Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Zusammenfassung

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Zusammenfassung

Rot / Nahinfrarotlicht Therapie (R / NIR-LT) durch Laser- oder Leuchtdiode (LED) geliefert werden, verbessert funktionellen und morphologischen Ergebnisse in einem Bereich des zentralen Nervensystems Verletzungen in vivo, ggf. durch Reduzierung von oxidativem Stress. Jedoch Wirkungen von R / NIR-LT auf oxidativen Stress wurde gezeigt abhängig von der Wellenlänge oder der Intensität der Bestrahlung ab. Studien zum Vergleich der Behandlungsparameter fehlen, aufgrund der Abwesenheit von im Handel erhältlichen Geräten, die mehrere Wellenlängen und Intensitäten, geeignet für Hochdurchsatz-in-vitro-Optimierungsstudien liefern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Abgabe von Licht in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten der therapeutischen Dosis für eine gegebene Verletzungsmodell erforderlich optimieren. Wir nahmen an, dass eine Methode der Bereitstellung von Licht, in dem Wellenlängen- und Intensitätsparameter könnte leicht geändert werden könnten Bestimmung einer optimalen Dosis von R / NIR-LT zur Reduzierung reaktiver Sauerstoffspezies zu erleichtern(ROS) in vitro.

Nichtkohärenten Xenon-Licht wurde mit Schmalband-Interferenz-Filter filtriert, um unterschiedlicher Wellenlänge (Mittenwellenlängen von 440, 550, 670 und 810 nm) und Fluenzen liefern (8,5 x 10 ^-3 bis 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ der Licht auf kultivierte Zellen. Lichtausbeute aus der Vorrichtung wurde kalibriert, um therapeutisch relevante, gleich Quanten Dosen von Licht bei jeder Wellenlänge emittieren. Reaktive Spezies nachgewiesen in Glutamat gestreßten Zellen mit Licht behandelt, mit DCFH-DA und H ₂ O ₂ sensitive Fluoreszenzfarbstoffe.

Wir haben erfolgreich geliefert Licht bei einer Reihe von physiologisch und therapeutisch relevanten Wellenlängen und Intensitäten, um kultivierte Zellen zu Glutamat als Modell der ZNS-Verletzung ausgesetzt. Während die Einflüsse von R / NIR-LT in der vorliegenden Studie verwendet nicht eine Wirkung auf ROS durch die kultivierten Zellen erzeugten ausübt, ist das Verfahren der Lichtabgabe auf andere systems einschließlich Einzel Mitochondrien oder mehrere physiologisch relevanten organotypischen Kulturmodellen und könnte verwendet werden, um Auswirkungen auf eine Reihe von Zielkriterien des oxidativen Stoffwechsels zu bewerten.

Einleitung

Für eine Reihe von Signalwegen und normale Reaktionen des Zellstoffwechsels, einschließlich der Neuroprotektion ¹ sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erforderlich. Wenn jedoch endogenen antioxidativen Mechanismus nicht in der Lage, die Produktion von ROS zu steuern, Zellen gegenüber oxidativem Stress ^2,3 erliegen. Nach Verletzung des ZNS, werden die damit verbundenen Anstieg in Gegenwart von ROS und oxidativer Stress vermutlich eine wesentliche Rolle bei der Progression der Schädigung ^4,5 spielen. Trotz der umfangreichen Reihe von Strategien zur Abschwächung oxidativen Stress, die beurteilt wurden, gibt es noch keine vollständig wirksam, klinisch relevante antioxidativen Strategien zur Dämpfung von ROS-Produktion und die damit verbundenen oxidativen Stress in der klinischen Anwendung folgende Neurotrauma ^6. Deshalb ist die Abschwächung des oxidativen Stress bleibt ein wichtiges Ziel für die therapeutische Intervention ^7.

Verbesserungen folgening R / NIR-LT sind in einer Vielzahl von Verletzungen und Erkrankungen einschließlich Senkung der kardialen Infarktgröße, renale und hepatische Komplikationen bei Diabetes, Netzhautdegeneration, ZNS-Verletzung und Schlaganfall ^8, vielleicht durch die Reduzierung von oxidativem Stress berichtet. Insbesondere im Hinblick auf ZNS-Verletzung, haben präklinische Studien der Wirksamkeit von 670 nm Licht gute Effekte in Modellen der Netzhautdegeneration ^9-11, Verletzungen des Rückenmarks ^12, neuronalen Tod ¹³ gezeigt. Klinische Studien haben für trockene altersbedingte Makuladegeneration durchgeführt worden und werden derzeit für einen Schlaganfall ^14, aber die Ergebnisse dieser Studien nicht vielversprechend erscheinen, möglicherweise aufgrund eines Fehlers zu einer wirksamen Behandlung beschäftigen Parameter ^15. Als solche R / NIR-LT, nicht sehr stark im Rahmen der normalen klinischen Praxis bei Neurotrauma angenommen, obwohl sie eine leicht zu verwalten, nicht-invasive und relativ kostengünstige Behandlung. Hindernisse für klinische Umsetzung gehören der Mangel an einem clAnfang verstanden Wirkmechanismus und das Fehlen eines standardisierten effektiven Behandlungsprotokoll ^16,17. Aktuelle Literatur in Bezug auf die Lichttherapie zeigt eine Fülle von Variationen in der Behandlungsparameter in Bezug auf Strahlungsquellen (LED oder Laser), Wellenlänge (zB 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm) Gesamtdosis (Joule-Bestrahlung / Flächeneinheit), Dauer (Belichtungszeit), Zeitpunkt (vor oder nach dem Insult), Behandlungshäufigkeit und Art der Lieferung (Puls oder kontinuierlich) ^8. Die Variabilität der Behandlungsparameter zwischen den Studien einen Vergleich schwierig und hat zu Skepsis gegenüber der Wirksamkeit ¹⁶ beigetragen.

Daher wird die Optimierung der R / NIR-LT eindeutig erforderlich, mit Zellkultursystemen, die zur High-Throughput-Screening-Mechanismus notwendig, um die mehreren Variablen zu vergleichen ist. Allerdings gibt es nur wenige handelsübliche Beleuchtungssysteme, die eine ausreichende Flexibilität und Kontrolle über wa bieten kannvelength und Intensität, solche Optimierungsversuche durchzuführen. Kommerziell erhältliche LED-Vorrichtungen sind im Allgemeinen nicht in der Lage, mehrere Wellenlängen oder Intensitäten, was Forscher die mehrere LED-Vorrichtungen von unterschiedlichen Herstellern, die nicht nur in der Intensität variieren kann, zu liefern, sondern auch das Spektrum der Wellenlänge des emittierten Lichts. Wir haben dieses Problem durch Verwendung eines Breitband-Xenon-Lichtquelle durch schmalbandige Interferenzfilter gefiltert, wodurch eine Reihe von Wellenlängen und Energiedichten von Licht, so dass in der Nähe, eine genaue Kontrolle der Parameter des R / NIR-LT gerichtet.

Es ist wichtig zu beachten, dass die therapeutische Dosis der Behandlung wird durch die Anzahl der Photonen, die Interaktion mit dem photoacceptor (Chromophor), die im Fall von R / NIR-LT wird postuliert, Cytochrom c Oxidase (COX) ¹⁸ werden definiert. Photonenenergie geliefert mit der Wellenlänge variiert; dh gleiche Dosen von Energie bei verschiedenen Wellenlängen werden comvon unterschiedlichen Anzahlen von Photonen geschätzt. Daher wurde das Licht von der Vorrichtung emittiert wird kalibriert, um eine gleiche Anzahl von Photonen für jede der gewählten Wellenlängen zu prüfenden emittieren. Wir haben ein System, das verwendet werden kann, um R / NIR-LT in einem Bereich von Wellenlängen und Intensitäten zu Zellen in vitro zu liefern entwickelt und demonstriert die Fähigkeit, die Wirkungen des gelieferten R / NIR-LT auf ROS-Produktion in Zellen unterworfen zu messen Glutamat Stress.

Protokoll

1. Optische Kalibrierung: Messlichtleistung

1. Um die Lichtabgabevorrichtung vorzubereiten, schließen Sie eine Breitbandlichtquelle (zB Xenon oder Wolframlampe) an eine geeignete Stromversorgung. Positionieren einer kollimierenden Linse vor der Lichtquelle, um einen kollimierten Lichtstrahl zu erzeugen. Passieren die Licht durch ein flüssiges Wärmefilter den größten Teil der Wärme aus dem Lichtstrahl zu entfernen. Abhängig von der Anwendung, den Schwerpunkt des kollimierten Strahls auf die Eintrittsöffnung eines Flüssigkeitslichtleiters, der für eine flexiblere Abgabe des Lichts (z. B. in einen Inkubator) liefert.
2. Am anderen Ende des Flüssigkeitslichtleiter einsetzen, eine zweite Kollimatorlinse und eine Halterung für die Interferenz und Neutralfilter. Überprüfen Sie, ob diese Anordnung erzeugt eine gleichmäßig ausgeleuchtet Lichtpunkt des gewünschten Wellenbereich und Intensität.
   Hinweis: Der Abstand zwischen dem Ende des Lichtleiters und der Objektebene muss je nach zu variierendie Fläche, die beleuchtet werden muss, sondern daran, dass, wenn der Abstand von dem Ende der Lichtführung zunimmt, werden die Lichtintensität zu verringern. In der vorliegenden Studie ist dieser Abstand 14cm und erzeugt einen Strahlquerschnitt, die gleichmäßig beleuchtet eine 3x3-Muldenbereich auf einem 96-Well-Platte.
3. Darauf achten, dass Streulicht von der Lampe und die damit verbundenen optischen Komponenten nicht in der Lage, um die Probe zu erreichen.
4. Schalten Sie den Wasserkühler für das flüssige Wärmefilter und sicherzustellen, dass es den Austausch von Wasser durch den Filtermantel. Schalten die Lampe Stromquelle und eine Wartezeit von mindestens 5 min für die Breitband-Lichtquelle zu stabilisieren. Anmerkung: Die Verwendung des Wasserkühlers ist erforderlich, um ein Überhitzen der Vorrichtung zu verhindern.
5. Wählen eines Schmalbandinterferenzfilter (in der Regel durch ihre Mittenwellenlänge, Spitzendurchlässigkeit und die Halbwertsbreite (FWHM) Bandbreite beschrieben), um den gewünschten Wellenbereich der Beleuchtung zu erzeugen. Anmerkung: Die in der vorliegenden Studie verwendete schmalbandige Interferenzfilter sind 442 nm, 550 nm, 671 nm und 810 nm.
6. Messen Sie die von der Lampe auf der Ebene, in der die Probe während der Behandlung positioniert werden erzeugte Licht. Gemessen unter Verwendung eines kalibrierten Lichtstrahlungssonde (Kosinus Kollektor) mit einem geeigneten Spektroradiometer verbunden, mit Anstand Software entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
7. Verwenden Neutralfilter, um die Intensität des Lichts einzustellen, bis die gewünschte Ausgabe erhalten wird. Anmerkung: In der vorliegenden Arbeit wird die Intensität des von jedem Interferenzfilter geleitet eingestellt, um eine gleiche Quantenausgang an jedem der vier Behandlungswellenbänder zu ergeben. Es ist wichtig, um die Kalibrierung regelmäßig zu überprüfen, da die Lampenleistung kann sich ändern.
   Anmerkung: Nach dem Aufbau der Vorrichtung, sind die Zellen bereit, beleuchtet werden: Figur 1 eine Darstellung der Lichtabgabevorrichtung in der vorliegenden Studie verwendet..

Abbildung 1. Bild des Lichtabgabevorrichtung. Dargestellt sind die Lichtenergiequelle, Xenon-Lampe mit Gehäuse, Sammellinse, Wasserfilter, Eingangsöffnung, Flüssigkeitslichtleiter, der zweite Kollimationslinse, Filterhalter, Behandlung Rahmen und mattschwarz Karte. Man beachte, dass das schmalbandige Wellenlänge und Intensität Filter sind nicht dargestellt.

2. Zellpräparation

1. Die beschriebene R / NIR-LT Liefermethode kann zu jedem Zelltyp oder in vitro Modellsystem verwendet werden; als solche die folgenden Beschreibungen der Zellkultur allgemeinen unter Verwendung wohlbekannter Techniken zur Kultur Phäochromocytom (PC12), Müller (RMC1) und primären gemischten Retinazellen.
2. Vor der Zellaussaat zur Lichtbehandlung und oxidativer Stress Assay immortalisierten Kulturzellen in der jeweiligen Wachstumsmedien, die geeignete Ergänzungsmittel (z. B. FBS, Antibiotika) in T75 flasks, bis 70-80% konfluent.
3. Lösen immortalisierten Zellen aus T75-Kolben unter Verwendung des Verfahrens für den Zelltyp geeignet z getestet werden. Trypsin. Falls erforderlich, bevor mit der Aussaat der Zellen in 96-well-Assayplatten fortfällt Vertiefungen der Assayplatte mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin für 1 h (z. B. für PC12-Zellen) oder 10 ug / ml Poly-L-Lysin 1h mit einem O / N-Inkubation mit 10 ug gefolgt / ml Laminin (z. B. für Mischnetzhautzellen).
4. Zentrifugenzellen entsprechend zu sammeln (z. B. 3 min bei 405 · g für PC12-Zellen oder 10 min bei 218 × g für RMC1 Zellen), Entfernen des Überstandes und Resuspension in 8 ml der geeigneten Zellkulturmedien.
5. Wenn gemischt Netzhautzellen zu verwenden sind, bereiten von P0-5 neonatalen Rattenjungen durch enzymatischen Abbau (Papain) nach festgelegten Verfahren ¹⁹
6. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Ausnahme von 0,4% (w / v) Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers.
7. Passen Zelldichte such, die Zellen werden etwa 70 bis 80% konfluent nach 24 oder 48 Stunden in Kultur. (Für PC12-Zellen die Aussaatdichte von 4,0 x 10 ⁵ lebensfähigen Zellen / ml, für RMC1 Zellen ist es 2,5 x 10 ⁵ lebensfähige Zellen / ml und bei Zusammenretinazellen ist 8 x 10 ⁵ lebensfähige Zellen / ml). Nach der Zugabe von Zellen, entweder klar oder schwarze 96-Well-Platten (für die H ₂ O ₂ oder DCFH-DA Assay jeweils verwendet werden), in 100 ul des geeigneten Wachstumsmedien, lassen Sie die Platte auf eine flache Oberfläche bei 37 ° C, 5 sitzen % CO ₂ (oder welche Bedingungen angemessen sind für den spezifischen Zelltyp) für mindestens 24 h auf die Zellhaftung zu ermöglichen.
8. Kulturzellen in einem Wachstumsmedium in das entsprechende 96-Well-Schalen, bis sie 70-80% konfluent (24h für PC12 und RMC1 Zellen 48h für Mischnetzhautzellen).

3. Hinzufügen Glutamat Stressor zu Zellen

1. Bereiten L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Hydrat Stressor Konzentrationen von 0-10mm in entsprechenden Voll wachsenth Kulturmedien.
2. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und vorsichtig waschen Zellen 3 mal mit PBS (PC12) oder HBSS (RMC1 und gemischte Netzhautzellen). Nach Wäschen hinzuzufügen Glutamat enthaltenden Medien auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung.

4. Erste-Dosierungen von Lichtbehandlung

1. Unmittelbar nach der Zugabe von Glutamat oder Stressor der Wahl, aussetzen Zellen Lichtbehandlung bei den gewünschten Wellenlängen und Intensitäten, indem Sie unter der vorbereiteten Lichtabgabevorrichtung. Achten Sie darauf, die Quanten Ausgang des Lichtstrahls mit den etablierten Kombinationen von Graufilter in Abhängigkeit von der Wellenlänge verabreicht ändern.
   Hinweis: In den aktuellen Experimenten ausgesetzt Zellen Lichtbehandlung für 3 Minuten die Temperatur zu halten, indem die 96-Well-Platten auf einer ³⁷ ° C Wärmepolster ruht. Behandlungszeit kann je nach Bedarf variiert werden.
   1. Legen Sie eine matte schwarze Karte unter den Zellen, um Licht zu verhindern reflektieren in benachbarten Vertiefungen in der 96-well Fach für andere Behandlungsparameter bezeichnet.
2. Wird die Behandlung über längere Zeiträume gewünscht, fügen 25 mM Hepes-Puffer, um den pH der Zellkulturmedien erhalten oder im Idealfall stellen die Vorrichtung und das Behandlungs Platten in einem Inkubator mit CO _{& sub2; -Konzentration} von 5% CO ₂ reguliert wird, oder Bedingungen, die optimal sind, für den spezifischen Zelltyp.
3. Nach Abschluss der Lichtbehandlung, legen Sie die Zellen auf einer ebenen Fläche und bei 37 ° C und 5% CO ₂ (oder was auch immer Bedingungen sind optimal für den Zelltyp) für 24 Stunden.
   Anmerkung: Zusätzliche Dosierungen von R / NIR-LT kann wie oben beschrieben nach Wunsch verabreicht werden.

5. Schluss Dosierung des Lichts Behandlung und Erkennung von ROS

1. Vor der Durchführung der Endrunde der Lichtbehandlung, bereiten die Reagenzien für ROS Erkennung verwendet werden. Vorbereitung 50 mM Citratpuffer (pH 6,0), Triton X100, und H ₂ O ₂ Nachweisreagenz ArbeitsLösung (1: 2: 97-Verhältnis von 10 mM H ₂ O ₂ Nachweisreagenz Stammlösung; 10 U / ml Meerrettichperoxidase; 50 mM Natriumcitrat (pH 6,0)). Bereiten DCFH-DA bei einer Endkonzentration von 100 uM in geeigneten Medien.
   Hinweis: DCFH-DA-Reagenz für PC12-Zellen in RPMI-Medium, DCFH-DA-Reagenz für RMC1 Zellen in DMEM-Medium. Beachten Sie, dass im Handel erhältliche Nachweisreagenzien sind Differenz Empfindlichkeiten auf bestimmte ROS und Reagenzien sollte sorgfältig ausgewählt werden, um die für eine einzelne Anwendung gewünschten Informationen zu liefern.
2. Verabreichen Lichtbehandlung zu den Zellen, wie in Schritt 4.1-4.1.2 beschrieben. Achten Sie darauf, die Zellen werden mit den gewünschten Einflüsse / Wellenlängen von Licht behandelt.
3. Unmittelbar nach der Lichtbehandlung, entfernen Sie die glutamathaltigen Medien und waschen zweimal mit geeigneten Pufferlösung (bei PC12-Zellen, PBS verwendet wird und für RMC1 Zellen, HBSS verwendet wird). Führen Sie die ROS-Assays auf die Zellen wie folgt:
   1. H ₂ O ₂ Test: in 45 ul 50 mM Citratpuffer (pH 6,0) und 5 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen. Schütteln Sie die Zellen auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden und bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 15 min. In 50 ul H ₂ O ₂ Erkennung Arbeitslösung und Inkubation für 30 min bei RT. Messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 480 nm.
   2. DCF-Assay: 100 l der 100 & mgr; M Lösung von DCFH-DA, um jede der Vertiefungen und Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C und 5% CO _2. Druckmaterial, das 100 uM DCFH-DA und wasche mit geeigneten Pufferlösung (wie oben beschrieben) zweimal. Hinzufügen von 90 ul Pufferlösung und 10 ul Triton X100 zu jeder der Vertiefungen und vorsichtig Schütteln auf einem Orbitalschüttler für 30 Sekunden vor dem 15-minütigen Inkubation bei 37 ° C. Messen DCF ableiten Fluoreszenz unter Verwendung eines Plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 480 nm und einer Emissions wavelength von 530 nm.
   3. Express ROS Werte bezogen auf die Proteinkonzentration der Zellen in den Wells verbleibende, unter Verwendung eines kolorimetrischen Kits zur Proteinkonzentration quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve auf mg Protein berechnet.

Ergebnisse

Der Ausgang von Licht bei einer Wellenlänge von 670 nm abgegeben wurde mit Neutraldichtefiltern, um Zellen mit einer Reihe von Fluenzen umfassend eine Dosis eines zuvor gezeigt vorteilhaft in vivo (0,3 J / cm ^{2) 20} bis 670 nm sein, Licht zu bestrahlen kalibriert. Da die Zahl der Neutralfilter vor der Lichtquelle erhöht wird, die Intensität (W / m ²⁾ verringert, so dass weniger Licht auf den Zielbereich passieren. In Tabelle 1 sind die Kalibrierungsdaten von 670nm Licht von der Lichtquel...

Diskussion

Wir haben erfolgreich eine genaue und kalibrierte Lichtabgabesystem geeignet ist, einen Mechanismus für die Studie zur Optimierung der R / NIR-LT in vitro bereitzustellen. Wellenlängen- und Intensitätsparameter R / NIR-LT der Lage sind, mit diesem System genau und effektiv bearbeitet werden. Wir haben festgestellt, dass das Licht die Behandlung der Zellen nicht zum Zelltod führen, wenn auch ROS nicht bei den Wellenlängen und Dosierungen geliefert reduziert, in den getesteten Zelltypen. Höchstintensitäten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B