Vorteilhafte Reduzierte Droplet-Oberflächen-Wechselwirkung, um den Transport Bioanalyten in Digitale Mikrofluidik Optimieren

Zusammenfassung

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Zusammenfassung

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of “lab-on-a-chip” platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.

Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.

Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

Einleitung

Die Miniaturisierung von Vorrichtungen, die mit Flüssigkeiten arbeiten, ist von größter Bedeutung für die Entwicklung des "lab-on-a-chip" Plattformen. In dieser Richtung haben sich in den letzten zwei Jahrzehnten einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Mikrofluidik erlebt, mit einer Vielzahl von Anwendungen. ^1-5 Kontrast mit dem Transport von Flüssigkeit in geschlossenen Kanälen (Kanal Mikrofluidik), DMF manipuliert Tröpfchen auf Arrays von Elektroden. Einer der attraktivsten Vorzüge dieser Technik ist das Fehlen von beweglichen Teilen, um Flüssigkeiten zu transportieren, und die Bewegung wird sofort durch Ausschalten von elektrischen Signalen angehalten.

Jedoch ist Tröpfchenbewegung abhängig Tröpfchen Inhalt sicher eine unerwünschte Eigenschaft für ein universelles "lab-on-a-chip" Plattform. Tröpfchen, die Proteine ​​und andere Analyten bleibe Gerät Flächen, zu unbeweglich. Wohl hat sich diese für die Ausweitung der DMF-Anwendungen war die große Einschränkung; ^6-8Alternativen zu den unerwünschten Oberflächenverschmutzung zu minimieren beinhalten die Zugabe von zusätzlichen chemischen Spezies an das Tröpfchen oder seiner Umgebung, die möglicherweise Tröpfchengehalt beeinträchtigen könnten.

Früher entwickelte unsere Gruppe eine Vorrichtung, um den Transport von Zellen und Proteinen in DMF zu ermöglichen, ohne zusätzliche Additive (Field-DW-Geräte). ^9. Dies wurde durch Kombinieren einer Oberfläche, bezogen auf Kerze Ruß, ¹⁰ mit einer Vorrichtung, die Tröpfchengeometrie begünstigt erreicht Walz und führt zu einer nach oben gerichteten Kraft auf das Tröpfchen, weiter verringert Tröpfchenoberflächenwechselwirkung. In diesem Ansatz wird Tröpfchenbewegung mit Oberflächenbenetzung verbunden ist. ¹¹

Ziel des nachfolgend beschriebenen detaillierten Verfahrens ist es, eine Vorrichtung DMF transportieren kann Tröpfchen enthaltende Proteine, Zellen und ganzen Organismen zu erzeugen, ohne zusätzliche Additive. The Field-DW-Geräte ebnen den Weg für völlig gesteuerten Plattformen weitgehend unabhängig arbeiten von Tröpfchen Chemikerry.

Auch hier haben wir vorliegenden Simulationen zeigen, dass trotz der hohen Spannung zum Betrieb der Vorrichtung erforderlich ist, der Spannungsabfall über dem Tröpfchen ist ein kleiner Bruchteil der angelegten Spannung, was vernachlässigbare Auswirkungen auf Bioanalyten innerhalb des Tropfens. In der Tat, Vorversuche mit Caenorhabditis elegans (C. elegans), eine Nematode für eine Vielzahl von Studien in der Biologie verwendet, zeigen, dass Würmer schwimmen ungestört Spannungen angelegt werden.

Protokoll

Hinweis: In der unten beschriebenen Verfahren, muss Laboratoriumsrichtlinien befolgt werden. Von besonderer Bedeutung ist die Sicherheit beim Umgang mit Hochspannung (> 500 V) und den Umgang mit Chemikalien.

1. Beschichtung aus einem leitfähigen Substrat mit Kerzenruß

1. Cut Kupfermetall in Rechtecke (75 x 43 mm, 0,5 mm dick). Reinigen Sie jede Kupfersubstrat durch Eintauchen in Kupferätzmittel für etwa 30 sec, waschen mit Leitungswasser für ca. 20 sec, und trocken mit Papier.
   HINWEIS: Bei Verwendung von Methode 1 unten, ändern Sie die Abmessungen 75 x 25 mm in die Maschine passen.
2. Sweep eine beleuchtete Paraffinkerze unter dem Kupfersubstrat für 30-45 sec, um eine annähernd gleichmäßige Rußbeschichtung (ca. 40 & mgr; m dick) zu erhalten. Halten Sie das Substrat bei ~ 1 cm in der Flamme. Die fragile Rußoberfläche nicht berühren.

