Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit "Fracht Mapping" Analysis

Zusammenfassung

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Mechanismen, mit denen molekulare Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um vesikuläre Ladungen innerhalb Neuronen transportieren erfordert die quantitative Analyse von Motor / Frachtverbände an der einzelnen Vesikel Ebene. Das Ziel dieses Protokolls ist es, quantitative Fluoreszenzmikroskopie, um die Zusammensetzung und die relativen Mengen von Motoren mit der gleichen Ware zusammen verwenden, um zu korrelieren ("Karte") die Position und Ausrichtung der Verbringung von lebenden Fracht. "Fracht Mapping" besteht aus Live-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Ladungen bewegt sich in Axonen auf mikrofluidischen Systemen kultiviert, gefolgt von chemischen Fixierung während der Aufzeichnung von Live-Bewegung, und anschließende Immunfluoreszenz (IF) Färbung der exakt gleichen axonalen Regionen mit Antikörpern gegen Motoren. Kolokalisation von Ladungen und dazugehörigen Motoren wird durch Zuweisen Teilpixelposition beurteilt Koordinaten Motor und Ladekanäle, durch Einpassen Gauß-Funktionen, um den beugungs ligrenzten Punktbildfunktionen, die einzelne fluoreszierende Punktquellen. Feste Ladung und Motor Bilder werden anschließend auf Parzellen von Frachtbewegung überlagert, um "Karte", dass sie ihr verfolgten Trajektorien. Die Stärke dieses Protokolls ist die Kombination von lebenden und IF-Daten, sowohl den Transport von vesikulären Ladungen in lebenden Zellen zu erfassen und um die Motoren zu diesen gleichen Vesikel assoziiert bestimmen. Diese Technik überwindet früheren Herausforderungen, die biochemischen Methoden verwenden, um die durchschnittliche Motor Zusammensetzung gereinigt heterogenen Groß Vesikelpopulationen bestimmen, wie diese Methoden nicht Kompositionen auf einzelnen, sich bewegenden Ladungen offenbaren. Ferner kann dieses Protokoll für die Analyse von anderen Transport- und / oder Transportwege in anderen Zelltypen geeignet ist, die Bewegung der einzelnen intrazelluläre Strukturen mit ihrer Proteinzusammensetzung zu korrelieren. Einschränkungen dieses Protokolls sind die relativ geringen Durchsatz aufgrund der geringen Transfektionseffizienz kultivierterprimären Neuronen und eine begrenzte Sichtfeld für hochauflösende Abbildungs ​​erhältlich. Zukünftige Anwendungen könnten Verfahren umfassen, die Anzahl der Neuronen, die fluoreszierend markierten Ladungen zu erhöhen.

Einleitung

Intrazellulären Transport ist kritisch bei allen Zelltypen für die Abgabe von Proteinen, Membranen, Organellen und Signalmolekülen zu verschiedenen zellulären Domänen ^1. Neuronen sind hoch spezialisierte Zellen, die mit langen, polarisierten Projektionen, die sich kritisch auf den intrazellulären Transport von essentiellen Güter für ihre Langstrecken Lieferung an verschiedenen axonalen Mikrodomänen abhängen. Zwei große Familien von molekularen Motorproteinen - - Dieser Transport wird durch Kinesinen und Dyneine vermittelte, dass bind zu Ladungen und verfolgen zusammen polarisiert Mikrotubuli in anterograde und retrograder Richtung. Während Rückwärtsbewegung wird hauptsächlich durch Dynein vermittelt, wird die Bewegung in der anterograde Richtung von einem großen, funktionell vielfältige Familie von Kinesin-Motoren erleichtert. Folglich konnte anterograde Transport von axonalen Ladungen von verschiedenen Familienmitglieder der Kinesin-Superfamilie ^1-5 vermittelt werden. Obwohl einige Ladungen bewegen beharrlich in jeder Richtung, most Ladungen bewegen bidirektional und Rückwärts häufig auf ihrem Weg zu ihrem endgültigen Ziel ^1,5-13. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Motoren gleichzeitig gegenüberliegenden Richtungs assoziieren Ladungen, was die Frage aufwirft, wie geregelten Bewegung der Ladungen von entgegengesetzter Polarität Motoren ^5-7 koordiniert. Gemeinsam ist den Transport von Axonen Ladungen eine abgestimmte Prozess, der von der Zusammensetzung der Motoren und ihrer spezifischen biochemischen Aktivitäten, die wiederum abhängig von verschiedenen Adaptern und regulatorische Bindungspartner ¹⁴ reguliert wird.

Um beschreiben zuverlässig den Mechanismus der axonalen Transport für eine bestimmte Ladung und die zugrunde liegende Regelung dieser Transport aufzudecken, ist es von größter Bedeutung, um die Zusammensetzung der Motorproteine ​​und deren Regulierungsbindungspartner mit individuellen Ladungen bei ihren Live-Verkehr verbundenen bestimmen. Andere Methoden, zum Beispiel biochemische Ansätze liefern Schätzungen des durchschnittlichen motoder Zusammensetzungen auf gereinigten heterogenen Vesikelpopulationen, aber diese Schätzungen enthüllen nicht die Art oder die Menge der Motoren, um einzelne bewegenden Vesikeln assoziiert. Auch Rekonstitution Vesikeltransportstudien entlang vormontierten Mikrotubuli in vitro aktiviert Messen der Menge von einem Motortyp auf einem Vesikel Stufe ^15. Jedoch haben diese Versuche nicht direkt korreliert die Menge der Motoren mit den Transporteigenschaften dieser Vesikel und gemessenen Verkehrs in Abwesenheit von zellulären regulatorischen Faktoren.

Ein Protokoll wird hier vorgestellt, die den Motor Zusammensetzung (Art und relative Menge der Motoren) der einzelnen beweglichen Vesikel aus Immunfluoreszenz (IF) Datenmess endogen exprimierten Motorproteine ​​bestimmt, und korreliert diese Parameter, um die Live-Transport von der exakt gleichen Vesikel in Nervenzellen ^16. Dieses Verfahren beinhaltet eine präzise Abbildung der IF-to-live Frachtbewegungsdaten. Dies wird bewerkstelligt Growing Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräte folgen etablierten Protokollen ^17-19. Diese Geräte ermöglichen die Identifizierung und Korrelation ("Mapping") von Axonen und Einzel bewegten Ladungen in festen und Live-Lichtmikroskopie Modalitäten (Abbildung 1). Kultivierten Neuronen werden mit fluoreszenzmarkierten Fracht Proteine, deren Transport mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abgebildet werden, um detaillierte Bewegungsinformationen, die in Kymographen aufgetragen wird erhalten transfiziert. Im Verlauf der Bilderzeugung werden Neuronen, die mit Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine ​​angefärbt. Feste Fracht und Kraftbilder auf Live-Bewegung Kymographen lagert, um "Karte" (colokalisieren) sie an den Live-Fracht Bewegungstrajektorien ^16. Um die Live-Bewegung der Ladungen mit dem Verband der Motorproteine ​​korrelieren, wird Kolokalisation mit einem maßgeschneiderten MATLAB Software-Paket namens "Mo analysierttor Kolokalisation ^"16,20. Fluoreszenzmarkierten Ladungen und Motoren erzeugen beugungsbegrenzten punktförmige Merkmale, die teilweise überlappen können. Um die Position des überlappenden puncta zu beheben, zuerst passt die Software automatisch Gauß-Funktionen zu jedem Punktverwaschungsfunktion, die einzelne fluoreszierende Pünktchen, um ihre genaue XY Subpixel-Positionskoordinaten und Intensität Amplituden ^21-23. Die Positionen der Motoren und der Ladungen sind anschließend miteinander verglichen, um zu bestimmen Kolokalisation ^16,20. Daher wird dieses Verfahren genauer ordnet Kolokalisation von Fluoreszenzpünktchen im Vergleich zu anderen Verfahren ^24.

Die Stärke dieser Methode ist die Möglichkeit, die Kolokalisation von Motoren mit einzelnen Lade in fixierten Zellen zu beurteilen, für die Live-Bewegungsbahnen (beispielsweise die Richtung, in der sie zum Zeitpunkt der Fixierung bewegt) wurden recorded. Mit diesem Verfahren wurden kinesins und Dyneine Ergebnis gleichzeitig an Vesikeln, die die normale Prionprotein tragen (PrP ^C -cellular), eine neuronal angereicherten Ladung, die in zwei Richtungen bewegt oder stationär bleibt in Axonen ¹⁶ zuzuordnen. Diese Analyse erlaubt die Formulierung eines Arbeitsmodells für die Regulierung von PrP ^C Vesikel Bewegung, in der anterograde (Kinesin) und retrograde (Dynein) Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um die Vesikel in jeder Richtung bewegen oder stationär zu bleiben, während auf die Ware zusammen . Eine weitere Stärke dieser Methode ist, sein Potenzial breite Anwendbarkeit zur Charakterisierung Kolokalisation / Verband vieler fluoreszenzmarkierten Ladungen, die in praktisch jeder Zelltyp zu bewegen, mit einem anderen Protein (e) von Interesse. Somit könnte live / feste Zuordnung potentiell für den Nachweis von transienten Protein-Interaktionen Ladung zu ermöglichen, können so viele einzelne fluoreszenzmarkierten bewegenden Teilchen über einen gewünschten p analysierendeEITRAUM der Zeit. Angesichts der breiten Anwendbarkeit und die Art der Fragen, die diese Methode ansprechen können, wird dieses Protokoll von Interesse für ein breites Publikum von Zellbiologen einschließlich derjenigen studieren Handel und Transport in Neuronen oder in anderen Zelltypen sein.

Protokoll

Alle Experimente wurden folgende genehmigte Protokolle und gemäß gültiger Richtlinien für die humane Pflege von Versuchstieren durchgeführt. Neugeborene Mäuse wurden durch Enthauptung getötet.

1. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte für die Zellkultur

1. Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen für das Wachstum von Neuronen im Hippocampus, wie Harris und Kollegen ^17-19 beschrieben. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an der Ladung Mapping-Protokoll angepasst wurden.
   HINWEIS: Mikrofluidische Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich (Materialliste), um den Zugriff auf eine Herstellungsanlage nicht erforderlich ist.
2. Vorbereitung No. 1½ Deckgläser (24 x 40 mm) durch Waschen dreimal mit Aceton gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit 100% Ethanol und drei Wäschen mit Wasser. Store Deck in Wasser bei 4 ° C bis zur Verwendung. Diese Behandlungen helfen sicherzustellen, dass Deckgläser sind sauber von Ablagerungen, die mit Überzug von cel stören könntenls, Verunreinigungen und Überleben.
   HINWEIS: Aceton und Ethanol sind brennbar und im Falle von Hautkontakt (reizend), bei Augenkontakt (reizend) gefährliche, des Verschluckens, des Einatmens. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften.
3. Wenn Sie bereit sind zu verwenden, setzen Sie ein Deckglas in einem 60 mm Zellkulturschale pro Mikrofluidik-Vorrichtung, und lassen Sie sie trocknen für 45 Minuten unbedeckt in einer Biosicherheitswerkbank, um eine Kontamination zu vermeiden.
4. Nach Geräten werden von den Meistern geschnitten und Schläge wurden geschnitten, um die Stauseen zu erstellen (Abbildung 1A, B), legen Sie sie mit der mikrofluidischen Kanälen Seite nach oben in einer Biosicherheitswerkbank mit einer UV-Lampe ausgestattet für 45 Minuten für die Sterilisation.
   HINWEIS: Wenn Geräte, die unter UV-Behandlung für länger als 2 Stunden kann die Vollständigkeit der PDMS beeinträchtigt.
5. Montieren Sie die Geräte, indem ein Gerät auf jedes Deckglas im Inneren des 60 mm Kunststoff-Zellkulturschale, so dass die mikrofluidischen Kanälen nach unten zeigen. Drücken Sie vorsichtig an die Spitze of des Gerätes (nicht an der Mikrokanäle), eine nicht-dauerhafte Abdichtung des Geräts auf dem Deckglas bereitzustellen. Cover jede 60 mm Zellkulturschale mit einem Deckel.
6. Mit einer Mikropipette, Hydrat die Geräte durch Zugabe von Zellkulturreinem Wasser in den oberen zwei mikrofluidischen Reservoirs (1 und 2 in Abbildung 1A), damit Wasser ungehindert durchfließen. Wasser zu entfernen mit einer Mikropipette und fügen 1 mg / ml Poly-L-Lysin in mikrofluidische Reservoir 1 (200 ul) und 2 (100 ul). Der Volumendifferenz wird für die Poly-L-Lysin, durch die Mikrokanäle (1A, B) zu fließen.
7. Um sicherzustellen, dass die Geräte in den 60 mm Zellkulturschalen nicht umkippen in einem 37 ° C-Inkubator, legen drei 60 mm Zellkulturschalen die Geräte enthält, in einen 150 mm Kunststoff-Zellkulturschale und decken Sie die Schüssel mit einem Deckel. Inkubieren O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2. Typischerweise mehr als 90% der Kanäle pro Gerät verwendbar und zu tunenthalten keine Luftblasen oder physische Blockade.
8. Am nächsten Tag, ersetzen Poly-L-Lysin mit Wasser und lassen Sie Gerät in Inkubator für mindestens 1 Std. Wiederholen Sie diese dreimaligem Waschen. Entfernen Sie Wasser und fügen Neurobasal-Wachstumsmedium (mit 2% B-27 Ergänzung und 500 uM GlutaMAX) zu jedem Gerät. Lassen O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2.
9. Am nächsten Tag, plattenHippocampusZellen, wie unten beschrieben.

2. Überzug der Maus Hippocampus primären Neuronen in Mikrofluidiksysteme

HINWEIS: Die Herstellung von kultivierten hippocampalen Neuronen aus Neugeborene Ratten wurde zuvor in JoVE ²⁵ veröffentlicht. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an Platte Maus Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräte angepasst wurden, und das optimal für Transfektionen wurden.

1. Vor Maus Gehirnsezierung, vorwärmen Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum(FBS; ohne Antibiotika), Mischung A (125 mg DL-Cystein, 125 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 3,125 g D-Glucose in 500 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), Filter sterilisiert durch ein 0,22 um Filter) und Deoxyribonuclease I-Lösung (DNase I: 50 mg DNase I und 0,5 ml einer 1,2 M MgSO ₄ -Lösung in 100 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), filtriert durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert) in einem 37 ° C Wasserbad.
   1. Vorwärmen Neurobasal-A-Wachstumsmedium in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2, um den pH-Wert äquilibriert.
2. Sezieren hippocampi 1-3 Tage alten Neugeborenen Mäusen nach etablierten Protokollen ^26. Halten Hippocampus in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit 10 ml Dissektion Puffer (HBSS, das 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM Glucose, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, auf Eis. Setzen Sie bis zu 4 hippocampi pro 15 ml konischen Röhrchen.
3. Führen Sie die verbleibenden Protokoll ist unter sterilen Bedingungens innerhalb einer Biosicherheitswerkbank.
4. Verdünnte 45 Einheiten Papain in 5 ml der Mischung A, Vortex und Inkubation für 5 min bei 37 ° C bis Papainpulver gelöst. 1 ml DNase I-Lösung. Filtern der Mischung durch ein 0,22 & mgr; m Spritzenfilter Einheit.
5. Saugen Sie vorsichtig HBSS 'von 15 ml konischen Röhrchen mit hippocampi. 10 ml kaltem (4 ° C) HBSS zu hippocampi und ließ sie auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. Vorsichtig absaugen HBSS von 15 ml konischen Röhrchen.
6. 1 ml Papain / DNase I auf bis zu 4 hippocampi mischen und Inkubation für 20-30 min bei 37 ° C. Schwenk konischen Rohr alle 5 min zu hippocampi mit Mischung baden. Alternativ platzieren hippocampi in einem 37 ° C warmen Wasserbad Schüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 rpm).
7. Saugen Papain / DNase I mischen und waschen hippocampi zweimal mit vorgewärmten DMEM (37 ° C) mit 10% FBS.
8. Nach zweiten Wasch, 2 ml vorgewärmten DMEM, das 10% FBS auf hippocampi und manuell Triturat hippocampi durch Pipettierennach oben und unten ~ 10-12 mal mit einer 1 ml Pipettenspitze zu Neuronen zu distanzieren.
9. Lassen Triturat für ~ 1 min absetzen da dies ermöglicht nichtdissoziierten Neuronen auf den Grund des konischen Rohrs begleichen. Überstand enthält dissoziierten Neuronen auf ein neues 15 ml konischen Röhrchen Vermeidung einer Übertragung von größeren Gewebe, die am Boden des Rohres angesiedelt hat.
10. Spin-Zellen bei 1.000 × g für 2 min und Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Zellen in 80 ul Neurobasal-Wachstumsmedium durch Pipettieren vorsichtig.
11. Entfernen Medium von mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 '. Anwendung 20 ul Zellen (~ 275.000), um mikrofluidische Behälter 1, und ihnen erlauben, hindurchfließen. Setzvorrichtung in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ für 20 min.
12. Schauen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen wurden dem Deckglas geklebt. In Neurobasal-Wachstumsmedium nach oben aus alle Stauseen. Rückstellvorrichtung mit Zellen auf eine 37 ° C-Inkubator mit 5% CO _2.
13. Überprüfen Geräte jeden ~ 2-3 Tage und runden Behältern mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung (ohne GlutaMAX) zu vermeiden Verdunstung. Neuronen beginnen, ihre Axone durch mikrofluidische Kanäle 2-3 Tage nach der Plattierung erstrecken ~. Betreff Neuronen normalerweise 7-10 Tage nach der Plattierung Transfektion.

3. Die Transfektion von Neuronen im Hippocampus Mikrofluidikvorrichtung Grown

1. Pro Gerät, Vorbereitung einer Mischung von 1,2 & mgr; l Lipofectamin 2000 30 ul Neurobasal-A und eine Mischung von 0,5 ug Fluoreszenzfrachtfusions Plasmid in 30 ul Neurobasal-A und inkubiere 5 min bei RT. In Lipofectamin-Mix, um DNA-Mix und Inkubation für 20 min bei RT. In 60 ul Neurobasal-A, die 4% B-27 Ergänzung zur DNA / Lipofectamine mischen und mischen durch Schwenken des Rohres.
2. Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 2 und 2 'und vorsichtig füllen Wells mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung ohne Verschütten auf mittlere into den anderen Fächern.
3. Entfernen Sie das Medium aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 '. In 120 ul DNA / Lipofectamine mischen, um mikrofluidische Reservoir 1 und lass es fließen. Rückstellvorrichtung auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO ₂ für 3-4 Std.
4. Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 'und ersetzen Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung für 24 Stunden (oder bis bereit zu Bild). Typischerweise werden 5-7 Axone, die durch Mikrokanäle wachsen unter diesen Bedingungen, die etwa 1-3% Transfektionseffizienz Einklang mit Wirkungsgrade für Hippocampus-kultivierten Zellen ²⁶ veröffentlicht repräsentieren transfiziert.

