Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Zusammenfassung

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Zusammenfassung

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development^1-8.

Einleitung

The mammalian organ of Corti is comprised of a mosaic of specialized cell types, including two types of mechanosensory hair cells as well as at least four types of nonsensory supporting cells making it an ideal model system to study normal cellular processes like proliferation, fate specification, differentiation and patterning. In addition, the normal development of these different cell types is essential for normal hearing function. Hence, it is crucial to understand the factors, both molecular and cellular, that regulate their development. However, the small size of the mouse cochlea as well as its inaccessibility poses a particular challenge for gene expression studies. Moreover, most of the cell fate specification and patterning events occur during embryonic time periods and are mostly completed before birth. Therefore, identification and characterization of signaling events during embryonic time periods is essential to gain insight into the molecular basis of cochlear morphogenesis.

Here, we demonstrate a method to culture intact cochlea in vitro from embryonic mouse inner ears. The rationale behind the use of this technique is that cultured cochleae maintain their molecular and morphological characteristics thereby providing a valuable model for investigating potential candidate genes and exploring the mechanisms involved in cochlear morphogenesis. Although transgenic mice can be used for gene expression studies, an in vitro system is often needed for monitoring specific gene functions. Moreover, cochlear cultures can be established from transgenic mouse embryos so that their in vitro development and response to various soluble factors and antagonists can be studied. Although embryos at day 13 (E13) are used in this protocol, cultures from E12 or E14 to early postnatal inner ears can give similar results.

We also present a gene transfer technique in cultured embryonic cochlear explants using square wave electroporation. Following the isolation of the cochlear explants, electroporation can be used to express DNA plasmids of gene(s) of interest in individual cells within the cochlear duct. This technique serves as a complementary approach to studies utilizing transgenic mice to gain insight into the molecular pathways underlying cellular phenotype. Using this method of gene transfer, a variety of epithelial cell types within the embryonic cochlea are transfected, thereby enabling loss-and gain-of-function analyses at the single-cell level. In addition, electrophysiological studies can also be performed in cochlear explant cultures⁸. This method of in vitro electroporation is relatively simple and straightforward, combined with minimal damage to the tissue, has resulted in a rapid expansion of this technique.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Protokolle mit lebenden Tieren müssen überprüft und durch ein Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen worden sein und offiziell anerkannte Methoden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgen. Alle Sektionen sollte mit einer sterilen Technik auf eine saubere Sterilbank werden. Handschuhe und eine Maske, falls erwünscht, sollte bei diesem Verfahren getragen werden.

1. Präparation der embryonalen Maus-Ear-

1. Einrichten für Corti-Organ Explantatkulturen:
   1. Sterilisieren der Laminarströmung Gewebekulturhaube durch Einschalten UV-Licht für ungefähr 30 min und desinfiziert die Oberfläche mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Zusätzlich zu sterilisieren alle Dissektionsinstrumente einschließlich feiner Dissektion Werkzeuge und Sylgard-beschichtete Platten für Embryo Dissektion über Autoklaven oder durch Eintauchen in 70% Ethanol für mindestens 20 Minuten vor dem Gebrauch. Gießen Sie 70% Ethanol und lassen Sie die Speisen und Instrumente an der Luft trocknen in einem sauberen laminare Strömung clean Bank vor der Verwendung.
   2. Vorbereitung steriler Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) (HEPES) Mischung durch Zugabe von 10% 10x HBSS und 0,5% HEPES und den pH-Wert auf etwa 7,2 und Filter sterilisieren endgültige Lösung und bei 4 ° C. Führen Sie alle Sektionen in gekühlt HBSS / HEPES-Lösung zu einer besseren Erhaltung der Gewebe während des gesamten Verfahrens.
   3. Beschichtung von Glasbodenschalen mit Basalmembranmatrix durch Zugabe von 5 ml kaltem (4 ° C) sterile Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) zu einem 300 & mgr; l Aliquot von Basalmembran-Matrix in einem sterilen 15 ml-Polypropylenröhrchen. Vortexen Inhalt und mit 150 ul der Basalmembranmatrix-DMEM Mischung auf die Mitte jeder Kulturschale, so dass es den in der Mitte der Schale gut vorliegenden gesamte Kultur umfasst. Decken Sie die Speisen und an einem 37 ° C Inkubator für mindestens 45 Minuten vor dem Gebrauch.
   4. Gießen Sie 4-5 ml gekühlt HBSS umgree sterile Polystyrol-Petrischalen und verlassen in der Haube geschlossen ist.
   5. Bereiten Kulturmedium in einem sterilen 15 ml-Polypropylenröhrchen durch Zugabe von 9 ml DMEM werden 100 ul N2 Ergänzungen, 10 g / ml Cipro und 1 ml FBS.
2. Die Isolierung der Embryonen:
   HINWEIS: In diesem Verfahren zum Kultivieren von Cochlea-Explantate aus embryonalen Mäuse, Ernte Innenohren aus embryonalen Tag (E) 13 Schläfenbeine mit dem Tag nach der Befruchtung als E1 ⁹ berücksichtigt. Das Protokoll kann auch mit embryonalen Maus inneren Ohren beginnend von E12 bis E18 verwendet werden.
   1. Euthanize eine zeitgesteuerte schwangeren Maus mit CO ₂ und opfern Tier durch Genickbruch oder entsprechend zugelassenen Protokollen. Führen Sie die Euthanasie von Laminar-Flow-Gewebekultur Haube, um die Sterilität in der Gewebekulturraum zu erhalten.
   2. Zeigen eingeschläfert Maus auf Papiertuch mit Bauch nach oben und desinfizieren Bauch mit 70% Ethanol.
   3. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch Greifen der Hautmit einer gebogenen Pinzette mit einer Hand und schnitt Epidermis und Muskeln entlang der Mittellinie mit einer Schere mit einer anderen Hand. Machen Sie zwei senkrechte Schnitte auf beiden Seiten und ziehen Sie den Uterus sorgfältig durch Anheben bilateralen Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und entfernen Sie sie von unten Binde mit Gewebe Schere.
   4. Setzen Sie den embryonalen Kette in einer Petrischale mit Kalt Dissektion Lösung (HBSS / HEPES-Gemisch) und Transfer zum Laminar-Flow-Sterilbank.
   5. Embryonen vorsichtig aus Plazenta und legen Sie sie in einem der sterile Petrischalen mit Dissektion Lösung. Wenn die Lösung färbt sich blutig, verschieben Sie sie in eine neue Petrischale.
      HINWEIS: An dieser Stelle können Embryonen mit einem Theiler Inszenierung Führung statt.
   6. Enthaupten Embryonen durch Kneifen im Halsbereich mit einem Paar von sauberen Pinzette oder Schere und legen die Köpfe in einer Petrischale mit frisch gekühlt Sezieren Lösung.
3. Dissection der inneren Ohren:
   1. Ort one Embryokopf in einem sterilen Sylgard Schale mit kaltem Seziertisch
   2. Lösung. Arbeiten unter einem Binokular mit einer Vergrößerung von ~ 1,6X, immobilisieren den Embryo Kopf, indem Minutien Stifte oder um näher an Augenbereich (1A).
   3. Mit zwei Paar sterile Pinzette vorsichtig die Haut und die Öffnung des Schädels auf der Rückenseite entlang der Mittellinie (Abbildung 1B). Entfernen Gehirn von Schädelhöhle und Innenohren im Schläfenbeine befindet, kann in diesem Stadium (1C, D) identifiziert werden. Die Auskleidung des Blutgefäßes, die normalerweise um den Innenohren vorhanden ist, kann als Bezugspunkt für die Identifizierung des Innenohrs in dieser Phase (1D) verwendet werden.
   4. Präparieren Sie die Innenohr von der zeitlichen Knochen, indem die Zange unterhalb des Gewebes und Isolierung des Innenohrs von der Schädelbasis und in ein neues Gericht, das kalt Sezieren Lösung (1E, F).

2. Erzeugung von Corti-Organ Explantatkulturen

HINWEIS: In diesem Stadium der Entwicklung wird das Gewebe Knorpel und kann mit einer Pinzette leicht präpariert werden.

1. Richten Sie das Innenohr, so dass Bauchseite nach oben zeigt (Abbildung 2A) und Stabilisierung des Innenohrs durch leichtes Einsetzen des scharfen Ende Minutien Stifte durch die vestibulären Teil des Innenohrs (2B).
2. Mit ultrafeinen Zange aufgeschnitten das darüber liegende Knorpel durch einen Einschnitt mit einem Ende der Zange in der Nähe von dem ovalen Fenster und entfernen Sie vorsichtig den Knorpel aus der Hörschnecke (2C).
   Hinweis: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass Zange nicht zu tief in den Knorpel einge als darüberliegenden Knorpel wird manchmal mit dem Schneckengang in diesem Fall ist es hilfreich, geschlossener Zange verwenden, um Knorpel von dem darunterliegenden Schneckengang frei durch Abkratzen unter der kondensierte sberfl des Knorpels. In diesem Stadium der Entwicklung, ist die Spirale der Cochlea nur drei Viertel einer Umdrehung in der Länge.
3. Als nächstes setzen die Sinnesepithel indem die Zange in dem bevorzugten Bereich der Schneckengang entweder der Basis oder an der Spitze sehr, und sanft herausziehen das Dach der Cochlea (2D).
   HINWEIS: Das Dach der Cochlea muss vollständig entfernt werden, da es die Sinnesepithel behindern die Analyse maskieren.
   HINWEIS: Dieses Verfahren muss vorsichtig erfolgen, da es einfach ist, die Sinnesepithel reißen werden.
4. Als letzter Schritt, vorsichtig die zugrunde liegenden Bindegewebe von der freiliegenden Sinnesepithel so dass die Basis der Cochlea-Explantat gleichmäßig flach.
5. Isolieren Sie die seziert Cochlea von der vestibulären Teil des Innenohrs mit einer Pinzette. Dies kann vor oder nach dem Schritt 2.4 (2E) durchgeführt werden.
6. Übertragen Sie die seziert Cochlea Sinnesepithel in einen Keller membrane Matrix-beschichteten Kultur auch mit einem 1,5 mm sterile scooper (2F).
7. Richten Sie die Cochlea-Explantat mit der Lumenoberfläche des Epithels nach oben ein und saugen Sie den Basalmembranmatrix-DMEM-Lösung sorgfältig zu glätten das Gewebe und ersetzen Sie es mit 150 ml frisches Kulturmedium durch sanftes Zugabe in die Schale. Ist darauf zu achten, um sicherzustellen, dass jedes Explantat haftet gut auf der beschichteten Glasdeckglas und wird nicht in das Kulturmedium schwimm werden. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Zange wird darauf hingewiesen, während der Anbringung des Glases auch um eine Beschädigung der Cochlea Explantation.
8. Die Kulturschale vorsichtig Führung in eine sterile 150 mm Kulturschale und in eine Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für eine gewünschte Zeitdauer, in der Regel 3-6 Tage in vitro (DIV). Nach 1 DIV, untersuchen Sie die Kulturen unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die Cochlea-Explantat wurde auch in die Kulturschale eingehalten werden.
9. Nach dem incubation in vitro für die gewünschten Zeitdauern werden die Kulturen für die Immunhistochemie verarbeitet.
   HINWEIS: Die Explantatkulturen Regel werden 6 DIV das entspricht Entwicklungsstufe, P0 inkubiert. Nach Inkubation in vitro können Kulturen für Downstream-Anwendungen wie die Immunhistochemie (3B) verarbeitet werden, RT-PCR, in situ-Hybridisierung und / oder Western Blot.

3. Elektroporation vermittelte Gentransfer

1. Die Einrichtung für die Elektroporation:
   1. Sterilisieren Sie einen 100 mm Sylgard-beschichtete Glasschüssel durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol für etwa 20 Minuten und an der Luft trocknen in einer Sterilbank vor der Verwendung.
   2. Bereiten DNA aus einem Expressionsvektor der Wahl mit geeigneten Maxi- oder Midi-Prep-Kits. Die in diesem Protokoll verwendeten Expressionsvektoren sind pIRES2-Atoh1.EGFP und pCLIG-NeuroD1.EGFP. Die Endkonzentration der DNA sollte mindestens 1 ug / ul in sterilem DNA sein /RNase-freies Wasser.
2. Elektroporation DNA in embryonale Cochlea Explantate:
   1. Fügen Sie 10 ul der Plasmid-DNA-Lösung auf eine frische 100 mm Sylgard beschichtete Schale und übertragen eine komplett zerlegt Cochlea Explantation (aus Schritt 2.5 erhalten) in die DNA-Lösung.
   2. Mit Lumenoberfläche des Epithels nach oben, kippen Sie das Cochlea leicht, so dass es senkrecht zur Ebene der Schale.
   3. Die Elektrode Schaufeln auf beiden Seiten der Cochlea mit negativen Paddel (Kathode) in Richtung des sensorischen Epithels und der positiven Paddel (Anode), die benachbart zu der Basis der Cochlea.
      Hinweis: Da die DNA negativ geladen ist, von negativ nach positiv Elektrode und durch die Plazierung einer Kathode Ende der Sonde angrenzend an das Riechepithel wandert es; die DNA wird vor allem durch die Oberfläche des Sinnesepithel gehen.
   4. Mit Elektroporator liefern 9-10 Pulse von 24 mV, 30 ms Pulsdauer mit dem Fußschalter auf T-er Elektroporator, und fügen Sie 100 ul von warmem Kulturmedium, um die elektroporierten Cochlea.
   5. Die Schritte 3.2.1-4 für alle Cochlea Explantate und DNA der Gene von Interesse und übertragen die elektroporierten Cochleae in die Basalmembran-Matrix-beschichtete Schale zum Plattieren (Schritt 2.7). Kultur ganze elektroporiert Cochleae in einem 37 ° C, 5% CO ₂ befeuchteten Inkubator für gewünschte Zeitdauern, die dann für Immunzytochemie verarbeitet werden.
      HINWEIS: Die Schnecke aus einem ganzen Wurf von CD1 Maus (ungefähr 8-12 Welpen) isoliert werden, mikrodissezierten, elektroporiert und in <4 Stunden überzogen.