2. Schutz der Rußschicht mit Coating

HINWEIS: Die Rußschicht ist sehr zerbrechlichUnd müssen zum Schutz aufgetragen werden. Zwei einfache Alternativen (Methoden 1 und 2 unten) werden hier vorgeschlagen, aber robuster Protokolle sind derzeit in der Entwicklung.

1. Methode 1
   1. Laden Sie die Probe in den Metallverdampfer oder Sputter-System. Im Anschluss an die Betriebsverfahren des Systems, Kammer evakuieren, und starten Sie kontrollierte Abscheidung von Gold auf der Rußschicht (150-200 nm). Lassen Sie das Gerät abkühlen auf Raumtemperatur.
   2. Tauchbeschichtung der metallisierten Substrat in einem 1-Dodecanthiol Lösung (1% v / v in 95% igem Ethanol, ACS / USP-Qualität), für 10 min in einer chemischen Haube. Dann halten Sie das Gerät in einem Winkel von fast 60 °, vorsichtig waschen Sie die Oberfläche mit mehreren Tröpfchen von nur Ethanol. Lassen Sie die Geräte trocken, über Nacht.
2. Methode 2
   1. In einer chemischen Haube, unmittelbar nach der Beschichtung des Substrats mit Ruß und, während das Substrat noch warm vom Kerzenflamme, abzuscheiden einige Tröpfchen des fluorierten Flüssigkeit auf eine Seite desSubstrat und Kippen des Substrats in einem Winkel nahe 90 °. Zahlen Sie mehr Tröpfchen, und lassen Sie sie über die gesamte Ruß Oberfläche rollen.
      HINWEIS: Wenn das Tröpfchen auf einen Punkt fällt, wird Ruß weg von diesem Bereich ausgewaschen werden. Ließ die Tröpfchen des fluorierten flüssigen Ausbreitung so viel wie möglich.
   2. Bake Substrats auf einer heißen Platte (160 ° C für 15 min) in einer chemischen Haube.
   3. Lassen Sie das Substrat sitzen über Nacht bei Raumtemperatur vor der Verwendung. Bewahren Sie unbestimmte Zeit.

3. Herstellung von Deckelektroden (von Abdelgawad et al angepasst. ¹²⁾

1. Zeichnen mit Grafikdesign-Software, die Elektroden. Jede Elektrode ist 2 mm lang, 0,3 mm breit und der Abstand zwischen den Elektroden beträgt 0,3 mm. Der Spalt zwischen den Kontakten (in den Verbinder einrasten, siehe unten) ist 2,3 mm (Bild 1).
2. Trim ein flexibles Kupferlaminat (35 & mgr; m dick) in den Monarch-Format (3,87 x 7,5 Zoll). Verwenden Sie andere Größen if mit dem Drucker kompatibel. Laden Sie das Laminat in die manuelle Zuführung eines Farbdruckers.
3. Achten Sie darauf, "reichen schwarzen" oder "Registrierung black" zu verwenden, wenn Sie auf der Kupferblech (siehe Abdelgawad et al. ¹² für Details), um eine dichtere Schicht von schwarzer Tinte auf dem Kupfersubstrat zu ermöglichen, den Schutz der gedruckten Muster beim Ätzen . Lassen Sie das bedruckte Substrat vollständig trocknen, über Nacht.
4. Innerhalb einer chemischen Abzugshaube, erwärmen (40 ° C) ein Becherglas mit 50 ml Kupferätzmittel. Tauchen Sie die gedruckte Laminat im Becher, und schütteln Sie sie vorsichtig in die Lösung für ca. 10 min. Ätzzeit hängt von der Kupfer Ätzlösung. Alle paar Minuten, überprüfen Sie die Korrosion und sehen, ob das Muster intakt ist.
5. Das Laminat vorsichtig mit Wasser waschen, und die Beschichtung zu entfernen mit Aceton und Ethanol in der chemischen Kapuze. Einmal waschen und vorsichtig trocken das Laminat mit einem Papiertuch.
6. Vorsichtig legen die Laminat mit Elektroden an einen glass Schieber (75 x 25 mm, ca. 1 mm Dicke), mit doppelseitigem Klebeband. Vermeiden Sie Lufteinschlüsse.
7. Bringen Sie einen Film aus Perfluoralkoxy PFA um mit Klebeband den Elektroden. Dies dient dazu, um versehentlichen Kontakt der Elektroden mit dem Tröpfchen, verhindern die oberen Elektroden Schäden durch Kurzschluss.

