Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Zusammenfassung

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Zusammenfassung

Zellen reagieren auf die Stimulation durch in einem Prozess namens Polarisation verlieren ihre runde Form, und durch Änderung der subzelluläre Lokalisierung vieler Proteine ​​Chemokin. Klassischen Bildgebungstechniken sind verwendet worden, um diese Phänomene zu untersuchen. Jedoch benötigt sie die manuelle Erfassung vieler Zellen gefolgt von zeitaufwendig Quantifizierung der Morphologie und die Co-Lokalisation der Färbung von zig Zellen. Hier wird ein schnelles und leistungsfähiges Verfahren beschrieben, um diese Phänomene zu Proben aus mehreren Tausenden von Zellen unter Verwendung eines Abbildungs ​​Durchflusszytometrie Technologie, die die Vorteile eines Mikroskops mit denen eines Zytometers kombiniert studieren. Verwendung von T-Lymphozyten mit CCL19 und Färbung für MHC Klasse I-Molekülen und filamentöses Aktin stimuliert wird eine Gating-Strategie dargestellt, um gleichzeitig die den Grad der Gestalt Änderungen und das Ausmaß der Co-Lokalisierung von Markern, die von CCL19 Signalisierung betroffen sind. Darüber hinaus konnten wir diese Gating-Strategie Observe die Trennung von filamentösen Aktin (vorne) und phosphoryliert Ezrin-Radixin-Moesin (Phospho-ERM) Proteine ​​(auf der Rückseite) im polarisierten T-Zellen nach CXCL12 Stimulation. Diese Technik war auch nützlich, um die blockierende Wirkung der Polarisation von zwei verschiedenen Elementen zu beachten: Hemmung der Aktin-Polymerisation von einem pharmakologischen Inhibitors und Expression von Mutanten des Par6 / atypische PKC Signalweg. Somit wird Beweise gezeigt, dass diese Technik ist nützlich, um sowohl morphologische Veränderungen und Protein Umverteilungen analysieren.

Einleitung

Chemokine sind kleine lösliche Proteine, die Zellen zu spezialisierten Standorten ¹ gewinnen. Daher nehmen sie an der korrekten Positionierung von Zellen in Geweben, eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung und Physiologie. Das Immunsystem ist keine Ausnahme von dieser Regel, wie es auf die Einwirkung von vielen verschiedenen Zelltypen, die in einem Strang, um eine wirksame Immunantwort beruht. Durch die Steuerung der spezifischen Position eines Immunzelltyps in einem bestimmten Zustand sind Chemokine vorge erforderlich, bevor Fremdantigene erkannt und neutralisiert werden.

In T-Lymphozyten, insbesondere Chemokine binden an spezifische Oberflächenrezeptoren, die bei Eingriff, entlocken viele intrazelluläre Signale (Calcium-Anstieg, ERK Phosphorylierung, Rho-GTPasen Aktivierung Anstieg der Integrine Affinität und Zytoskelett-Änderungen), die T-Zell-Motilität ^2,3 begünstigen. Auf zellulärer Ebene kann eine morphologische Veränderungen bei Chemokin Stimulation ausgelöst beobachten.Diese Veränderungen in der Zellformen sind besonders dramatisch in T-Zellen: ruhende T-Zellen bei Reisen in den Blutstrom über eine wulstartige runde Morphologie. Jedoch ist die Erfassung der Gegenwart von Chemokinen an Entzündungsstellen oder zumin Nähe Lymphorganen gehen, um die Form von T-Zellen, die nun eine typische "hand-Spiegel" Morphologie, bestehend aus einer bipolaren Form annehmen ändern: eine führende Kante an der Vorderseite und eine Hinterkante oder Uropod, an der Rückseite ^4. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Komponenten in diesen zwei gegenüberliegenden Bereichen eines polarisierten T-Zelle zu trennen, um die Migration zu erhalten. Beispielsweise Aktinfilamente Polymerisation steigt auf Chemokin Stimulation ⁵ und polymerisierten Actin reichert sich an der Vorderseite eines polarisierten T-Zelle ^2. Auf der anderen Seite, mehrere Proteine, wie phosphorylierte Proteine ​​der Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) -Familie, die Plasmamembran zu der kortikalen F-Aktin zu verbinden, erneut lokalisiert am Uropod polarisierterT-Zellen ^6. Interessanterweise haben wir und andere zeigen, dass diese Polarisierung Prozess wird für T-Zell-Migration erforderlich. Tatsächlich wird jede Behandlung, die mit Polarisations stört zellulären Motilität zu hemmen. Zum Beispiel die Hemmung der Aktivität der Mitglieder der atypischer Proteinkinasen C (PKC) Familie PKCζ und PKCι Blöcke T Zellpolarisation und deren Migrationsscanprozess der dendritischen Zellen ^7. T-Zell-Polarisation auch von Rho-GTPasen geregelt. Wir haben gezeigt, dass die Modulation des RhoL Aktivität durch den kürzlich beschriebenen Fam65b Protein interferiert mit T-Zell-Veränderungen in der Morphologie und ihrer Fähigkeit, in einem Transwell-Assay ⁶ migrieren. Als Polarisations Voraussetzung Schritt zelluläre Motilität ist es daher von entscheidender Bedeutung, um es als eine Haupt Auslesen Chemokin Reaktionen zu quantifizieren. Zellform Veränderungen wurden bisher manuell ⁸ gemessen. Allerdings ist diese Art der Quantifizierung sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur wenigeZehn Zellen berücksichtigt.

Hier wird ein neues Verfahren vorgestellt, um schnell quantifiziert den Grad der Formänderungen von T-Lymphozyten auf die Stimulation Chemokin ausgesetzt. Eine Abbildungs ​​Durchflusszytometrie-Technologie (siehe Tabelle Spezifische Reagenzien / Equipment) verwendet wird, der die Vorteile eines Durchflusszytometers und ein Mikroskop ⁹ kombiniert, um die Menge des polarisierten Zellen unter verschiedenen Bedingungen von Chemokin Stimulation effizient zu quantifizieren. Zusätzlich zur Quantifizierung der morphologischen Veränderungen, die eine robuste Konstruktion mit dieser Technik gemessen werden kann, ist es auch möglich, Veränderungen der subzellulären Lokalisation von einigen Proteinen bei Chemokinsignalisierung bewerten.

Protokoll

1. Herstellung von T-Lymphozyten

1. Bereiten primären Maus oder humanen T-Zellen wie beschrieben ^10,11.
2. Kultivieren humaner T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% Humanserum AB in einer Dichte von 2 - 3 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   HINWEIS: Die Verwendung von fötalem Kälberserum (FCS) anstelle von Humanserum kann spontane Polarisation von einem großen Teil der menschlichen T-Zellen in der Kultur hervorruft. Bewahren Sie diese Zellen in Kultur für 4-5 Tage und weiter zu verarbeiten, diese jederzeit während dieser Periode.
3. Pflegen Maus-T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% FCS ergänzt war, bei einer ähnlichen Zelldichte. Sofort verwenden oder am nächsten Tag, nach einer O / N-Kultur bei 37 ° C in Gegenwart von 10 ng / ml IL7.
4. Kultivieren der CEM menschlichen T-Zelllinie in komplettem RPMI, ergänzt mit 10% FCS.

2. Chemokine Stimulation

1. Waschen 5 x 10 ⁵ Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS Medium mit 10 mM Hepe ergänzts. Für einige Experimente, Co-Transfektion von primären humanen T-Zellen am Tag zuvor mit 2 pg pmaxGFP und 8 ug pcDNA3.1 ⁺ (Leervektor, Kontrolle), PKCζ Kinase tot, oder N-terminalen Par6 Plasmide.
2. Zellpellet in warmem HBSS-HEPES-Medium (0,3 ml verwenden x Anzahl der Versuchsbedingungen).
3. Verteilen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Daher wird ein Rohr entsprechend einer einzelnen experimentellen Bedingung 5 x 10 ⁵ Zellen in 0,3 ml HBSS-HEPES Medium enthalten. Für einige Experimente, 500 nM Latrunculin A oder Vehikel (DMSO) und inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten vor dem Chemokin-Stimulation.
4. Hinzufügen 10 bis 500 ng / ml CCL19 oder CXCL12 Chemokin in jedes Röhrchen.
   HINWEIS: Wir verwenden normalerweise 10 bis 200 ng / ml Chemokin für den menschlichen T-Zellen. CEM-Zellen exprimieren keine CCR7 Rezeptor, CCL19 bindet. Daher wird CEM-Zellen nur dann in einem CXCL12 Stimulation reagieren. Darüber hinaus verwenden höheren Chemokin-Konzentrationen (300-500 ng / ml) zu polarisieren, Maus-T-Zellen.
5. Mehrmals drehen Sie die Rohre und inkubieren sie in einem 37 ° C Wasserbad für 8 oder 10 Minuten für die primäre T-Zellen oder CEM auf.
6. Stoppen des Polarisationsprozesses durch Zugabe zu jedem Röhrchen 0,3 ml einer warmen Lösung, die 2% Paraformaldehyd (PFA) und 10 mM Hepes in PBS. Drehen Sie die Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C für 5 min.

