Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Zusammenfassung

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Zusammenfassung

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia¹. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar². Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells³. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase^4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Einleitung

Drosophila melanogaster: Die Felder der Entwicklungs- und Zellbiologie wurden stark von der Modellorganismus beeinflusst. Bei diesem Modell haben Studien des Auges Disc viel Wissen über Signalisierung, Zellbiologie und anderen Bereichen beigetragen. Die späten dritten Larvenstadium Auge Disc wurde ausgiebig untersucht und ist ein leistungsfähiges Modell zu nutzen, da es eine Momentaufnahme aus einer Reihe von Entwicklungsperioden, jede mit ihrer eigenen einzigartigen Signalmoleküle und Prozesse, wie der morphogenetischen Furche fortschreitet über das Auge Disc ^8. Es besteht jedoch ein Bedarf für unser Verständnis von Entwicklungsprozessen weiter ausbauen in den Puppenentwicklungsphase. Zwar gab es auf der Puppenaugenscheibe ^3-7 wurden Studien, unser Wissen nicht nähern die Breite der Arbeit, die auf dem dritten Larvenaugenscheibe durchgeführt worden ist. Dies liegt zum Teil an die größere Schwierigkeit der Zerlegung des Puppenaugen Disc. Daher ist eine Präsentation derrichtige Methode der Präparation konnte erheblich erweitern Forschung in diesem Bereich.

Zwar gibt es Stufen innerhalb Puppenaugenscheibe Entwicklung, die leicht zerlegt werden, insbesondere um die Mitte des Puppenperiode, sind andere Zeiträume viel schwieriger zu sezieren. Das Protokoll stellt ein Verfahren zum Präparieren Puppenaugenscheiben, die universell für alle Puppenentwicklungszeitrahmen verwendet werden kann. Dieses Protokoll kann als eine Alternative zu einem anderen Protokoll ^9, die eine einfachere und schnellere Methode zur Augenscheiben von den Zeitpunkten, zu sezieren midpupal zeigt verwendet werden. Dieses Protokoll wurde ursprünglich gefilmt und für die Ausbildung fortgeschrittene Studierende in der UCLA Undergraduate Research Consortium in Functional Genomics (URCFG) ^10,11 in der Technik der Puppenaugen Dissektion entwickelt. Viele Studenten waren in der Lage, um dieses Video und Verfahren zu nutzen, um diese anspruchsvolle Technik zu erlernen.

Protokoll

Dieses Verfahren ist einen 2-tägigen Verfahren.

Tag 1 (2 HR + Sezieren Zeit)

