vielseitiges Assay kann zur Messung aktiv, passiv verwendet werden, und Rückwärts passive Reaktionen ^5,9. Zahlreiche Farbstoffe wurden verwendet, um allergische Reaktionen, einschließlich Trypanblau, Pontamine Sky Blue, Evans-Blau, Blau 536 Geigy, und Tusche ^5,6,9 bewerten. Eine Lösung von 0,5% Evans-Blau ist derzeit der Standard-Farbstoff zum Messen allergischen Reaktionen in der Haut.

Der anaphylaktische Reaktion auf Herausforderung ist vergänglich; maximale Intensität innerhalb von 10 erreicht - 15 min der Farbstoffinjektion, und keine Reaktion ist sichtbar, wenn Farbstoff mehr als 30 min nach der Exposition verabreicht werden, unabhängig von der zugrunde ⁹ Tiere. Quantifizierung der Farbstoff Extravasation war ursprünglichly erhalten durch Messung Quaddel Größe wie durch den blauen Farbstoff ^7-9 angegeben. Zusätzlich können Zählungen degranulierten Mastzellen durch Ausschneiden Hautgewebe von der Stelle der Reaktion und Färbung mit Toluidinblau ⁷ quantifiziert werden. Mastzelldegranulation wird oft als Marker für Haut, IgE-vermittelten allergischen Reaktionen verwendet werden, wie Mastzellen sind die wichtigsten lokalen Zellpopulation des hochaffinen IgE-Rezeptors FcsRI ausdrückt. Spektrophotometrische Techniken zur Messung Farbstoff Extravasation in das Gewebe wurde für die passive kutane Anaphylaxie (PCA) bei Ratten ¹⁰ und der Maus ¹¹ in den 1990er Jahren entwickelt.

Die folgenden lokalen Anaphylaxie Assay-Protokoll wurde von Kojima et al angepasst. ¹ und nutzt Hühnerei Ovalbumin (OVA) als Antigen für die Auslösung allergischer Reaktionen. Jedoch können andere als OVA-Antigene, wenn gewünscht, verwendet werden. Der Assay verwendet dann Evans Blue-Farbstoff auf Veränderungen der vaskulären permeabilit überwacheny, die durch Zell IgE Vernetzung und Freisetzung von Histamin Mast auftreten.

Protokoll

1. sensibilisieren Mäuse

1. Vorbereiten eines OVA-Stammlösung durch Verdünnen von OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 20 mg / ml. Einfrieren unten Aliquots in Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung.
2. Bringen Sie einen oder mehrere Teilmengen von 20 mg / ml OVA Lager auf Raumtemperatur. Verdünnen OVA in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml in einer 5 ml Polystyrolröhrchen mit rundem Boden einer Kappe. Vortex kurz zu mischen.
3. Halten Sie die Polystyrol-Röhrchen mit dem 1 mg / ml OVA auf einem Vortex bei mittlerer Geschwindigkeit eingestellt, das gleiche Volumen von gut homogenisiert Imject Alum (40 mg / ml) tropfenweise, während es das Rohr, um eine 1 zu produzieren vortexen: 1-Verhältnis von Alaun Immunogen.
4. Zeigen Kappe auf dem Rohr und Band Rohr Wirbel. Schalten Wirbel auf niedrigster Stufe und lassen OVA zu Alum 30 min zu adsorbieren.
   1. Erlauben nicht eine große Menge an Zeit, um zwischen der Vorbereitung OVA / Alum und Sensibilisierung Mäuse passieren. Wenn Sensibilisierung kann nicht direkt nach OVA / Alum Präparate abgeschlossen werdenIonen, speichern OVA / Alum bei Raumtemperatur. Wirbel für 1 min vor der Verwendung.
5. Legen Sie eine 1 ml Insulinspritze mit OVA / Alum-Mischung. Verschließen Sie die Spritze mit 27-Gauge-Nadel.
6. Injizieren 100 ul OVA / Alum in das Peritoneum von BALB / c-Mäusen eine Dosis pro Maus von 50 ug OVA und 2 mg Alaun.
7. Für eine negative Kontrolle, sensibilisieren andere Gruppe von Mäusen, die PBS. Eine 1: 1-Mischung von Alaun und PBS in derselben Weise wie oben aufgeführt, jedoch ohne OVA.
8. Sensibilisieren Alle Mäuse (OVA und PBS-Kontrolle) einmal pro Woche für 3 Wochen für insgesamt 3 Injektionen. Nach letzten Injektion warten mindestens 2 Wochen vor der Durchführung der lokalen Anaphylaxie-Assay.

2. Lokale Anaphylaxie Assay

1. Bringen OVA-Stammlösung auf Raumtemperatur. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt 20 mg / ml OVA Lager bis zu einer Endkonzentration von 5 mg / ml mit PBS (1: 4-Verdünnung von OVA in 1X PBS). Vortex kurz zu mischen.
2. Betäuben Mäuse mit RC ^{2 <}/ Sup> Nageranästhesiesystem (oder einem vergleichbaren verdampft Liefersystem). Füllen Reservoir mit Isofluran, und schalten Sie O ₂ Luftstrom. Ort Mäuse in Induktionskammer und passen Isofluran Steuerregler, um 5% auf Betäubung zu initiieren. Sobald die Mäuse vollständig betäubt, durch einen Mangel an Mobilität angedeutet, stellen Isofluran Steuerregler, um 3% auf tiefe Betäubung erhalten. Der Zweck der Narkose bei diesem Verfahren ist, um das Tier zu immobilisieren. Die Ohr und Schwanzvene Injektionen verursachen keine erhebliche Schmerzen oder Leiden für das Tier.
   HINWEIS: Isofluran kann negative Auswirkungen auf die menschliche Fortpflanzungssystem. Achten Sie darauf, in einem gut belüfteten Raum verwenden und fügen Sie eine Aufräum Kanister zur Induktionskammer zur Abgas neutralisieren. Wenn Sie bei der Verwendung von Isofluran schwanger sind, tragen eine Maske Kohlefilter, um die Exposition zu minimieren.
3. Last 10 ul 5 mg / ml OVA in eine 3/10 cc-Insulinspritze mit einer 31 G Nadel begrenzt. Legen Sie eine weitere 10.3 ccm Insulinspritze mit 10 ul1x PBS.
4. Verwendung eines Binokular injizieren 10 ul OVA in das rechte Ohr eines anästhesierten Maus für eine Expositionsdosis von 50 ug OVA. Andere Dosierungen wie 20 ug, sind ebenfalls akzeptabel.
   1. , Um die Injektion zu stabilisieren das Ohr, wickeln Klebeband (Klebeseite nach oben) um eine 15 ml konischen Röhrchen. Sichern die dorsale Seite der rechten Ohr auf das Band. Führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben zwischen die beiden Blätter des Ohres. Langsam spritzen OVA in der Mitte des Ohrgewebe, kümmert sich nicht um irgendwelche Blutgefäße betroffen.
5. Unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen Verfahren injizieren 10 ul PBS in das linke Ohr als negative Kontrolle.
6. 3 min warten.
   1. Während dieser Zeit, die Maus in einem Restrainer und halten den Schwanz unter einer Wärmelampe oder in einem warmen Wasserbad für 1 min, um die Blutgefäße erweitern.
7. Verwendung einer 1 ml Insulin-Spritze mit einer 27 G Nadel nach oben begrenzt, langsam injizieren 200 ul 0,5% Evans Blue-Farbstoff in den Schwanz vEin von der Maus. Schnelle Injektion kann die Gefäßstruktur, bevor die gesamte 200 ul zerstören verabreicht wird. Wenn dies geschieht, versucht, das Restvolumen des Farbstoffs in die Vene auf der gegenüberliegenden Seite des Schwanzes injiziert.
8. Warten Sie 10 min.
9. Euthanize die Maus und entfernen Sie die beiden Ohren mit einer Pinzette und chirurgische Schere.
   1. Greifen die Kanten des Ohres mit einer Zange, um sicherzustellen, dass kein Druck auf die Injektionsstelle in der Mitte des Ohrs aufgebracht. Entfernen Sie so viel wie möglich Ohrgewebe durch Schneiden der Nähe, aber nicht durch die Rippe der vorliegenden Knorpel an der Basis des Ohres. Kleine Mengen von Fell kann auf dem ausgeschnittenen Ohr vorhanden sein; Dies hat keine Auswirkungen auf den Test.
10. Aliquoten 700 ul Formamid in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Bereiten Sie eine Röhre pro Ohr (zwei Röhren pro Maus).
    HINWEIS: Formamid teratogen, mutagen und reizend. Handschuhe, Schutzbrille und Gesichtsschutz tragen. Schwangere Frauen sollten beim Umgang mit dem Vorsicht verwendens Formamid kann fötotoxischen sein.
11. Fügen Ohren zu Formamid, Kappe die Rohre, und Inkubation über Nacht in einem trockenen Wärmebades auf 63 ° C eingestellt. Ohren können noch leicht blau nach Inkubation erscheinen; aber der Großteil des Farbstoffs in die Formamid extrahiert werden.
12. Geben Sie 300 ul jeder Probe, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Platte. Übertragen vermeiden Fell, wenn er in der Probe vorhanden ist. Sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden ist, da sie die Absorptionsmessung beeinflussen.
13. Fügen Sie 300 ul Formamid, in zweifacher Ausfertigung an die 96-Well-Platte. Diese Brunnen werden als Rohlinge verwendet werden.
14. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption bei 620 nm messen. Subtrahieren Formamid Brunnen von jeder Probe zu lesen.
    HINWEIS: Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der Universität uniformierten Diensten Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt geführt.

Ergebnisse

Tiere, die den Test bestanden haben, müssen Haut und Augen, die blau erscheinen. PBS sensibilisierten Tieren sollte nicht entweder PBS oder OVA Herausforderung reagieren, daher beide Ohren sollten weiß (1A) bleiben. In OVA sensibilisierten Tieren, das Ohr Erhalt der PBS Herausforderung (links) sollte entweder ganz weiß oder in einer lokalisierten Weise an der Injektionsstelle leicht blau. Das Ohr Erhalt der OVA Herausforderung (rechts) sollten schrittweise dunkleres Blau während der 10 Minuten nach ...

Diskussion

Zahlreiche Markierungen von allergischen Erkrankungen verwendet werden, um die Stärke der allergischen Reaktionen nach Allergenprovokation, einschließlich Änderungen in der Konzentration von zirkulierendem Histamin, Th2-Cytokin Produktion und Zellrekrutierung in der bronchoalveolären Flüssigkeit in der Umgebung der Atemwegs Herausforderung zu bewerten. Während die Überwachung Änderungen dieser Parameter ist wichtig für die Untersuchung allergischen Reaktionen, biologische Marker nicht immer mit klinischen aller...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform