Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Zusammenfassung

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Einleitung

Herzkrankheit bleibt die führende Ursache in der heutigen Welt und die Todesraten haben in den vergangenen zwei Jahrzehnten (American Heart Association) nahezu unverändert geblieben. Es gibt einen dringenden Bedarf für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien effektiv verhindern oder rückgängig Herzinsuffizienz. Ein vielversprechender Ansatz ist zellbasierte Therapie nach der raschen Entwicklung von Stammzellen biology ^1. In dieser Hinsicht könnte multi CPCs eine ausgezeichnete Zellquelle für die Therapie aufgrund ihrer Fähigkeit, sich zu vermehren, aber nur, um die Herzlinie Differenzierung gebunden werden. Daher effiziente und robuste Methode zur Erzeugung und Isolierung CPCs ist von großer Bedeutung für die Herzzelltherapie-Studien.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf embryonale CPCs der frühen Embryogenese und wie ihre Generation von WSR identifiziert. Verschiedene CPCs wurden aus embryonalen und adulten Herzen isoliert worden, auch aus Knochenmark ^2. Während der Embryonalentwicklung, Knochen morphogetische Proteine ​​(BMPs), flügellosen Typ MMTV Integrationsstelle Familienmitglieder (Wnts) und Nodal-Signale induzieren das Engagement der Mesp1 ⁺ multi Mesoderm ^3. Mesp1 ⁺ Zellen in die embryonale CPCs ⁴ unterscheiden dann. Diese CPCs werden typischerweise durch HCN4 markiert, NK2 homeobox 5 (NKX2-5) Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5) und Myozyten-Enhancer Faktor 2C (Mef2c), bilden primären und zweiten Herzfelder, und während Kardiogenese ^5-10 tragen zu der Hauptteile des Herzens. Sowohl NKX2-5 ⁺ und Isl1 ⁺ / ⁺ Mef2c CPCs Lage sind, in Kardiomyozyten differenzieren, glatte Muskelzellen (SMCs) und Endothelzellen ^5-8. So sind diese CPCs werden die zu Herzgefäßsystem sowie Herzgewebe zu geben und sind eine ideale Zellquelle für zellbasierte Herztherapie. Folglich erzeugen CPCs in vitro war ein wichtiger Forschungsschwerpunkt in der Herz-Kreislauf-Studien. Seit WSR haben unbegrenzte Erweiterungsmöglichkeiten einnd stellen die ICM-Zellen im Blastozystenstadium, ist die Differenzierung von WSR in embryonale CPCs nach der Naturembryogenese als eine logische und effektiven Ansatz zur CPCs zu erhalten.

Eine weit angelegte Herangehensweise an CPCs von WSR erhalten, ist die Wirtschafts- und Sozialräte in EBs ¹¹ aggregieren. Die Differenzierung Effizienz zu verbessern, sind definierte chemische und Wachstumsfaktoren auf Basis der Kenntnis der Herzentwicklung verwendet worden, ^12-14. Es gibt jedoch keine definitive CPC Marker, insbesondere keine Zelloberflächenmarkern, die allgemein auf dem Gebiet akzeptiert. Um dieses Problem anzugehen, WSR sind so konstruiert, Isl1 ⁺ oder Mef2c ⁺ CPCs und ihre Derivate mit fluoreszierenden Reporter mit Cre / loxP-System markieren. Die cre-Rekombinase in unter der Kontrolle Isl1 / Mef2c Promotor / Enhancer geklopft. Das modifizierte fluoreszierende Protein RFP oder YFP-Gen von einem konstitutiven Promotor angetrieben wird durch Exzision flox Stoppcodon mit cre-Rekombinase aktiviert werden(ISL1: cre; pCAG-flox-AUS-flox-GFP oder RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Sobald die Wirtschafts- und Sozialräte in zweiten Herzfeldes CPCs unterschieden werden Isl1 / Mef2c Promotor / Enhancer angetrieben cre die fluoreszierenden Reportern zu aktivieren und CPCs können durch FACS-Aufreinigung angereichert werden. Kurz gesagt, wird EB Aggregationsmethode verwendet werden, um ESC Differenzierung einzuleiten. Differenzierung Effizienz zu verbessern, werden die differenzierten Zellen mit Ascorbinsäure (AA) und Wachstumsfaktoren wie Bmp4, Activin A und VEGF ^13,15 behandelt. Dieses Protokoll ermöglicht robuste und effiziente CPC Differenzierung sowohl mit Maus und Mensch WSR.

Protokoll

1. Ableitung von embryonalen Maus-CPCs aus Maus WSR

1. Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) Feeder-Schicht.
   1. Warm MEF Medium (10% FBS in DMEM) auf 37 ° C.
   2. Bereiten Gelatine beschichteten Platten.
      1. 1 ml der 0,1% Gelatine in Wasser in eine Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen oder 5 ml in eine 10 cm-Schale.
      2. Lassen Platten oder Gerichte bei 37 ° C oder bei Raumtemperatur für mindestens 30 min. Streben die Gelatine vor der Verwendung.
   3. Thaw bestrahlt MEFs schnell in einem 37 ° C Wasserbad, unter leichtem Schütteln.
   4. Übertragen die Zellen vorsichtig in ein 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen. 5 ml vorgewärmten MEF Medium. Schwenken Sie die Zellen langsam und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min.
   5. Zellen in MEF Medium und zählen lebensfähigen Zellen. Verwenden Sie die folgenden Mengen von MEF Medium: 2 ml für Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte und 10 ml für Zellen aus einer 10 cm Schüssel.
   6. Platte Zellen in 6-Well-Platten oder 10 cm-Schalen bei 1-2x 10 ⁶ pro Platte / Schale.
   7. Die MEF Platten / Geschirr bei 37 ° C, 5% CO ₂ mindestens 24 Stunden vor der Verwendung.
      HINWEIS: Entsorgen Sie MEF Platten / Geschirr älter als eine Woche.
2. Bereiten Maus WSR
   1. Kultur der Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP Maus WSR auf MEFs bis 90% konfluent. Verwendung ES-Zellmedium bestehend aus 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM Pyruvat, 100 U Pen / Strep und 0,1 mM β-Mercaptoethanol.
   2. Bereiten Gelatine beschichtete 6-Well-Platten, wie in 1.1.2 beschrieben.
   3. Absaugen Medium von Platten und spülen Zellen mit DPBS.
      1. Saugen Sie DPBS und fügen Sie 0,4 ml 0,25% Trypsin in einem gut 6-Well-Platte. Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 5 min. 1 ml vorgewärmten ES-Medium zu Trypsin Reaktion zu beenden.
   4. Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge Zellen bei 200 xg und saugen Medium. Zellen in 1 ml ES-Zellmedium und zähle die Zellen.
   5. Platte WSR auf Gelatine-beschichteten Platten bei einer Dichte von 3 x 10 ⁴ / cm ^2. Bei 37 ° C, 5% CO ₂ für ca. 2 Tage bei WSR erreichen ca. 90% konfluent. Ändern Sie das Medium jeden Tag.
   6. Wenn WSR sind 90% konfluent, wiederholen Sie die Schritte 1.2.2-1.2.5 die MEF Feeder vollständig zu entfernen.
3. Induzieren CPC Differenzierung von EB Bildung
   1. Bereiten Differenzierungsmedium wie folgt: 36 ml IMDM, 12 ml Ham-F12, 2 mM L-Glutamin, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N 2, 0,5 ml B27, 50 ug / ml AA und 0,45 mM 1-Thioglycerin.
   2. Absaugen Medium von Zellen, und spülen Sie mit DPBS. Saugen Sie DPBS und fügen Sie 0,4 ml 0,25% Trypsin in einem gut 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 5 min.
   3. 1 ml Differenzierungsmedium, um die Reaktion und die Pipette bis zu beenden und auf Zellclustern in einzelne Zellen zu verteilen.
   4. Centrifuge WSR bei 200 xg für 5 min und entsorgen Sie das Medium.
      1. Resuspendieren 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> WSR in 1 ml Differenzierungsmedium. Zählen Sie die Zellen, und die Kultur der Zellen in geringer Distanz Petrischale mit einer Konzentration von 1 x 10 ⁵ Zellen / ml in Differenzierungsmedium bei 37 ° C für die ersten EB-Aggregation.
   5. Zwei Tage nach der EB Bildung, übertragen EVG vom Geschirr bis zu 50 ml Tuben. Spin bei 200 · g für 1 min. Entfernen Sie Medium und spülen EVG mit 10 ml DPBS ohne Ca ²⁺ und Mg ^2+.
   6. Saugen Sie DPBS und 1 ml 0,25% Trypsin. Bei 37 ° C für 5 min. Hinzufügen 4,5 ml Differenzierungsmedium, um die Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um EBs in einzelne Zellen zu trennen.
   7. Zentrifugiere die Zellen bei 200 g für 5 min. Absaugen Medium resuspendieren Zellen in 1 ml Differenzierungsmedium.
   8. Zählen Sie die Zellen und verdünnte 2 x 10 ⁶ Zellen in 1 x 10 ⁵ Zellen / ml in Differenzierungsmedium. Hinzufügen VEGF, Bmp4 und Activin A zu dem Medium in einer Endkonzentration von 5 ng / ml, 0,8 ng / ml und 5 ng / ml. Culture Zellen in Petrischale für die zweite EB Bildung bei 37 ° C.
   9. 40 Stunden nach der zweiten EB Bildung, übertragen EVG auf 50-ml-Röhrchen. Spülen mit DPBS einmal dissoziieren EBs mit 1 ml 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Pipette auf und ab, um EBs in einzelne Zellen zu trennen.
   10. Die Zellen in Stempro-34 Medium mit 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF und 12,5 ng / ml FGF10. Platte der Zellen bei 2 × 10 ⁵ / cm ² in Gelatine-beschichteten Platten. Kultur in 37 ° C Inkubator für etwa 32 Stunden vor dem CPC Isolation.
4. Isolieren mCPCs
   1. Absaugen Medium und spülen Sie mit DPBS. 0,5 ml 0,25% Trypsin zu Kulturplatten bei 37 ° C für 5 min. Hinzufügen 4,5 ml Differenzierungsmedium, um die Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um EBs in einzelne Zellen zu trennen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren und resuspendieren Zellen in 2% FBS / PBS für FACS-Reinigung.
   2. Führen undifferenzierten WSR am Sortierer als negative Kontrolle. Ändern Spannung nach vorne Scat einstellenter (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC), um die gewünschte Population auszuwählen. Verwenden Vorwärtsstreuung gegenüber Seitenstreuung und Vorwärtsstreuhöhe gegen die Breite, um Schmutz und Wams aus. In den ausgewählten Subpopulation, nach der Verteilung der ESC steuert, ziehe eine positive Gate-YFP auf Histogramm, um die Zellautofluoreszenz zu beseitigen. Sammeln YFP ⁺ CPCs aus YFP ⁺ Gating.
   3. Platte der gereinigten CPCs (YFP ⁺ Zellen) in 6-Well-Platten mit Differenzierungsmedium (1.3.1). Kultur weitere 3-5 Tage bei 37 ° C für die Differenzierung von CPC in Kardiomyozyten und SMCs.

2. Gewinnung menschlicher embryonaler CPCs von Menschen WSR

1. Bereiten Feeders
   1. Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Nährschicht wie oben bei einer Dichte von 2 x 10 ⁴ / cm ² beschrieben ist.
2. Pflegen menschlichen WSR
   1. Pflegen menschlichen ISL1: cre; pCAG-flox-AUS-flox-GFP oder RFP WSR routinemäßig auf MEF mit regulären hES Medium (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml basischen FGF). Vor der Herzdifferenzierung, übertragen menschliche WSR in Feeder-freien Zustand für mindestens 2 Passagen.
3. Bereiten menschlichen WSR in Einzug freien Zustand
   1. Bereiten beschichteten Platten für den menschlichen WSR Kultur.
      1. Auftauen Matrigel bei 4 ° C über Nacht. Setzen Sie einen 50-ml-Röhrchen auf Eis und 30 ml kaltem DMEM / F12-Medium in den Schlauch.
      2. 1 ml Matrigel in das kalte Medium und gut mischen. 1 ml kaltem Matrigel-DMEM / 12-Medium in eine Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen oder 5 ml in eine 10 cm-Schale.
      3. Lassen Platten / Geschirr bei 4 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 Std. Absaugen Medium vor der Verwendung.
   2. Split menschlichen WSR auf die Teller: absaugen Medien aus MEF Platte und spülen menschlichen WSR mit DPBS. Dann 1 ml Dispase (1 mg / ml) in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Inkubieren Zellen in 37 ° CInkubator, bis Ränder Kolonien beginnen zu lösen.
   3. Entfernen Dispase-Lösung. Spülen Sie mit DPBS zweimal, dann fügen Sie 2,5 ml / pro Vertiefung mTeSR Medium oder MEF-konditionierten Mediums auf die Platte.
   4. Kratzen Sie Zellen mit einem Zellschaber und sorgfältig pipettieren nach oben und unten, um die menschliche ESC Kolonien in kleine Klumpen zu brechen.
   5. Übertragen Sie die ESC-Klumpen und verdünnt 1: 3 in die beschichteten Platten.
   6. 2 ml / Vertiefung mTeSR Medium oder MEF-konditionierten Mediums und ändern Medium täglich.
   7. Kultur menschlichen WSR in mTeSR Medium oder MEF-konditionierten Mediums auf beschichteten Platten für mindestens 2 Passagen.
4. Induzieren CPC Differenzierung von humanen WSR
   1. Wenn Zellen sind ~ 90% konfluent, saugen das Medium und spülen Sie mit DPBS. Inkubieren der HES in 0,5 mg / ml Dispase bei 37 ° C für 20 min.
   2. Spülen Sie die hES mit DPBS zweimal Entfernen Zellen aus Platten mit einer Zellheber, dann resuspendieren Zellschellen in Differenzierungsmedium (DMEM / F12 mit 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mML-Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 50 ug / ml Ascorbinsäure).
   3. Übertragen Sie Zellen in 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatten für EB-Bildung.
   4. Ändern Sie am nächsten Tag Differenzierungsmedium.
   5. Ersetzen Medium alle 3 Tage und pflegen EVG in Suspensionskultur.
5. Isolieren HCPCS
   1. Sammeln EVG spätestens 9. Tag der Differenzierung der Menschen CPC Isolation.
   2. Absaugen Medium und spülen EVG mit DPBS zweimal. 0,5 ml 0,25% Trypsin in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatten bei 37 ° C für 5 min.
   3. Hinzufügen gleichen Volumen Differenzierungsmedium, um die Reaktion zu stoppen. Pipette auf und ab, um EBs in einzelne Zellen zu trennen. Sammle die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten und resuspendiere Zellen in 2% FBS / DPBS. Filterzellen mit 40 um Zellsieb und FACS-gereinigten RFP ⁺ CPC Zellen, wie in 1.4.3 beschrieben.
   4. Platte nach HCPCS auf geltin beschichteten Platten. Kultur HCPCS in Differenzierungsmedium für 7-9 Tage in Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen zu differenzieren. 7 Tage nach der Plattierung, die Kultur differenzierter Zellen mit 5% Knockout SR in DMEM / F12-Medium.

Ergebnisse

Das Protokoll zeigt Ableitung CPCs aus mehreren ES-Zelllinien. WSR werden aggregiert, um EBs bilden in CPCs zu unterscheiden. WSR werden routinemäßig auf MEF Feeder (1A, F) gehalten und Zuführungen vor Differenzierung entfernt. Nach Aggregation der WSR in EBs in Differenzierungsmedium (1B, G), werden die zweiten geformten EVGs Bmp4 und Activin A behandelt, um das Mesoderm Differenzierung in Zelllinien der Maus (1C) zu verbessern. WSR in Herzlinie differenziert wie fl...

Diskussion

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277