Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Zusammenfassung

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Zusammenfassung

Experimentelle Untersuchung erlebt ein verstärktes Interesse an der Entwicklung und Anwendung von neuen und oftmals komplex, Closed-Loop-Protokolle, wobei der Reiz aufgebracht hängt in Echtzeit auf die Reaktion des Systems. Neueste Anwendungen reichen von der Umsetzung der Virtual-Reality-Systeme zur Untersuchung von motorischen Reaktionen sowohl in Mäusen ¹ und ² in Zebrafisch, zu kontrollieren, von Anfällen folgenden kortikalen Hub mit ³ Optogenetik. Ein wesentlicher Vorteil der Closed-Loop-Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Sondierung höherdimensionalen Eigenschaften, die nicht direkt zugänglich sind oder die auf mehreren Variablen, wie zum Beispiel neuronale Erregbarkeit ⁴ und Zuverlässigkeit ab, während gleichzeitig die Maximierung des experimentellen Durchsatzes. In diesem Beitrag wird und im Kontext von zellularen Elektrophysiologie, wie man eine Vielzahl von geschlossenen Kreisprotokolle zum Studium der Antworteigenschaften pyramidalen Neurone, rec Anwendung beschreiben wirintrazellulär mit der Patch-Clamp-Technik in akuten Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten orded. Da kein im Handel erhältlich oder Open-Source-Software bietet alle Funktionen, die für die effiziente Durchführung der hier beschriebenen Experimente erforderlich, wurde eine neue Software-Toolbox namens LCG ⁵ entwickelt, dessen modularer Aufbau maximiert die Wiederverwendung von Computer-Code und erleichtert die Umsetzung der neuen experimentellen Paradigmen. Stimulationswellenformen werden mit einem kompakten Meta-Beschreibung angegeben und vollständige experimentelle Protokolle sind in textbasierten Konfigurationsdateien beschrieben. Zusätzlich hat LCG eine Befehlszeilenschnittstelle, die für die Wiederholung von Studien und Automatisierung der Versuchsprotokolle geeignet ist.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde die Elektro zellulären vom traditionellen offenen Schleife Paradigma in Spannungs- und Stromklemme-Experimente zu modernen Closed-Loop-Protokolle verwendet entwickelt. Die bekannteste Technik mit geschlossener Schleife ist vielleicht das dynamische Klemm ^6,7, die die synthetische Injektion von künstlichen spannungsgesteuerten Ionenkanälen ermöglicht, die neuronalen Membran Spannung ⁸ zu bestimmen, die eingehende Untersuchung der Wirkungen von nicht-deter Flimmern auf Ionenkanäle auf neuronale Antwort Dynamik ⁹ sowie die Erholung in vitro realistischer in vivo- wie synaptische Hintergrundaktivität ^10.

Andere Closed-Loop-Paradigmen, die vorgeschlagen wurden, umfassen die Blindklemme ^11, um in vitro zu studieren die Erzeugung von selbsterhaltende Dauertätigkeit, und die Antwort zu klemmen ^4,12, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen zu untersuchen neuronale Erregbarkeit.

NHALT "> Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges Framework, das die Anwendung ermöglicht eine Vielzahl von Closed-Loop elektro Protokolle im Rahmen der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten Hirnschnitten durchgeführt. Wir zeigen, wie man somatische Membranspannung mit Hilfe von Patch-Clamp-Aufnahmen aufzeichnen in Pyramidenzellen aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten und gelten drei Closed-Loop-Protokolle mit LCG, ein Kommandozeilen-basierte Software-Toolbox im Labor für Theoretische Neurobiologie und Neuroengineering entwickelt.

Kurz gesagt, die beschriebenen Protokolle, sind erstens die automatische Injektion einer Reihe von Stromklemme Reizwellenformen, für die Charakterisierung einer großen Anzahl von aktiven und passiven Membraneigenschaften relevant. Diese wurden vorgeschlagen, um die elektrophysiologische Phänotyp einer Zelle in Bezug auf seine Ansprecheigenschaften zu einer stereotypen Reihe von Reizwellenformen zu erfassen. Bekannt als der E-Code einer Zelle (siehe zB & #160; ^13,14) wird eine solche Sammlung von elektrischen Antworten von verschiedenen Laboratorien verwendet, um objektiv zu klassifizieren Neuronen auf der Grundlage ihrer elektrischen Eigenschaften. Dies beinhaltet die Analyse der stationären Eingangs-Ausgangs-Übertragungsverhältnis (fI Kurve) durch eine innovative Technik, die den geschlossenen Regelkreis, Echtzeit-Steuerung der Rate der Brenn mittels eines Proportional-Integral-Differential (PID) -Controller beinhaltet zweitens die Erholung von realistisch in vivo -ähnlichen Hintergrund synaptische Aktivität in in vitro Präparate ¹⁰ und drittens dem künstlichen Verbindung in Echtzeit von zwei gleichzeitig aufgenommenen Pyramidenzellen mittels einer virtuellen GABAergen Intern, die durch den Computer simuliert wird.

Zusätzlich implementiert LCG die Technik als aktive Elektrode Kompensation (AEC) ^15, die die Umsetzung dynamische Klemm Protokolle mit einer einzigen Elektrode ermöglicht bekannt. Dies ermöglicht Ausgleichs unerwünschten Wirkungen (artifacts) der Aufzeichnungselektrode, die, wenn sie für die Bereitstellung von intrazellulärer Stimuli verwendet wird, auftreten. Das Verfahren basiert auf einem nicht-parametrischen Schätzung der äquivalenten elektrischen Eigenschaften des Aufzeichnungskreis.

Die in diesem Dokument beschriebenen Techniken und experimentelle Protokolle können ohne weiteres in üblichen Open-Loop-Spannungs- und Stromklemme-Experimente angewendet werden und kann auf andere Präparate, wie extrazelluläre oder intrazelluläre ^4,16 Aufnahmen in vivo ^17,18 verlängert werden. Die sorgfältige Montage der Einrichtung für ganze Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist ein sehr wichtiger Schritt für stabile, qualitativ hochwertige Aufzeichnungen. Im Folgenden gehen wir davon aus, dass eine solche Versuchsanordnung ist es, den Experimentator bereits verfügbar, und unsere Aufmerksamkeit auf die Verwendung von LCG beschreiben. Der Leser wird auf ^{19 bis 22} für weitere Tipps rund um die Optimierung und Fehlersuche hingewiesen.

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Empfehlungen und Richtlinien der Ethikkommission der Abteilung Biomedizinische Wissenschaften der Universität Antwerpen. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung von nicht-fühlenden Materials aus dem explantierten Gehirn juveniler Wistar-Ratten, die von zugelassenen humane Sterbehilfe Techniken erhalten.

1. Ausrüstung Vorbereitung

1. Installation und Konfiguration der Datenerfassung und Stimulationssystem.
   1. Verwenden Sie einen Personalcomputer (PC) mit einem Datenerfassung (DAQ) Karte von Comedi unterstützt ausgestattet, um Signale zu erfassen und senden analoge Steuerspannungen an den elektrophysiologischen Verstärker.
      HINWEIS: Comedi ist ein Linux-Modul und Bibliothek, die eine Vielzahl von Datenerfassungskarten aus den gängigsten Herstellern unterstützt: besuchen http://www.comedi.org für weitere Informationen.
   2. Falls ein computergesteuertes Patch-Clamp-Verstärkers in Gebrauch ist, verwenden einen zweiten PC neben den ein an den Verstärker gewidmetKontrolle.
      Anmerkung: Während letztere kann ein herkömmliches Betriebssystem ausgeführt wird, wird die zusätzliche PC sein, die in Echtzeit mit Hilfe eines speziellen Betriebssystems. Unter diesen Bedingungen ist es zweckmäßig, einen einzigen Monitor, Maus und Tastatur an den zusätzlichen PC angeschlossen zu verwenden, während eine Verbindung von einem Remote-Desktop-Anwendung auf dem dedizierten PC.
   3. Laden Sie das ISO-Image der Live-CD, die eine Echtzeit-Linux-Betriebssystem mit LCG vorinstalliert aus http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso und brennen Sie sie auf eine leere CD oder USB-Stick " .
   4. Legen Sie einfach die CD in das Laufwerk des PC mit dem DAQ-Karte und starten Sie es. Alternativ installieren LCG von seinem Online-Quell-Repository auf einem PC mit dem Betriebssystem Linux (zB Debian oder Ubuntu). Wenden Sie sich im Online-Handbuch für Details über den Einbauvorgang. Das Handbuch ist in http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf Internetseite.
   5. Booten Sie von der Live-CD: this wird automatisch ein komplett konfiguriertes System zu laden. Um dies zu tun, legen Sie das LCG-Live-CD in das CD-ROM-Laufwerk und starten Sie den Computer von der CD; wählen Sie das Echtzeit-Kernel (Standardoption), sobald das Boot-Menü angezeigt wird, und warten Sie, bis das System initialisiert werden.
   6. Kalibrieren Sie den DAQ-Karte, indem Sie an der Eingabeaufforderung:
      sudo comedi_calibrate
      oder
      sudo comedi_soft_calibrate
      je nachdem, ob die Datenerfassungsplatine unterstützt Hardware- oder Software-Kalibrierung, bzw. (verwenden Sie den Befehl sudo comedi_board_info um Informationen auf dem Brett zu erhalten).
   7. Stellen Sie die entsprechende Analog-Digital- und Digital-Analog-Umwandlungsfaktoren: das erfordert, die Zugriff auf das Handbuch des Mobilelektrophysiologischen Verstärker und insbesondere auf seine Spezifikationen auf der Umrechnungsfaktoren.
   8. Verwenden Sie einen Texteditor, um die entsprechenden Zahlenwerte in der Datei /home/user/.lcg-env für die Umgebungsvariablen angeben, AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      ANMERKUNG: Diese stellen den Eingang (AI) und Ausgang (AO) Verstärkungen für Stromklemme (CC) und die Spannungsklemme (VC) Modi und die Umrechnungsfaktoren zwischen den Spannungsbefehlen durch den Computer zur Verfügung gestellt und dem aktuellen bzw. Spannungen, die durch den Verstärker erzeugt wird verbunden.
   9. Alternativ können Sie die LCG-Skript zur Verfügung gestellt (LCG-find-Umwandlung-Faktoren), um die Umrechnungsfaktoren in seinem System zu finden.
      HINWEIS: Die berechneten Werte von LCG-find-Umwandlung-Faktoren sind Vermutungen, die in einigen Fällen erforderlich, numerisch Stumpf zu sein oder abgerundet, um die genauen Werte der Umrechnungsfaktoren zu reflektieren.
   10. Zur Nutzung LCG-find-Umwandlung-Faktoren, starten Sie, indem Sie den "Modellzelle", die oft mit dem Verstärker zu dem entsprechenden heads gekauft. Dann öffnen Sie ein Terminal auf dem Linux-Rechner, auf dem Sie ausgeführt werden die Live-CD und geben Sie den folgenden Befehl an der Shell-Eingabeaufforderung:
       lcg-find-Umwandlung-Faktoren -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
       HINWEIS: In beiden Fällen (dh manuelle Änderung /home/user/.lcg-env oder Verwendung LCG-find-Umwandlung-Faktoren), in der Nähe, und öffnen Sie das Terminal, damit die Änderungen wirksam werden.
   11. Wenn mehrere headstages verwendet werden, legen Sie die Umrechnungsfaktoren auf die gleichen Werte in allen Kanälen; wenn dies nicht möglich ist, finden Sie in der LCG Online-Handbuch zu verstehen, wie man mehrere Umrechnungsfaktoren in LCG-Stimulus oder wie verwenden, um Konfigurationsdateien, die die Bedürfnisse des Benutzers besser entsprechen zu produzieren.

2. Herstellung von Akute Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex

1. Herstellung von Lösungen für die Elektrophysiologie.
   1. Bereiten künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Mischen (in mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 NaHCO _3, 25 Glucose, 2 CaCl _2, und 1 MgCl _2. Bereiten 10x Lager-Lösungen für die ReduzierungVorbereitungszeit am Tag des Experiments. Vorbereitung 2 L, von denen eine für die Herstellung der Scheiben und der andere für die Aufzeichnung verwendet werden.
   2. Sättigen den ACSF mit 95% O ₂ und 5% CO ₂ für mindestens 30 min vor dem Beginn des Verfahrens.
   3. Für aktuelle Clamp Messungen, verwenden Sie eine intrazelluläre Lösung (ICS) enthält (in mM) 115 K-Gluconat, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na ₂ -GTP, 10 Na ₂ -phosphocreatine. Bereiten Sie die Lösung in Eis und filtern sie vor dem Beginn der Aufnahmen um die Gefahr des Verstopfens der Pipetten eliminieren.
2. Gehirn-Extraktion.
   1. Das Tier zu betäuben, indem das Tier in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran und schnell zu enthaupten sie mit einem Guillotine oder großen Schere.
   2. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie und schieben Sie sie in den Ohren.
   3. Mit einer feinen Schere schneiden den Schädel entlang der Mittellinie. Halten Sie die Klinge so nah wie möglich zu the Oberfläche, um eine Beschädigung der darunter liegenden Gehirn zu minimieren. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, verwenden Sie einen Spachtel, um den Sehnerv und den Hirnstamm durchtrennen und sanft fallen das Gehirn in eiskaltem ACSF.
   4. Trennen Sie das Kleinhirn und die beiden Halbkugeln mit einem Skalpell (Blatt 24).
   5. Überschüssiges Wasser aus einer der beiden Hemisphären und kleben Sie es auf einer geneigten Plattform mit einem Tropfen Sekundenkleber. Schnelles Hinzufügen von ein paar Tropfen ACSF über das Gehirn und überträgt es auf der Vibratom Kammer.
      HINWEIS: Bei der Vorbereitung sagittal, ist der Winkel der Plattform wichtig, damit eine Beschädigung der Dendriten der Pyramidenzellen während des Trennverfahrens.
3. Herstellung der Scheiben.
   1. Setzen Sie die Klinge über das Gehirn und entsorgen Sie die ersten 2,5 bis 3 mm. Regelung der Drehzahl und der Frequenz, um eine Beschädigung der Oberfläche der Scheibe, während gleichzeitig die Minimierung der Zeit für die Schneidverfahren erforderliche Maß zu beschränken.
   2. Stellen Sie die Dicke bis 300 μm und beginnen Schneiden. Wenn das Messer an der Hirnrinde weg, verwenden eine Rasierklinge oder eine gebogene Nadel über dem Hippocampus und an den Rändern des kortikalen Bereich von Interesse zu schneiden.
   3. Platzieren Sie die Scheiben in einer Multi-Well-Inkubationskammer bei 32 gehalten - 34 ° C.
   4. Ziehen Sie die Klinge, und wiederholen Sie Punkte 2.3.2 und 2.3.3 bis 5-8 Scheiben geschnitten werden. Die besten Scheiben sind in der Regel diejenigen, bei denen die Blutgefäße parallel zu der Oberfläche sind.
   5. Inkubiere die Scheiben für 30 min, nachdem die letzte Scheibe in der Kammer platziert.

3. Patch-Clamp-Aufnahmen von Schicht 5 Pyramidenzellen

1. Legen Sie eine Scheibe in der Aufnahme Kammer und die Suche nach gesunden Zellen. Diese Zellen haben in der Regel einen niedrigeren Kontrast, ein glattes Aussehen und sind nicht geschwollen.
2. Inspizieren die Scheibe unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung Linse und die Suche nach Zellen, in der Schicht 5, mit etwa 600 bis 1000 um von der Oberfläche des Gehirns befindet.
3. Sobald eine geeignete Zelle gefunden wird, Last ein Drittel der Mikropipette mit ICS und legen Sie sie in der heads.
4. Auf der persönlichen Computer mit dem Live-CD oder das vorkonfigurierte Linux-Betriebssystem, starten Sie eine Eingabeaufforderung (zB bash) und an seinem Eingabeaufforderung den Befehl lcg Null. Dies stellt sicher, dass die Messkarte wird nicht den Antrieb des Verstärkers.
5. Gelten 30-50 mbar Überdruck durch Drücken auf den Kolben der Spritze einen gemeinsamen, durch einen Schlauch mit der Pipettenhalter und, mit Hilfe des Mikroskops angeschlossen ist, den Pipetten etwa 100 um über der Scheibe.
   HINWEIS: Setzen Sie die Pipette in eine Position, die eine direkte Verbindung erlaubt es, die Zielzelle, vorzugsweise unter Verwendung des Ansatzes Modus des Mikromanipulator.
6. Acting auf die Kontrollen der Elektrophysiologie-Verstärker, stellen Sie die Pipette Offset und geben ein Testimpuls (10 mV) in voltage clamp Modus.
7. Reduzieren Sie den Druck um 10 bis 30 mbar (je nach Pipettengröße) durch Abziehen derKolben der Spritze; vorsichtig nähern die Zelle und prüfen, ob die Bildung eines Grübchens durch Beobachtung des Bildes auf der Videokamera-Monitor. Überwachen Sie den Testimpuls für eine Erhöhung der Widerstandsfähigkeit zu jeder Zeit, durch die Beobachtung der Stromwellenform auf dem Oszilloskop auf die Elektrophysiologie Verstärker angeschlossen angezeigt (alternativ können Sie den Befehl LCG-Siegel-Test verwenden, um die Pipette Widerstand zu überwachen).
8. Den Druck und gegebenenfalls schonend negativen Druck auf das Pipette Dichtungsbildung zu helfen, wenn man eine Erhöhung der Pipettenwiderstand und die Bildung eines "Grübchen" auf der Zell bemerken.
9. Während die Dichtung bildet, nach und nach die Haltepotential auf -70 mV zu verringern.
10. Einmal Gigaohm Dichtung erhalten wurde, sicherzustellen, dass der Haltestrom ist von 0 - 30 Pa. Gelten kurze Impulse von Unterdruck (Sog), um die Membran zu brechen und die Gesamtzellkonfiguration. Alternativ können Sie auch starke und kurze Impulse der Spannung zu injizieren ( dh mit dem Befehl "ZAP" am Verstärker oder Halten der Zelle bei sehr negativ), die Membran reißen, abhängig von der Vorbereitung und Glaspipette verwendet.
11. Wechseln Sie in den Stromzange Modus und überprüfen, ob das Ruhemembranpotential ist typisch für eine gesunde Zelle. Zum Rindenpyramidenneuronen eines Kalium-Gluconat-basierte Lösung, ist dieser Wert in der Regel zwischen -65 und -75 mV.

4. halbautomatische Charakterisierung der elektrischen Antworteigenschaften eines Neuron-

1. Erstellen Sie ein Verzeichnis, um Benutzerdaten zu speichern. Um diese beschäftigen die ein Skript in der LCG-Live-CD, die Ordner basierend auf dem Datum erstellt inbegriffen tun. Um es an der Eingabeaufforderung zu verwenden, geben Sie
   cd ~ / Experimente
   LCG-create-Experiment-Ordner -s psp, in_vivo_like
   Dies wird ein Ordner, in dem die Daten für diese Zelle gespeichert wird (und einen "psp" und "in_vivo_like" Unterordner) zu erstellen, und es wird sein Name mit dem Anschluss zu druckenFenster; es ist auch möglich, zusätzliche Informationen, wie beispielsweise Pipettenwiderstand und Zelltyp mit diesem Skript speichern.
2. Wechseln Sie in den neu erstellten Ordner mit dem Befehl
   cd ~ /
   Der Ordnername ist die von der Kommando LCG-create-Experiment-Ordner und den Zeitstempel des aktuellen Tages haben (dh Jahr-Monat-Tag) angezeigt, wie in 20140331A01.
3. Stellen Sie sicher, dass der Verstärker wird sich in Stromzange Modus zu betreiben, dass die Kabel angeschlossen und die externe Spannungsbefehl des Verstärkers, falls vorhanden, ist aktiviert.
4. Geben Sie den Befehl LCG-ecodeat die Eingabeaufforderung. Dies erfordert eine Reihe von Befehlen (nämlich LCG-AP, LCG-VI, LCG-Rampe, die LCG-tau und LCG-Stufen) verwendet werden, um grundlegende Reaktionseigenschaften der Zelle zu charakterisieren. LCG-ecode erfordert, dass der Benutzer festlegen, zwei Parameter: die Amplitude des 1 ms langen Stromimpuls verwendet, um eine einzelne Spitze in der Zelle hervorzurufen, und die maximale Amplitude des Strom ramp injiziert in die Zelle in ihren Rheobase finden.
   Verwenden Sie die folgende Befehlssyntax:
   LCG-ecode --pulse Amplitude X --ramp Amplitude Y
   mit einer Auswahl von den Werten X und Y (in pA), die ausreicht, um die Zelle zu Feuer in Reaktion auf ein 1 ms langen Puls und einer anhaltenden Injektion von Strom bzw. machen.
   Hinweis: Diese Protokolle erfordern die Durchführung der numerischen Schätzung der 'Elektrode Kernel', um die aktive Elektrode Kompensation (AEC) ¹⁵ zu verwenden. Eine lärmStromInjektion verwendet werden, um den Kernel zu schätzen, und der Benutzer wird aufgefordert, die Anzahl der Proben, die das Kernel vornehmen zu bestätigen. Siehe ¹⁵ für detaillierte Informationen über die Bedeutung der Elektrode Kernel und wie man die Anzahl der Kernel-Proben zu wählen.

5. Die Injektion von Leitfähigkeit durch Simulated Synapsen und Simulation von In-vivo-ähnliche Hintergrundaktivität

1. Die Injektion von simulierten erregende postsynaptische Potentiale
   1. Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie den nächsten Versuch zu retten, indem Sie den folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale:
      cd psp / 01
   2. Kopieren Sie ein LCG-Konfigurationsdatei in das aktuelle Verzeichnis und öffnen Sie sie mit einem Texteditor (Nano in diesem Beispiel), indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale (dieses Beispiel Konfigurationsdatei wird in den Quellcode und die Live-CD enthalten) :
      cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / epsp.xml
      nano epsp.xml
      Hinweis: Dies ist einfach eine Textdatei mit unterschiedlichen Einheiten miteinander verbunden sind. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.
   3. Bei Bedarf bearbeiten die inputChannel, Output die inputConversionFactor und die outputConversionFactor in dieser Datei die Umgebung des Benutzers zu entsprechen.
   4. Berechnen Sie die Elektrode Kernel benötigt, um die aktive Elektrode Kompensation durchzuführen ', die von LCG verwendete Methode, um einzelne Elektrode dynamische Klemmführen ", indem Sie den command
      LCG-Kernel
      Dies wird für die Anzahl von Punkten in der Kernel-Prompt. Auch hier wählen Sie eine Nummer, so dass die Elektrode Kernel deckt das Ende der exponentiellen Abfall Schwanz.
   5. Führen Sie die dynamische Clamp-Experiment mit dem Befehl
      LCG-experimentieren -c epsp.xml
   6. Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse mit dem Befehl
      ls -l
      LCG-Plot-Datei -f letzten
2. Die Injektion von simulierten hemmenden postsynaptischen Potentiale
   1. Erstellen Sie einen Ordner und kopieren Sie die Datei, um sie epsp.xml indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      cd ../02
   2. Bearbeiten Sie die Konfigurationsdatei mit einem Texteditor: Zum Ändern der synaptischen Umkehrpotential und Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des Modells Synapse Exp2Synapse auf die folgenden:
      Parameter>
      -80
      0,8 E-3
      10e-3
      
      Beenden Sie den Texteditor.
   3. Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
      LCG-Kernel
      LCG-experimentieren -c ipsp.xml
   4. Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
      ls -l
      LCG-Plot-Datei -f
3. Simulation von in vivo-ähnliche Hintergrundaktivität:
   1. Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie die folgenden Versuch zu retten, wie zuvor gezeigt, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Shell wollen:
      cd ../../in_vivo_like/01
   2. Kopieren Sie die Konfigurationsdatei von LCG Quellverzeichnis, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
      cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / in_vivo_like.xml
      nano in_vivo_like.xml
      Hinweis: Diese Datei ist einfach die Verkettung der früheren; zwei Poisson-Punkt-Prozesse, die Pulszüge, die wiederum ernähren hemmenden und erregenden Synapsen Modell, erzeugen die Hintergrundaktivität zu erzeugen.
   3. Passen Sie die DAQ-Konfigurationsparameter für das Setup des Benutzers, wie in 5.1.3 beschrieben, und beenden Sie den Editor.
   4. Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
      LCG-Kernel
      LCG-experimentieren -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
      Die '-n 10 "und" i 3' Schalter zeigen an, dass die Stimulation sollte 10 mal im Abstand von drei Sekunden wiederholt werden.
   5. Visualisieren Sie die rohen Spuren, die mit dem folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale:
      LCG-Plot-Datei -f alle

Ergebnisse

In den vorangegangenen Abschnitten haben wir beschrieben, wie die Software-Toolbox LCG verwenden, um die elektrophysiologischen Eigenschaften L5 Pyramidenzellen zu charakterisieren und in vivo-ähnliche synaptische Aktivität in einer Scheibe Vorbereitung neu zu erstellen. Die Verwendung einer Befehlszeilenschnittstelle und halbautomatische Protokoll begünstigen die Reproduzierbarkeit und Effizienz des Experiments, die einen großen Einfluss auf die Leistung und Qualität der produzierten Daten sammeln können...

Diskussion

In diesem Text eine vollständige Protokoll für die Durchführung von Echtzeit wurde mit geschlossener Schleife einzelne Zelle elektrophysiologischen Experimenten beschrieben, mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik und eine kürzlich entwickelte Softwaretools genannt LCG. Um die Qualität der Aufnahmen zu optimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Aufnahme-Setup ordnungsgemäß geerdete, geschirmte und vibrationsfrei sein: Damit wird sichergestellt, stabilen und dauerhaften Ganzzell-Zugriff auf die Zelle, die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue slicer	Leica	VT-1000S
Pipette puller	Sutter	P-97
Pipettes	WPI	1B150F-4	1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table	TMC	20 Series
Microscope	Leica	DMLFS	40X Immersion Objective
Manipulators	Scientifica	PatchStar
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	Computer controlled
Data acquisition card	National Instruments	PCI-6229	Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer	Dell	Optiplex 7010 Tower	OS: real-time Linux
Oscilloscopes	Tektronix	TDS-1002
Perfusion Pump	Gibson	MINIPULS3	Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller	Multichannel Systems	TC02	PH01 Perfusion Cannula
Manometer	Testo	510	Optional
Incubator	Memmert	WB14
NaCl	Sigma	71376	ACSF
KCl	Sigma	P9541	ACSF, ICS
NaH2PO4	Sigma	S3139	ACSF
NaHCO3	Sigma	S6014	ACSF
CaCl2	Sigma	C1016	ACSF
MgCl2	Sigma	M8266	ACSF
Glucose	Sigma	G7528	ACSF
K-Gluconate	Sigma	G4500	ICS
HEPES	Sigma	H3375	ICS
Mg-ATP	Sigma	A9187	ICS
Na2-GTP	Sigma	51120	ICS
Na2-Phosphocreatine	Sigma	P7936	ICS