4. "Fracht Mapping" Analysen

1. Live-Imaging von Fracht Bewegung
   1. Führen die Abbildung auf einem umgekehrten Licht Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator und einem CO ₂ Steuerkammer ausgestattet.
   2. Montieren Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in einem MICR gewachsenofluidic Gerät auf dem Mikroskoptisch. Um neuronalen Tod zu vermeiden, arbeiten zügig, um die Proben am Mikroskop nicht länger als 1 Stunde zu halten.
   3. Verwendung eines hochauflösenden Objektiv (100X), finden Axone von transfizierten Zellen, die durch die Kanäle des Mikrofluidkammern erstrecken, und Aufzeichnen der Anzahl der Kanäle in dem die transfizierten Axon gefunden. Zählen Sie die Anzahl der Kanäle mit einer Handstückzähler.
      1. Für eine optimale Aufzeichnung der Live-Bewegung und anschließende Kolokalisationsanalyse Wählen Axone, die relativ flach durch die Kanäle, so dass Abbildungs ​​der meisten Vesikel im Fokus durchgeführt werden wachsen.
   4. Entfernt die meisten Mediums von Reservoirs 2 und 2 'mit einer 1 ml Kunststofftransferpipette. Nachfolgende Ausrichtung der fixierten Bilder mit Bewegungsbahnen auf Kymographen erleichtern, richten die rechte Kante der Mikrokanäle mit dem Sichtfeld während der Bildgebung (1B, C).
   5. Um fixin erleichterng der Proben während der Bildgebung, Sie live Bildgebung mit zwei Personen. Alternativ, wenn die Live-Darstellung wird von einer einzelnen Person durchgeführt wird, verwenden Sie ein Mikroskopsystem mit Driftkorrektur ausgestattet.
   6. Starten Sie Echtzeit-Bildgebung Frachtbewegung mit Zeitraffer-Spezifikationen in der Verkehrsdynamik der Ladung analysiert (Mikroskop Spezifikationen und Einstellungen zur Abbildung YFP-PrP ^C sind in der Legende von Abbildung 2 und Materialliste angegeben).
   7. Nach ausreichender Live Bewegungsdaten gesammelt worden sind, haben eine Person füllen Reservoirs 2 und 2 'mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd in PBS, die 0,04 g / ml Saccharose, um die Zellen zu fixieren. Berühren Sie nicht die Mikrofluidik-Vorrichtung, da dies den Fokus der Live-Bildgebung stören. Haben die andere Person stellen Sie den Fokus während der Fixiermittel zugesetzt. Fixation ist erfolgreich, wenn sofortigen Stopp der Bewegung wird beobachtet. In Fixiermittel danach Reservoir 1 und 1 '.
      HINWEIS: Temporäre photobleaChing des Fracht Fluoreszenz kann auch beobachtet werden, aber die Fluoreszenz besteht, nachdem IF Färbung für Motorproteine ​​abgeschlossen ist (nächster Schritt).
      HINWEIS: Paraformaldehyd ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften.
2. IF-Färbung von Motorproteinen für Kolokalisationsanalyse
   HINWEIS: Für die Quantifizierung der relativen Pegel der Motor-Proteine ​​(wie durch Antikörperfärbung bestimmt), um einzelne bewegliche Ladungen zugeordnet sind, zu validieren und zu titrieren Antikörpern, um sicherzustellen, daß der Antikörper-Antigen-Bindung ist gesättigt. Dies wird durch die Bestimmung der Spezifität des Antikörpers unter Verwendung von Neuronen in dem das Protein von Interesse wurde entweder herausgeschlagenen bzw. zerlegt geführt, und durch Ausführen IF Analyse mit steigender Antikörperkonzentrationen. Für Negativkontrollen sind Neuronen mit Sekundärantikörper in Abwesenheit von primären Antikörpern gefärbt. DetailliertereBeschreibung der Antikörpervalidierung kann in Encalada et al. ^16, und Szpankowski et al. ²⁰ gefunden werden.
   1. Entfernen Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung aus dem Mikroskoptisch gewachsen. Mikrofluidik-Vorrichtung nicht abmontieren, aus dem Deckglas, wie die Mikrokanäle benötigen, um die lebenden und fixierten Bilder einzublenden intakt bleiben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer feuchten Kammer.
   2. Um die Strömung von Lösungen in die Mikrokanäle zu gewährleisten, halten ein Puffervolumen Differenz zwischen Behälter 1, 1 'und 2, 2' von mindestens 30 & mgr; l. in allen nachfolgenden Schritten. Fügen Sie beispielsweise 100 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 2, 2 ', und 70 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 1, 1'.
   3. Entfernen Fixiermittel aus den Kammern der Mikrofluidikvorrichtung und wasche die Zellen dreimal mit PBS wartet 10 min zwischen den Waschgängen.
   4. Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS für 5 min auf allen Reservoiren.
   5. Entfernen Lösung aus allen Stauseen und waschen mit PBS. Wiederholen dreimaligem Waschen warten Sie 10 min zwischen Wäschen.
   6. Entfernen Lösung aus allen Behältern und gelten Blockierungspuffer mit 10% normalem Eselserum und 3% Protease frei und Immunglobulin G (IgG) -freie BSA in PBS und Inkubation für mindestens 30 min bei RT.
   7. Spin primären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer von Mikrofluidik-Vorrichtung mit Antikörperlösung. Proben inkubieren für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C.
   8. Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen.
   9. Spin sekundären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen PBS mit sekundären Antikörperlösung. BebrütenProben für 1 Stunde bei RT.
   10. Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen.
   11. Ersetzen PBS mit ~ 10-20 ul Eindeckmediums durch direktes Pipettieren Eindeckmediums in die Öffnung der Kanäle, welche die Reservoire. Lassen Eindeckmedien trocken ~ 20 min - 1 h bei RT.
   12. Speicher-Geräte bei 4 ° C lichtgeschützt zu vermeiden Bleichen und Bild Axone innerhalb von zwei Tagen (maximal eine Woche) der Färbung.
   13. Nach der Färbung abgeschlossen ist, montieren Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung auf den Mikroskoptisch gewachsen. Suchen Sie den Bereich der transfizierten Axon in Schritt 4.1.1-4.1.7 abgebildet.
   14. Erwerben Z-Stapel-Bildern (300 nm-Schritten) für jeden der drei Kanäle: Ladung, Motor 1, Motor 2 mit einem hochauflösenden Objektiv (zB eine hohe numerische Apertur Öl oder Wasser Ziel).
       HINWEIS: Übernahme von Z-Stapel ist wichtig, da Axone häufig nicht perfekt flach wachsenin Mikrokanälen deshalb werden nicht alle fluoreszierenden Pünktchen in der gleichen Brennebene.
3. Fracht Mapping
   1. Generieren Sie eine kymograph Frachtbewegung mittels Bildanalyse-Software. Die ImageJ Plugin von Rietdorf und Seitz (EMBL) entwickelt wird zur Erzeugung Kymographen empfohlen (zum Download finden Materialliste).
      HINWEIS: ImageJ ist ein public domain, Java-basierte Bildverarbeitung an den National Institutes of Health ^27,28 entwickelte Programm (zum Download siehe Materialliste).
   2. Ausrichten der fixierten Bilder des fluoreszierenden Ladung (in Schritt 4.2.14 generiert) manuell durch Überlagerung davon auf die Lage der Bahnen in der kymograph am Fixierungspunkt (2A, B), mit einem handelsüblichen Graphiksoftwareprogramm (Material List). Durch Überlagern des ersten festen Bild Fracht auf dem kymograph und manuellen Wahl der Ladung Tränenpunkte, die einer bestimmten Bewegungsbahn auf entspricht manuell ausrichtendie kymograph. Für beste Ausrichtung Ergebnisse, verwenden Sie die Z-Schnitt, die in besten Fokus für die Ladung zugeordnet ist. Mehrere Z-Scheiben verwendet werden.
   3. Für jedes Bild in der Z-Stapel (Ladung, Motor 1 und Motor 2 im Schritt 4.2.14 erzeugt) die XY-Koordinaten und Intensität Amplituden für jedes Fluoreszenzpünktchen Verwendung eines Algorithmus festgelegt, um 2D-Gauß an die Punktverteilungsfunktion, die repräsentiert passen Jede Punktquelle in jedem der drei Kanäle ^16,20,21 (Figur 2D).
      HINWEIS: Um die XY-Koordinaten, einen speziell angefertigten MATLAB Software-Paket namens "Motor Kolokalisation" wurde ^16,20 entwickelt, die eine Gaußsche Anpassungsalgorithmus von Jaqaman, Danuser und Kollegen ^21-23 entwickelt beinhaltet erhalten. Das Software-Paket und detaillierte Anweisungen für ihre Verwendung ist auf Anfrage erhältlich.
   4. Für jedes der einzeln Frachtpünktchen, die auf die mobile oder stationäre Trajektorien auf der kymograph kartiert wurden, wählen Sie ter XY-Koordinaten und Intensität Amplituden aus den Ergebnissen der "Motor Kolokalisation" Programm (diese Ladungen werden einzeln in 2B beschriftet). Verwenden Sie mehrere Z-Stapel-Bildern in Schritt 4.2.14 erworben), um mehr Güter, die auf unterschiedlichen Fokusebenen zu finden sind abzubilden.
   5. Vergleichen Sie die einzelnen XY-Koordinaten für das zugeordnete Fracht denen für jede der Motorkanäle in der entsprechenden Z-Schnitt (2D) erhalten. Bestimmen Sie und wählen Sie die XY Motor Koordinaten, innerhalb eines 300 nm Radius der Fracht sind. Für Ladungen und Motoren, die Signal innerhalb der gleichen Brennebene haben, verwenden Sie den "Motor Kolokalisation" Software-Paket, um den Tränenpünktchen, die innerhalb eines 300 nm Radius befinden bestimmen.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt eine Übersicht der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet werden, um Neuronen des Hippocampus zu wachsen (1A, B). Neuronen werden in Behälter 1 plattiert Die Größe der Mikrokanäle verhindert die Diffusion der Zellkörper (Soma) in den axonalen Kompartiment, während die Länge der Kanäle verhindert dendritischen Vorsprünge der Kreuzung den ganzen Weg zu der axonalen Kompartiment. Nach ca. 2-3 Tagen in Kultur Neuronen beginnen verlauf ihre Axone über Mikrokanäle in...

Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Korrelation der Direktionalität der Bewegung der einzelnen fluoreszierenden Mikrotubuli-basierte Bewegen der Fracht Teilchen mit der relativen Art und Menge der zugeordnete Motor-Proteine ​​in lebenden Neuronen. Zuvor wurde die Gesamtmotor Zusammensetzung des axonalen vesikulären Ladungen auf heterogene Populationen von biochemisch gereinigt Vesikeln und Organellen ^9,15 getestet. Jedoch Charakterisierung Motorzusammensetzung für einen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine	Sigma	P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
B-27 Serum Free Supplement	Life Technologies	10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	Life Technologies	35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution)	Life Technologies	24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)	Life Technologies	14190250
Penicillin/Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture	Fisher Scientific	MT46000CM
Papain	USB Corporation	19925
DL-cysteine HCl	Sigma-Aldrich	C9768
BSA (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	A7906
D-glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DNAse I grade II	Roche Applied Sciences	10104159001
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027
Formaldehyde Solution 16% EM Grade	Fisher Scientific	50980487	Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-0121
BSA fatty acid and IgG free	Jackson Immuno Research	001-000-162
Acetone	Fisher Scientific	BP2403-4
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-100
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Axis microfluidic device, 450 µm	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon
Coolsnap HQ camera	Roper Scientific
60 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-95
150 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17	Santa Cruz	sc-13362	specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325	Santa Cruz	sc-9115	specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A31573	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody	Life Technologies	A11057	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A21447	recommended dilution 1:200.
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