4. Analyse der Cochlear Explantatkulturen

HINWEIS: Die Kulturen werden in der Regel für 6 DIV, die äquivalent zu der Entwicklungsstufe, P0 ist, inkubiert. Nach Inkubation in vitro werden die Kulturen fixiert und für Immunzytochemie verarbeitet.

1. Nach gewünschte Länge incubation Entfernen Kulturmedium schnell und gründlich die Cochlea Explantat in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation in 4% Paraformaldehyd (in PBS) für 15 min bei Raumtemperatur.
2. 15 min Waschen Sie die Fixiermittel durch Zugabe von PBS und spülen in PBS dreimal.
3. Permeabilisieren Verwendung von PBS-T (PBS + 0,5% Tween) für 30 min vor dem Blockieren mit PBS-T, enthaltend 10% Ziegenserum.
4. Inkubiere in primären Antikörperlösung, die Primärantikörpers in PBS-T mit 1% Ziegenserum über Nacht bei 4 ° C.
5. Dreimal Waschen Sie die Cochlea bei Raumtemperatur mit PBS-T jede 15 Minuten, bevor Sie entsprechende Alexa-konjugierten Sekundärantikörper.
6. Da der Cochlea Explantat auf Glasdeckgläschen kultiviert sie können einzeln durch Isolierung des Deckglases von der Schale und die Montage auf einer Folie verarbeitet werden. Dies kann durch Eintauchen der Kulturschale in OS30 Lösungsmittel für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur erreicht werden. Mit dem sterilen Rasierklinge, nehmen Sie den Deckglas aus der dish und montieren auf einer Folie und sichtbar unter einem Fluoreszenzmikroskop.

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Ergebnisse

We describe a method to isolate cochlea from embryonic inner ears and micro-dissect to expose the sensory epithelium. Once dissected, it may be plated and cultured as an intact cochlear duct (Figure 3) and analyzed by immunohistochemistry. The cultured cochlear explants provide a useful assay to examine the effect of variety of soluble factors and pharmacological drugs on cochlear development. Following dissection of cochlear explants, electroporation technique can be used to misexpress genes of interest...

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Diskussion

Alle Zellen innerhalb des membranösen Labyrinth des Maus Innenohres einschließlich sensorischer, nonsensory und die Spiralganglienneuronen sind alle aus placodally abgeleiteten otocyst benachbart zu dem Hinterhirn des Ektoderms rund E8 ^10-14 abgeleitet ist. Bei E11 ventralen Bereich des otocyst erstreckt, um den Schneckengang zu bilden, und die Entwicklung geht weiter, eine Gruppe von Epithelzellen in der Cochlea als auch in anderen Bereichen des otocyst, werden als prosensory Patches, anschließend Hieraus...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco’s Modified Medium	Gibco	12430-054
Fetal bovine serum	Gibco	10082
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Ciprofloxacin hydrochloride	Cellgro	61-277-RF
Glass Dish 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Glass Dish 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Minutien pins	Fine Science Tools	26002-15
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Pulse generator	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Glass bottom culture dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrix	BD Biosciences	356237
Culture dish, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Conical tubes, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Myosin 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosin 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200