3. Färbungen

1. Übertragen Sie die Zellen aus den Mikrozentrifugenröhrchen auf Zytometrie Rohre fließen.
2. Vollständig zu füllen die Rohre mit einer RT-Lösung, die 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes in PBS.
3. Zentrifugiere die Röhrchen bei 460 × g für 4 min.
4. Den Überstand verwerfen und die Zellen werden in 100 ul einer RT-Lösung, enthaltend 5% FCS in PBS.
5. Mit 5 & mgr; l FITC-anti-HLA-ABC in jeder Röhre, Wirbel ihnen und inkubieren für 30 min bei RT, entfernt von Licht.
6. Wash-Zellen einmal mit PBS, enthaltend 5% FCS, einnd einmal mit nur PBS.
7. Bei RT: add 500 ul 1% PFA, Inkubation für 10 min, dann waschen Sie die Zellen mit einer Lösung, die 1% BSA, 0,5 mM EDTA und 10 mM HEPES in PBS.
8. Überstand verwerfen, vollständig zu füllen die Röhrchen mit einer Lösung von PBS, die 0,2% BSA, 0,1% Saponin, 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes (Permeabilisierung Puffer).
9. Waschen Sie die Zellen zweimal in diesem Medium.
10. Drehen Sie die Rohre, um das Medium zu entfernen und vortexen sie das Zellpellet zu distanzieren.
11. Zugabe von 0,25 & mgr; g / ml TRITC-Phalloidin und / oder eine 1: 100-Verdünnung von Anti-P-ERM-Antikörper zu jedem Röhrchen, Wirbel zu und inkubiere für 30 min bei RT.
12. Wash-Zellen mit der Permeabilisierung Puffer. Inkubieren mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, falls erforderlich.
13. Die Zellen in 200 ul PBS und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen.
    Hinweis: Zellen sind bereit für die Übernahme. Alternativ, während eine maximale Gesamtmenge von 200 ul pro Röhrchen, konzentriertes PFA auf einen endgültigen 1%Konzentration, um die Färbungen zu erhalten, wenn die Zellen nicht am selben Tag für die weitere Verarbeitung verwendet werden.