4. Die elektronische Schnittstelle (Circuit in Figur 2)

1. Löten Sie die Relais und die Kondensatoren C zu einer universellen Platine.
2. Montieren Sie den Rest der 10 Relaistreiber auf einem Steckbrett für elektronische Schaltungen.
3. Drahteingang jedes Relais Fahrers auf einem Kanal in der Steuerplatine.
4. Vorsichtig lassen Sie die oberen Elektroden in einen Verbinder (Abbildung 3). Draht-Ausgang jedes Relais Fahrers zu einer oberen Elektrode, wie in der Figur gezeigt. Beachten Sie, dass es eine geerdete Steckerkontakt zwischen einem Paar von Drähten aus Relais, um elektrische Störungen zu minimieren.
   HINWEIS: Der Stecker sitzt auf einem einstellbaren Plattform zu kontrollieren ter Abstand (0,1 bis 0,5 mm) zwischen oben und unten (Ruß-beschichtet) Substrat.
5. Ein Programm verwenden, um die Zeitmessung für die Hochspannung (HV) Anwendung (etwa 0,8 s) bis 4-Elektroden zur gleichen Zeit zu steuern, Schaltelektrode 1 in der Bewegungsrichtung (dh für 0,8 sec betätigen, 1234, dann 2345 3456, etc. ., 0,8 s für jede Gruppe, und dann nach hinten, so dass Tröpfchen bewegt sich in die entgegengesetzte Richtung als auch).

5. Droplet Visualisierung und Handhabung

1. Um Tröpfchenbewegung aufzeichnen, verwenden Sie das Visualisierungssystem, das aus einem 24X zusammensetzt - 96X Vergrößerung Montage kombiniert mit einer CCD-Kamera. Schließen Sie den Videorecorder an die Kamera mit S-Video.
2. Pipettieren Sie 4 ul Tröpfchen enthält C. elegans in Medien auf den Boden des Ruß-beschichteten Substrat.
3. Bringen Sie die oberen Elektroden auf ~ 0,3 mm über der Tröpfchen. Das Tröpfchen sollte nahe der Mitte, direkt unterhalb des fünften Elektrode, die Bedienung zu erleichtern werden.
4. Schalten Sie die elektronische Schnittstelle und Hochspannung (500 V _RMS), und stellen Sie die obere Elektrode Abstand zur Tröpfchen bis es beginnt sich zu bewegen. Lassen Sie sich nicht die oberen Elektroden berühren Sie die Tropfen.
5. Sammeln von Daten durch Aufzeichnen der Anzahl der erfolgreichen Tröpfchentransfers auf dem Gerät als Reaktion auf elektrische Impulse. Ein erfolgreiches Experiment wird von mindestens 700 Tröpfchentransfers gekennzeichnet, dh ein Transfer nach jedem elektrischen Impuls.
6. Sammeln Daten kontinuierlich, bis die Tröpfchen nicht mehr als Antwort zu bewegen, um 5 bis 10 Pulsen.
   HINWEIS: Wenn die Oberfläche beginnt, sich zu verschlechtern, könnte Bewegung, indem die oberen Elektroden näher an der Tröpfchen wiederhergestellt werden.

Ergebnisse

Zuvor haben wir Feld DW Vorrichtungen verwendet, um die Bewegung von Proteinen in DMF zu ermöglichen. Insbesondere könnte Tröpfchen mit Rinderserumalbumin (BSA) in einer Konzentration 2.000 mal höher als zuvor berichtet auch von anderen Autoren (ohne Zusätze) bewegt werden. Dies war aufgrund der reduzierten Wechselwirkung zwischen Tropfen und Oberfläche; Figur 4 zeigt ein Tröpfchen enthaltenden fluoreszenzmarkierten BSA (siehe ⁹ für weitere Informationen zu den Experimenten Freire

Diskussion

Der wichtigste Schritt des Protokolls ist der Schutz der Rußschicht, direkt mit dem Erfolg beim Bewegen Tröpfchen verbunden. Metallisieren der Russschicht (Methode 1 oben) können nahezu 100% der Herstellungs Erfolg. Jedoch ist die maximale Betriebsdauer 10 min; möglicherweise werden Tröpfchen Fraktionen Benetzen der Ruß durch Löcher in der Metallschicht. Beschichten der Rußschicht mit dem fluorierten Flüssigkeit ist die einfachste und schnellste Alternative und erfordert minimalen Ressourcen, aber nur 40-50% de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4