1. Pupal Eye Disc Dissection

1. Wählen Sie eine Puppe für die Präparation.
   HINWEIS: Das Alter der Puppe zu seziert werden durch die experimentellen Bedürfnisse ermittelt werden. Wenn jedoch die Prüfung der Zellmorphologie, wird dies häufig bei 42 h nach Pupariumbildung (APF) bei 25 ° C, die das Alter der in der Video gezeigt Puppen durchgeführt wird. Sammeln weißen Puppen (als 0 hr APF) mit einem angefeuchteten Pinsel und ordnen sie in chronologischer Reihenfolge (basierend auf Sammelzeit) in einer neuen Fliege Essen Fläschchen bei 25 ° C gehalten. Präparieren Sie die im Alter von Puppen in diesem gleichen chronologischen Reihenfolge, um die Zeitunterschiede zwischen Puppen so nah wie möglich zu halten.
2. Übertragen Sie die Puppe in einen Tropfen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4, siehe Materialien für Rezept) auf einem Silikon Seziersaal Platte.
3. Halten Sie die Spitze der Puppenhülle mit einer Pinzette und Pierce und öffnen Sie die lower Teil der Puppenhülle mit einem Paar von scharfen Pinzette. Entfernen Sie die Puppe von der neu gegründeten Loch Fall.
4. Einen Diagonalschnitt mit einer Schere, mid-Thorax, in der Puppe. Entfernen Sie den Fremdkörper oder überweisen Sie den Puppenkopf zu einem neuen Tropfen PBS. Sauber mit der Pipette Blasrohr (siehe Materialien und Abbildung 1 für Details) und zusätzliche PBS nach Bedarf. Achten Sie darauf, um Austrocknung zu vermeiden.
5. Sicher zu greifen die Besten der Puppenkopf Kutikula mit einer Pinzette. Mit der Spitze des Blasrohr, schieben auf der Puppenhülle, um das Gehirn und anderen Geweben, einschließlich der Augenscheiben, aus der Puppenhülle zu extrudieren. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, greifen jedes Gewebe innerhalb der Nagelhaut.
6. Mit dem Blasrohr mit PBS gefüllt, blasen das Fett Körpergewebe und andere Verunreinigungen aus dem Kopf Fall klar zu trennen und identifizieren die Gehirn und Auge-Discs.
   HINWEIS: Halten Sie das Gehirn an den Puppenkopf Gehäuse angebracht wird es der Forscher auf die Verwendung erad Fall als "Griff" für zukünftige Manipulation des Gewebes, ohne die Augenscheiben oder Gehirn. Jedoch ist es üblich, das Gehirn und Augen Scheiben vom Kopfgehäuse zu entfernen und dies ist nicht schädlich für das Gesamtverfahren und Ergebnisse. Es dauert oft mehrere Versuche von Treib und schob die Augenscheiben und Gehirn aus dem Puppenkopf Fall und so, dass sie sich deutlich von umliegenden Gewebe erfolgreich zu extrahieren. Die saubere und getrennte man die Augenscheiben aus dem umgebenden Gewebe zu helfen zu verhindern äußerem Gewebe von Befestigung an der Augenscheiben.
7. Nach Dissektion, sofort das Gewebe übertragen, um einem 3 gut Glasschale auf Eis mit 0,5 ml Fix-Lösung (siehe Materialien). Float das Gewebe auf der Oberfläche der Fixier-Lösung für einige Minuten (typischerweise der Zeit, die für die nächste Reihe von Augen Scheiben zu zerlegen).
   HINWEIS: Ist das nicht das erste Auge Disk in dieser Runde der Dissektion, completel seziert werdeny tauchen die vorherige Augen Disc in den Fix-Lösung. Wenn für besondere Färbeverfahren (zB reaktive Sauerstoffspezies, Lysosomen, etc.) muss dies vor der Fixierung durchgeführt werden. Um dies zu tun, vor der Fortsetzung mit dem entsprechenden Färbungsprotokoll speichern die seziert Augenscheiben in eiskaltem PBS.
8. Nach Präparation und Untertauchen aller Augenscheiben seziert, bewegen Sie den 3 gut Glasschale auf einer Wippe und Rock bei Raumtemperatur für 30 min.

2. Immunfärbung

1. Entfernen Sie vorsichtig das Fix-Lösung und 0,5 ml PBS mit 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, siehe Materialien) und waschen Sie das Gewebe auf einer Wippe für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal für insgesamt vier Waschvorgängen (je 10 min).
   HINWEIS: Die sorgfältige Entfernung der Lösung aus der Quelle unter einem Präpariermikroskop zu Gewebeschäden oder Verlust zu verhindern, durchgeführt werden. Die Lösung kann vorsichtig mit einer Pipette angesaugt werden; bevorzugen wir eine fein Tipped, Einmaltransferpipette, die die Öffnung abgeflacht ist, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern Absaugen Gewebe hatte.
2. Am Ende des 4. waschen, entfernen Sie die Wasch- und 0,5 ml Blocklösung (siehe Materialien), um den Brunnen und Inkubation für 30 min.
   Hinweis: Dieser Zeitrahmen kann nach Ihren Bedürfnissen erweitert werden.
3. Am Ende der 30 Minuten Blockzeit, Pipette 10 ul Primärantikörperlösung (in Block-Lösung verdünnt) in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte.
   HINWEIS: Eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte wird über 4 Paar Augenscheiben zum Puppenhülle angebracht oder 8 isolierte Paare von Augenscheiben mit Köpfchen befestigt zubringen. Die primären Antikörper in diesem Protokoll für die repräsentative Daten verwendet werden, sind Anti-Phosphotyrosin (1: 500 Verdünnung) und Anti-Cut (1: 200 Verdünnung).
4. Übertragen Sie die sezierten Gewebes in die Mikrotiterplatte Wells mit dem primären Antikörper-Lösung aus der 3 gut Glasschale gefüllt.
5. Ortder Mikrotiterplatte auf einem befeuchteten Papiertuch in einem leeren Pipettenspitze Box (oder andere ähnliche Behälter) und bei 4 ° C über Nacht (um eine Austrocknung zu verhindern).

Tag 2 (4 h + Montagezeit)

6. Übertragen Sie das Gewebe aus der Mikrotiterplatte auf ein neues 3 gut Glasschale mit 0,3% PBT (≈0.5 ml) und waschen Sie das Gewebe für 10 Minuten auf der Wippe. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal für insgesamt vier Waschvorgängen (je 10 min)
7. Entfernen Sie die letzten Wasch und 0,5 ml Block-Lösung zum Brunnen. Block für 30 min.
   Hinweis: Dieser Zeitrahmen kann nach Ihren Bedürfnissen erweitert werden.
8. Entfernen Sie die Block-Lösung und 0,5 ml des Sekundärantikörperlösung zum Brunnen (von fluoreszenzmarkierten entsprechend Ihrer primären Antikörper und Fluoreszenzwellenlänge, in Block-Lösung verdünnt Antikörper hergestellt) und zum Schutz der 3 gut Glasschale von Licht mit einem Deckel oder Aluminium Folie und Inkubation für mindestens 2 Stunden bei RaumTemperatur.
   HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten in ähnlicher Weise von Lichtexposition geschützt werden. Diese Inkubation kann über Nacht bei 4 ° C erweitert werden, in einem Setup ähnlich wie der primäre Antikörper Inkubation, aber es kann auch in einem 3 gut Glasschale mit Labor-Film oder eine Mikrotiterplatte, wenn Antikörper Erhaltung gewünscht abgedeckt durchgeführt werden.
9. Am Ende der Antikörper-Inkubation, entfernen Sie die Sekundärantikörperlösung und 0,5 ml von 0,3% PBT zum Brunnen und Wäsche auf der Wippe für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 4 Wäschen (jeweils 10 Minuten).
   HINWEIS: Wenn DAPI-Färbung gewünscht wird, vor dem Start der ersten Wäsche, fügen 0,5 ul DAPI-Stammlösung (siehe Materialien) zu den 500 ul PBT, die für die erste Wäsche verwendet wird (1: 1000 Verdünnung).

3. Montage

1. Am Ende der letzten Waschung montieren anten / Augenscheiben auf einem Objektträger mit 70% Glycerin oder PBS als Medium, um die br entfernenain und anderen unerwünschten Gewebe in einem Pool auf einer Seite der Folie.
2. Das Gewebe vorsichtig bewegen Sie mit hydrostatischen Druck zwischen den Zangen, oder sehr vorsichtig mit einem Zangenspitze, und richten Sie die Augenscheiben in einer Kolonne in Richtung der Mitte des Schlittens.
3. Entfernen Sie alle Fremd Glycerin oder PBS aus der ganzen Gewebe (mit Dochtwirkung eines Laborwischtuch oder die Zange arbeiten für diese).
4. Legen Sie eine kleine Menge (≈10 ul) Montagemedium entlang einer Seite des Auges Disc Spalte und setzen Sie ein Deckglas auf das Gewebe, um so die Montagemedium auf das Auge Scheiben verteilen.
5. Lassen Rutsche sit für 1 bis 2 min, damit das Gewebe / Montagemedium vollständig auszubreiten.
6. Wischen Sie zusätzliche Montagemedium weg von den Rändern des Deckglases und verschließen Sie diese mit klarem Nagellack.
7. Erfassen Fluoreszenzbilder der Augenscheiben mittels konfokaler Mikroskopie.

Ergebnisse

Als Beispiel für die Verwendung dieses Protokolls, Ergebnisse darstellt midpupal (42 Std APF bei 25 ° C) Augenscheiben mit unterschiedlichen Antikörpern immungefärbt sind in Abbildung 2 Durch Verwendung eines gegen Phosphotyrosinreste gerichteten Antikörper präsentiert, kann die Membran der Zellen (Abbildung 2A). Dies kann verwendet werden, um die regelmäßige Anordnung der Ommatidien Zellen im Puppenauge identifizieren folgenden endgültigen Strukturierungsprozessen, die vor der midpupal Stufe a...

Diskussion

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs¹², which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers¹³ so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)			80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100	Promega	H5142	Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT			1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.
Fix Solution			(≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum	Rockland antibodies & assays	B304	Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution			10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution	Life Technologies	D3571	For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium	Vector Labs	H-1000	Mounting medium
Glycerol	Sigma	G5516	For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer	VWR	82007-202	Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Krayden	NC9897184	Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish			Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish	Corning	7220-85	The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray	Nunc	438733
Sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade	Ted Pella	1346
100 mm Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip	Samco Scientific	231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)	Nalgene	8000-0010	Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)	Saint Gobain Performance Plastics	ABW00001