4. Bilder Erfassung und -analyse

1. Schalten Sie das Gerät (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Equipment) und lassen Sie es sich selbst zu kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Die INSPIRE-Software wurde mit einem 40X-Objektiv (0,75 NA) verwendet. Der IDEAS 3.0-Software wurde für alle berichteten Quantifizierungen verwendet.
2. Bereiten Sie eine Reihe von Akquisitionsfenster, die in einer Vorlage für zukünftige Experimente gespeichert werden können. Zeichne Histogramme, die die RMS Gradientenwerte zu quantifizieren. Von der "In Focus" Bevölkerung, auf die RMS Gradientenhistogramm ausgewählt, die Abgrenzung der "Einzelzelle" Bevölkerung in einem Histogramm der Umgebung. Sobald der Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingelegt worden ist, stellen Sie die Laserleistung, Tor auf einzelne Zellen und erwerben 5.000 T-Lymphozyten.
3. In der Idee Weichware, öffnen Sie den Erwerb Datei und erstellen Sie ein Histogramm, das den Wert des Gradienten RMS-Wert für Hellfeld-Bilder zeigen wird (Kanal 1) für jede einzelne Zelle erhalten. Zeichnen Sie ein Tor auf der RMS Gradientenhistogramm, die Zellen, die RMS Gradientenwert oberhalb 57 hält.
   HINWEIS: Der RMS-Gradienten ermöglicht unter Berücksichtigung der Analyse nur die T-Lymphozyten, die in der Brennebene sind. Wir haben empirisch festgestellt, dass die einzelnen Zellen eine RMS Gradientenwert überlegen 57 zeigen, sind in der Brennebene, und kann genau berücksichtigt werden.
4. In der Analyse / Masken-Menü erstellen Sie eine neue Maske, genannt Erodieren (M01,2) von der Morphologie Maske auf den Hell Bilder M01, von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü ein neues Merkmal der Umgebung, auf dem Erodieren (M01,2) Maske errechnet. Aus den im vorigen Tor ausgewählten Zellen, öffnen Sie ein Histogramm, das die Umgebung der Zellen mit dieser neu geschaffenen Maske.
   HINWEIS: Die Morphologie Masken, die von verfügbarenStandard sind viel größer als die tatsächliche Größe der Zelle. Somit ist es genauer, sie zu erodieren bis zu 2 Pixel.
5. Zeichnen Sie ein Tor zu den einzelnen T-Zellen, ohne den Kalibrierungsperlen und Schmutz (kleine Fläche) und die Dubletten (Großraum). Passen Sie dieses Tor bei jedem Erwerb.
   HINWEIS: Variationen in der Zellgröße wird die Position des Tors beeinflussen. Als Maus-T-Zellen sind kleiner als menschliche T-Zellen, die ihrerseits kleiner als CEM-Zellen sind, wird die Fläche eines jeden Zelltyps proportional zu seiner Größe sein.
6. Unter Berücksichtigung der einzelnen, fokussierten Zellen, die bei den vorherigen Schritten gated wurden Öffnen ein Punkt-Diagramm, bestehend aus der Rohmaterial Max Pixel auf dem HLA-ABC-Färbung (Kanal 2, x-Achse) als Funktion des Raw Max Pixel auf Phalloidin Färbung (Kanal 4, y-Achse). Erstellen Sie ein Tor, um die ungefärbten oder gesättigten fluoreszierende Veranstaltungen auszuschließen. Öffnen Sie zwei Histogramme, die die Raw Max Pixel für HLA-ABC (Kanal 2) und Phalloidin (Channel 4) Färbungen.
7. In der Analyse / Masken-Menü createa neue Maske, genannt Erodieren (M02,2) von der Morphologie Maske der HLA-ABC gefärbten Zellen (Kanal 2), von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü, erstellen Sie eine neue Funktion, die aus dem Kreisformparameter, auf dem Erodieren (M02,2) berechnet.
   Hinweis: Dieser Parameter misst die Abweichung der Zellform von einem Kreis. Daher wird eine perfekt runde T-Zellen eine hohe Rund Wert während verlängert polarisierten Zellen eine niedrige Kreis Index aufweisen müssen.
8. Anschließend erstellen Sie ein anderes Histogramm, das die Werte der Kreisformmerkmal von den zuvor geschlossenen Zellen berichten. Verwenden dieses Histogramm unmittelbar plotten die Verteilung eines einzelnen, fokussierten Zellpopulation gemäß dem Wert der Kreisförmigkeit für jede einzelne Zelle.
9. Mit Blick auf die Form des Histogramms für Nicht-stimulierte Zellen, zeichnen ein Gate zum polarisierten Zellen, beginnend mit der untersten Kreis Wert bis zum Rund Grenzwert, wo die meisten der nicht-stimulierten Zellenaufgetragen. Sehen Sie in der Statistikanzeige für den Prozentsatz der polarisierten Zellen unter den Wohnbevölkerung (% Gated).
   HINWEIS: Wir haben dieses Tor für Kreisformindexwerte unter 13 eingestellt.
10. Um bei der Polarisation des Actin-Färbung in den Zellen aus, zeichnet eine Histogramm für die Hell-Detail Ähnlichkeit R3 Wert, Vergleichen des HLA-ABC-Färbung (Kanal 2) und der Phalloidin-Färbung (Kanal 4).
    HINWEIS: Je größer der Wert dieser Funktion ist, desto mehr überlagert die beiden Färbungen sind.
11. Unter Verwendung der gleichen Strategie wie zuvor Gating plotten ein Gate an den nicht-stimulierten Zellen für die gesonderte Färbung, die den Prozentsatz an Zellen mit polarisiertem Aktinfärbung zeigt.
12. Nach Beendigung werden der Prozentsatz von Zellen, die eine Entmischung in der Verteilung der MHC-Klasse-I und Phalloidin-Färbungen wurde die prozentuale polarisierter Zellen zusammen mit den Mittelwerten der Kreisförmigkeit und Ähnlichkeit Indizes aller Zellen ± SD im entspr gezeigtenonding Statistiken Panels.

Ergebnisse

Die erste hier gewählten Beispiel betrifft die Verwendung von humanen primären T-Lymphozyten mit CCL19 stimuliert. Jedoch kann die gleiche Strategie mit primären Maus-T-Zellen, T-Zelllinien oder andere Zelltypen, die auf Chemokin Stimulation verwendet werden. Die Gating-Strategie hier vorgestellten eine Reihe von Fenstern, die die fokussierten Veranstaltungen, dann die einzelnen Zellen auszuwählen. MHC-Klasse-I-HLA-ABC und polymerem Aktin zur Anlage (Figur 1) oder CCL19-stimulierte (Abbildun...

Diskussion

Mit einem letzten Technologie der Bildgebung Durchflusszytometrie, eine schnelle und informative Gating-Strategie zur zellulären und molekularen Ereignisse, die von Chemokin-Stimulation induziert Analyse wird vorgestellt. Die Veränderungen der Zellmorphologie von Chemokin-Stimulation und die subzelluläre Verteilung von verschiedenen Proteinen während des Polarisationsvorganges hervorgerufen: Von einem einzigen Experiment kann man zwei Arten von Informationen zu erhalten. Interessanterweise wird die Beweis auch die M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis