Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Zusammenfassung

Durch die drastische und negative Zusammenhang zwischen Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, Forschung über die Rolle Fettgewebe spielt in Krankheit und die allgemeine Gesundheit gerechtfertigt ist. Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Entfernung von Fettgewebe Depots ermöglicht die Untersuchung von Fettgewebe unter Verwendung von in situ und in vitro-Verfahren.

Zusammenfassung

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Einleitung

Adipöse einen bemerkenswerten Auftritt im Scheinwerferlicht der Medien, durch dramatische Zunahme Adipositas ist in den letzten Jahrzehnten des 20. Jahrhunderts. Übergewicht wirkt sich auf derzeit mehr als ein Drittel der Erwachsenen und 17% der Kinder und Jugendlichen in den Vereinigten Staaten (US) ^1. Quer durch alle ethnischen Gruppen hat statistische Untersuchungen rund um die Adipositas-Epidemie gezeigt, dass nicht-hispanischen Schwarzen haben die höchste altersbereinigte Rate von Übergewicht (49,5%) im Vergleich zu Mexico-Amerikaner (40,4%) aller Hispanics (39,1%), und nicht- hispanischen Weißen (34,3%) ^2. Die wirtschaftlichen Auswirkungen von Übergewicht ist auch ein wachsendes Interesse für das Gesundheitssystem. Im Jahr 2012 wurde geschätzt, dass die jährlichen medizinischen Kosten für die Betreuung von Fettleibigkeit in den USA im Jahr 2005 190.200.000.000 $, fast 21% der gesamten medizinischen Ausgaben Budget. Leider wurde die Fettleibigkeit bei Kindern geschätzt 14 Milliarden Dollar im direkten medizinischen Kosten allein verantwortlich zu sein. Statistisch gesehen, war es, dass die durchschnittliche medizinische Kosten ermitteltPersonen mit Übergewicht war 2741 $ pro Jahr höher als die ohne diese Morbidität ^3-5.

Übergewicht ist ein wichtiger Risikofaktor für eine Vielzahl von Erkrankungen wie: Typ 2-Diabetes, Fettstoffwechselstörungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Muskel-Skelett-Erkrankungen und chronischen Entzündungen. Adipositas ist tief mit der Pathogenese von metabolischen Syndrom und anderen chronischen Erkrankungen ^6-8 gebunden. Mit solch drastische und negative Zusammenhänge zwischen Adipositas und anderen Begleiterkrankungen, hat die wissenschaftliche Forschung konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf die aktuelle Epidemie und die vielfältigen und eine entscheidende Rolle gespielt von Fettgewebe besser zu verstehen.

Historisch wurde Fettgewebe als belanglos und wurde nur als eine einfache Befüllung Gewebe angesehen. Derzeit Fettgewebe wurde gezeigt, dass viele wichtige Rollen in der Körper die Funktion spielen: Stoffwechsel, Hormonhaushalt, Entzündungen, Schutz und Isolierung ^9. Fettgewebe ist in erster Linie ausAdipocyten enthält aber auch Perizyten, Endothelzellen, Monozyten, Makrophagen und pluripotenten Stammzellen ^8. Fettgewebe wird durch den Körper in unterschiedlichen Depots verteilt. Die Hauptdepots können subdermal gefunden werden, subkutan, intramuskulär und viscerally ^10. Adipose Depots gezeigt worden, Depot spezifische Stoffprofile, die eine Depot spezifische Anfälligkeit für Fettleibigkeit gezeigt und verwandten Störungen ⁸ haben.

Traditionell wurde Fettgewebe in zwei Haupttypen klassifiziert: weißes Fettgewebe (WAT) und braunem Fettgewebe (BAT); obwohl neuere Literatur zeigt die Präsenz einer dritten Gruppe getauft brite oder beige Fettgewebe ^11. Fettgewebe ist gezeigt worden, um verschiedene Farben zu Morphologien, die Stoffwechselfunktionen, biochemischen Eigenschaften und die genetische Expressionsmuster ¹⁰ aufweisen. Adipozyten in WAT ein einziges, großes Fetttröpfchen und variable Mengen von Mitochondrien. WATdominant im subkutanen und viszeralen Ortschaften des Körpers gefunden. WAT wirkt in erster Linie als Ort der Energiespeicherung und Organprotektion. Adipozyten in BAT eine multilokuläre Morphologie und reichlich Mitochondrien. BAT ist in erster Linie in den Hals und großen Blutgefäße des Thorax, sowie die Schulterblätter ¹² angeordnet. BAT vor allem Funktionen in energie aufwendet Verhaltensweisen, die Thermogenese ⁷ regulieren. Brite oder beige Fettgewebe wurde gezeigt, dass eine analoge Morphologie und Expression BAT teilen, aber hat sich herausgestellt, von weißen Fettzellen ¹¹ entstanden ist.

Die beschriebene Operationsmethode in diesem Manuskript bietet Forschern mit der Fähigkeit, verschiedene Effekte, dass Faktoren wie zu analysieren: Umwelt, Pharmazie und Genetik, haben am Fettgewebe; sowie die vorteilhafte oder nachteilige Rolle spielt in adipose Erkrankungen und allgemeine Gesundheit. Auch bietet eine Möglichkeit zur Identifizierung und Isolierung verschiedener Arten von Fettgewebeermöglichen ein besseres Verständnis der biochemischen Zusammenhänge und Unterschiede zwischen Depots. Dies kann bei der Bestimmung der Beziehung zwischen der Lage, die Funktion und Arten von Fett im Körper zu unterstützen. Das beschriebene Verfahren erreicht dies, indem sie die Einrichtung zum Brutto Visualisierung, Genexpressionsanalyse, Analyse der Proteinexpression, die histologische Untersuchung und Isolierung von primären Zelllinien für die in vitro-Studien. Momentan gibt es viele Artikel, die einen Einblick in die metabolischen Verhalten verschiedener adipose Depots sowie ihre anatomischen Orten bereitzustellen; aber nicht bieten eine gründliche Methode, wie man gezielt zu lokalisieren, identifizieren und isolieren diese Depots. Dieses chirurgische Verfahren liefert eine genaue Technik, die für die Isolierung von mehreren Depots mit einer minimalen Menge an Präparation und Verunreinigungen im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolat von einem oder zwei Depots ^13-14 gestaltet ermöglicht.

Das Ziel des Protokolls ist es,ein präzises Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von verschiedenen Arten von Fettdepots von mehreren anatomischen Stellen.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of Cincinnati und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung durchgeführt . 85-23, Revised 1996).

1. Euthanize und Sterilisieren der Maus

1. Platzieren Sie die Maus in eine Dropbox gemacht, die einen supratheraputic Dosis von Isofluran und lassen Sie den Effekt zu inhalieren. Sobald die Maus getötet, aus dem Feld zu entfernen.
2. Zervikal als ein zweites Mittel der Euthanasie verrücken.
3. Sterilisieren der Außenfläche der Maus durch Reinigen des Tieres mit 70% Ethanol.

2. Identifizierung und Isolierung von drei verschiedenen Fettgewebedepots

1. Braunes Fettgewebe (BAT) Isolation:
   1. Stellen Sie sicher, das Fell nass vom Alkohol Reinigung in Durchschneiden der epidermale und dermale laye Hilfers.
   2. Bewegen Sie die Maus in Rückenlage mit dem Rücken gegen den Tisch.
   3. Besorgen Sie sich die Haut direkt unterhalb der Membran mit einer Pinzette, Aufzug und mit einer Schere einschneiden.
   4. Schneiden in Querrichtung um den Umfang der Maus, um das Peritoneum aussetzen.
   5. Zeigen die schmetterlingsförmige BAT Depot von degloving die obere Hälfte der Maus. Die unteren Fortsätzen und Bauch in einer Hand und ziehen Sie die Haut bis zum Kopf.
   6. Richten Sie die Maus, so dass es anfällig auf dem Tisch positioniert ist. Achten Sie darauf, um die freiliegende Depot mit Haar verunreinigen.
   7. Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe.
   8. Suchen Sie die Schulterblätter und entsprechende Depot. Entfernen Sie vorsichtig jede oberflächliche weiße Fettgewebe oben auf dem Schmetterling und sezieren den Schmetterling von interskapulären braune Fett. Seien Sie vorsichtig, um den Muskel eng mit der braune Fett assoziiert zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop wird zur Entfernung des w empfohlenhite Fettgewebe sowie bei der Trennung von dem braunen Fettgewebe von den Schulterblättern.
   9. Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zu einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   10. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
2. Isolierung von Unterhautfettgewebe (SQ), einem weißen Fettgewebe Depot (WAT):
   1. Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots.
   2. Zeigen die Leisten, dreieckig SQ Depots de Behandschuhung die untere Hälfte der Maus. Halten Sie die oberen Fortsätzen und Thorax in einer Hand und ziehen Sie die Haut nach unten in Richtung der Füße mit der anderen Hand.
   3. Richten Sie die Maus in Rückenlage, während man aufpassen, nicht, um den belichteten Depot mit Haar verunreinigen.
   4. Saubere surgical Instrumente und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe.
   5. Sorgfältig sezieren die Dreiecke der SQ Fett. Achten Sie darauf, die Probe mit Muskel verschmutzen, benachbarte Fett, Milchdrüsen oder indem alle Gefäße und verunreinigen die Probe mit Blut.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Dissektionsmikroskop empfiehlt sich, wenn die Grenzen sind nicht klar definiert.
   6. Entfernen Sie Fettdepots und Transfer zum 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   7. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern.
   8. Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
3. Isolierung von Keimdrüsenfett eine viszerale Fettgewebe (VAT) und weißen Fettgewebe (WAT) Depot:
   1. Setzen Sie auf ein frisches Paar Handschuhe, um nicht kreuzkontaminieren zwischen Fettdepots.
   2. Mit Scissors, schneiden Sie das Bauchfell in Querrichtung, direkt unterhalb des Zwerchfells. Schneiden Sie das Bauchfell von der Membran auf den Mastdarm Mitte koronal Bauchorgane aussetzen.
   3. Suchen Sie die Hoden oder Eierstöcke und identifizieren die angebracht weißen Fettgewebe, wie die Nebenhoden Fettgewebe bei Männern oder Gonaden Fettgewebe bei Frauen bekannt.
   4. Saubere chirurgischen Instrumenten und Wechsel zu einem neuen Paar Handschuhe
   5. Sorgfältig sezieren sowohl Nebenhodenfettdepots aus dem Hoden, Nebenhoden und Samenleiter. Oder wenn weiblich, sorgfältig sezieren beide Gonaden Fettpolster aus den Eierstöcken.
   6. Entfernen Sie Fettdepots und sie auf 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   7. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern.
   8. Zur Färbung, fix oder in OCT eingebettet werden. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.

3. Isolierung Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt)

1. Die Isolierung des Herzens:
   1. Legen Sie die Maus in Rückenlage mit oberen und unteren Fortsätze nach außen erweitert.
   2. Sichere Anhängsel mit chirurgischen Band.
   3. Nach dem Positionieren der Maus wie oben aufgeführt, zu schaffen Spannung durch Anheben des Schwertfortsatz mit einer Pinzette. Horizontal geschnitten durch die Membran, Aussetzen der untere Teil der Brusthöhle.
   4. Gute Spannungsstabilität, durch Anheben des Schwertfortsatz, schneiden durch den Brustkorb superior in Richtung des Kopfes, nur an der Seite des Brustbeins.
   5. Nehmen Sie den Brustkorb nur schlechter als die Schlüsselbein und schnitt entlang der unteren Länge des Schlüsselbeins heraus in Richtung der Achselhöhle in beide Richtungen. Die Brusthöhle und sein Inhalt (Herz, Lunge, etc.) sollte nun deutlich sichtbar sein.
   6. Reinigen Sie die Brusthöhle von fremden Blut und Flüssigkeit durch den Gebrauch steriler gauze um die Flüssigkeit zu absorbieren. Wenn das Sammeln Organen oder Gefäßen achten Sie darauf, profuse (zusätzliche Informationen).
   7. Sobald der Bereich des Fluid gelöscht, schneiden die Bronchien und Anbringen Gefäßen, um die Lungen zu entfernen, so dass eine bessere Belichtung des Herzens.
2. Lokalisierung und Exzision Aortic Perivaskuläre Fettgewebe (PVAt):
   1. Entfernen Sie die folgenden Organe besser zu identifizieren, die dem unteren Bereich der Hauptschlagader: Leber, Magen, Milz, Pankreas, Darm und Dickdarm.
   2. Starten Sie zunächst mit der Identifizierung des Magens und der Speiseröhre. Schneiden Sie die Speiseröhre in den Magen-und Speiseröhrenkrebs Kreuzung, um den Magen aus dem Körper zu befreien.
   3. Als nächstes identifiziert den Darm und die umliegende Gekröse. Schneiden Sie oberflächlich durch Gekröse, da es sehr eng mit dem Nieren Teil der Aorta liegt, dann "führen Sie den Darm."
   4. Schneiden Sie den Doppelpunkt zu befreien so nah an den Mastdarm wie möglich. Somit befreit den Magen, Darm und Dickdarm von der Maus.
   5. Rebewegen Sie den Magen, Darm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse und Milz durch Schneiden durch die Befestigungs Gekröse und Gefäße. Die Bauchspeicheldrüse und Milz sollte mit dem Magen, Darm und Dickdarm Tarif.
   6. Entfernen Sie die Leber durch Schneiden durch die Lebervenen und Anbringen Gekröse, entfernen Sie alle Lappen.
   7. Schneiden Sie die viszerale Fettschicht und umgeben die Nieren. Lassen Sie die Nieren in die Aorta in vivo angebracht ist, als geografische Marker für verschiedene Segmente der Aorta zu dienen.
   8. Spülen Sie den Bereich mit sterilen 1x PBS und entfernen Sie alle Flüssigkeit durch Absorption mit steriler Gaze.
   9. Mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzette, trennen Sie die Hauptschlagader von seinem Rücken-an der Wirbelsäule und ihrer ventralen Befestigung an der Speiseröhre.
   10. Isolieren Sie die Aorta, indem Sie und Lösen der Aorta die Länge der absteigenden Aorta vom Ursprung im Herzen zur Bifurkation in der Leistengegend.
   11. Identifizieren und zu isolieren, die Schlüsselbeingefäßen. Trennen Sie diese Gerätevom Hals bis der Aortenwurzel, besser setzen die Aorten-Kreuzung und Wurzel im Herzen.
   12. Entfernen Sie den Thymus dann schneiden die Truncus brachiocephalicus, die linke Halsschlagader und der linken Schlüsselbeinarterie, die eine Bewegung des Herzens.
   13. Mit der Unterstützung von einem Dissektionsmikroskop, zeigen Sie die perivaskulären Fettgewebe (PVAt) Schicht rund um die Aorta.
   14. Unter besonderer Berücksichtigung der nicht kneifen oder drücken Sie die PVAt, ziehen Sie den PVAt Weg aus der Aorta mit Mikro-Pinzette. Geschnitten sanft die Befestigung des PVAt zur Aorta mit Mikroscheren ab thorakalen Bereich genau oberhalb denen die Membran angeordnet ist.
       HINWEIS: Ein Dissektionsmikroskop empfohlen.
   15. Wiederholen Sie diesen Vorgang über die gesamte Länge der Aorta, und endet bei der infrarenalen Region, die sich nur überlegen die iliakalen Bifurkation der Aorta Gefäß.
   16. Wenn Aortenbogen PVAt gewünscht wird, verwendet die gleiche Methode, um die PVAt vom wenigen c entfernenurvature des Bogens.
   17. Platzieren PVAt Proben in 2 ml Mikrozentrifugenrohr (en).
   18. Wenn RNA oder Protein extrahiert werden soll, gefrier des Gewebes durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Frieren Sie die Probe auf einmal, um den Abbau zu verhindern. Wenn die Kultivierung, decken Sie die Gewebe in DMEF-12 und auf Eis gesetzt, bis alle Proben werden für die Kultur (ergänzende Informationen) gesammelt.
       HINWEIS: Weitere Fettgewebe Depots bei Interesse an einer umfassenden Fettgewebe Depotanalyse berücksichtigen: retroperitoneal, mesenterialen, omentalis, Herzbeutel und Kniekehle.

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Ergebnisse

Identifizierung und Lokalisierung von Leisten subkutane Fettgewebe, interskapulären braunen Fettgewebe, viszerale Fettgewebe Nebenhoden (Abbildung 1) sowie den Aortenbogen perivaskulären Fettgewebe, thorakalen Aorta Fettgewebe, Neben Aorta Fettgewebe und der infrarenalen Fettgewebe (Abbildung 2) wurde erfolgreich mit Hilfe erreicht die beschriebene Operationsmethode. Die histologische Untersuchung und Differenzierung zwischen BAT und WAT Proben wurden positiv mit Hämatoxylin und Eosi...

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Diskussion

Übergewicht kann zu einer großen Vielzahl von Begleiterkrankungen und dem vollen Verständnis der Rolle, die adipöse spielt ist nicht vollständig geklärt führen; daher die weitere Forschung auf dem Gebiet der adipösen notwendig. Tiermodelle, insbesondere murine Modelle sind ideal für Vorlaufforschung in der Progression von Krankheiten und das Testen von potentiellen pharmazeutischen Behandlungen. Bei der Verwendung dieser Modelle ist eine genaue Trennung und Entfernung von Fettgewebedepots ein äußerst wichtige...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
DMEF-12	Sigma Aldrich	D-6421	Warm in waterbath before putting on tissue.
2 ml Microcentrifuge tubes	Midsci	MCT-200-C-S
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK