Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Zusammenfassung

Die Protokolle beschreiben zwei In-vitro-Testsysteme Entwicklungstoxizität (UKK und UKN1) auf der Grundlage humaner embryonaler Stammzellen und Transkriptom-Studien. Die Testsysteme voraussagen menschlichen Entwicklungstoxizität Gefahren und kann dazu beitragen, Tierversuche, die Kosten und die Zeit für die Stoffsicherheitstests zu reduzieren.

Zusammenfassung

Effiziente Protokolle für die menschliche pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Geweben in Kombination mit differen -omics Technologien eröffnet neue Horizonte für in-vitro-Toxizitätsprüfung von potentiellen Medikamenten. Um eine solide wissenschaftliche Grundlage für solche Tests liefern, wird es wichtig sein, um quantitative Informationen über den zeitlichen Verlauf der Entwicklung und auf die zugrunde liegenden Regulationsmechanismen durch die Systembiologie zu gewinnen. Zwei Tests wurden daher hier für diese Anforderungen abgestimmt. In der UKK-Test-System werden menschliche embryonale Stammzellen (hESC) (oder anderen pluripotenten Zellen) links nach spontan differenzieren für 14 Tage in embryonale Körper, um die Erzeugung von Zellen aller drei Keimblätter zu ermöglichen. Dieses System rekapituliert Schlüsselschritte der frühen embryonalen Entwicklung, und es kann humanspezifischen frühen embryonalen Schädigung / Teratogenität vorherzusagen, wenn Zellen auf Chemikalien während der Differenzierung ausgesetzt. Die UKN1 Testsystem basiert auf hES bezogen auf einen Differen populatIonen neuroektodermalen Vorläufer (NEP) Zellen für 6 Tage. Dieses System rekapituliert frühen neuronalen Entwicklung und prognostiziert frühen Entwicklungsneurotoxizität und epigenetische Veränderungen durch Chemikalien ausgelöst. Beide Systeme in Kombination mit Transkriptom Mikroarray Studien eignen sich zur Identifizierung von Biomarkern Toxizität. Darüber hinaus können sie in Kombination verwendet, um Daten für die Systembiologie Analyse zu erzeugen. Diese Testsysteme haben Vorteile gegenüber den traditionellen toxikologische Untersuchungen, die große Mengen an Tieren. Die Testsysteme können zu einer Verringerung der Kosten für die Wirkstoffentwicklung und chemische Sicherheitsbewertung beitragen. Ihre Kombination beleuchtet vor allem auf Verbindungen, die Entwicklung des Nervensystems gezielt beeinflussen können.

Einleitung

Die Fähigkeit von menschlichen embryonalen Stammzellen (hESC) in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren, eine neue Ära der In-vitro-Toxizitätstests ^1, Krankheitsmodelle und der regenerativen Medizin ² eröffnet. Die Stammzellen werden mit der Fähigkeit, selbst zu replizieren, um ihre pluripotenten Zustand zu halten und sich in spezialisierte Zellen ^3,4 unterscheiden dotiert. Die Eigenschaften der hESC (Fähigkeit, zu allen wichtigen Zelltypen differenzieren) werden auch in anderen menschlichen pluripotenten Stammzellen, wie Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) oder Zellen, die durch Kerntransfer erzeugt ⁵ gefunden. Zum Beispiel haben viele verschiedene Linien hESC in Neuronen ^6, Nierenzellen ^7, Neuralleistenzellen ^8, Kardiomyozyten ^9-12 oder Leberzellen wie Zellen ^13,14 differenziert. Darüber hinaus kann hESC spontan in Zellen aller drei Keimblätter ^15-18 in Embryoidkörpern (EBS) ^19,20 unterscheiden. Early embryonalen Entwicklung durch unterschiedliche Expression verschiedener Gene zu den verschiedenen Keimblätter, die auf mRNA-Ebene durch Transkriptomik mit Microarray-Technologie ¹⁵ aufgenommen wurde, im Zusammenhang geregelt. Diese Bemühungen führten zu der Gründung der Organspezifische toxikologische Modelle auf Basis von hESC / hiPSC und Transkriptom-Analyse (für einen Überblick siehe ^21,22). Diese Modelle haben Vorteile gegenüber der traditionellen Verwendung von Versuchstieren für toxikologische Untersuchungen, wie präklinische Studien mit Labortieren sind nicht immer prädiktiv für die Sicherheit der Menschen. Das Medikament induzierte Toxizitäten bei Patienten angetroffen werden oft metabolische oder Signalprozesse, die zwischen Menschen und Versuchstieren unterscheiden verwandt. Die Spezies Unterschied hat die zuverlässige Früherkennung von Entwicklungstoxizität beim Menschen verhindert und zum Beispiel Arzneimittel, wie Thalidomid ^23,24 und ^25,26 Diethylstilbestrol wurden aus dem Markt aufgrund Teratogenität zurückgezogen. ThaliDomide hat keine Entwicklungstoxizität bei Ratten und Mäusen gezeigt. Umweltchemikalien wie Methylquecksilber ²⁷ resultierte in der pränatalen Entwicklungstoxizität in Bezug auf das Nervensystem in verschiedenen Arten, aber menschlichen Erscheinungsformen sind schwer zu in Tiere. Um das Problem der Spezies-Spezifität Probleme anzugehen, Wissenschaftler, die im Rahmen verschiedener Projekte auf Basis von Stammzellen wie ReProTect, ESNATS, Detektiv etc. sind in die Entwicklung der verschiedenen Modelle für embryonale Toxizität, Neurotoxizität, Kardiotoxizität, Lebertoxizität und Nephrotoxizität mit menschlichen Giftstoffe zu vermuten engagiert Auswirkungen auf den Menschen. Im Rahmen des europäischen Konsortiums Projekt "embryonalen Stammzellen-basierten Roman alternativer Test (ESNATS)" fünf Testsysteme wurden eingerichtet. Ein Testsystem die sogenannte UKK (U niversitäts k linikum K ÖLN) Testsystem zum Teil erfasst frühen embryonalen Entwicklung. In diesem system menschlichen embryonalen H9-Zellen werden in drei Keimblätter (Ektoderm, Entoderm und Mesoderm) ¹⁵ und Keim spezifischen Signaturen von Transkriptomik gefangen genommen worden Profile mit Hilfe der Affymetrix-Microarray-Plattform unterschieden. Verschiedenen Entwicklungsgiftstoffen wie Thalidomid ^28, Valproinsäure, Methylquecksilber ^16,17 oder Cytosinarabinosid ¹⁵ haben in diesem System getestet und Giftstoff spezifische Gen-Signaturen erhalten wurden. In einem zweiten Testsystem, das so genannte UKN1 (U NIVERSITÄT K onsta n z) Testsystem 1 werden H9-Zellen zu neuroektodermalen Progenitorzellen (NEP) für 6 Tage differenziert. Dies wird durch eine hohe Expression der neuronalen Marker-Gen wie PAX6 und OTX2 belegt. Während der Differenzierung für 6 Tage wurden NEP-Zellen zu Entwicklungsneurotoxisch, wie VPA, Methylquecksilber ausgesetzt. Giftstoff spezifische deregulierten Transkriptomik Profile wurden obtainiert als auch mit Hilfe der Affymetrix-Microarray-Plattform ^16,29.

Die neue Vision für die Toxikologie des ^21. Jahrhunderts sieht vor, dass Testsysteme nicht nur zu erhalten phänotypische Beschreibungen wie Histopathologie in vivo oder Transkriptom Änderungen am Ende des langfristigen Giftstoff Inkubationen. Vielmehr legt nahe, dass Assays stellen mechanistische Informationen ^3, und dass diese Informationen, so genannte abgebildet werden negative Ergebnis Wegen (AOP), die eine wissenschaftliche Begründung für den Ex-Effekte ³⁰ bereitzustellen. Um solche Informationen zu liefern, haben die zur Prüfung verwendeten Systeme werden in hohem Grade Qualität kontrolliert ^31, wie beispielsweise durch robuste Standardarbeitsanweisungen dokumentiert. Darüber hinaus müssen die zeitabhängigen Änderungen mit hoher Auflösung abgebildet werden. Dies erfordert Testsysteme mit synchronisierten Änderungen ^32. Die hier beschriebenen UKN1 und UKK-Test-Systeme für diese Anforderungen optimiert.

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Protokoll

Das folgende Protokoll wurde unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9. Diese Zelllinie wurde routinemäßig auf mitotisch inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) in hESC Kulturmedien mit bFGF ergänzt und anschließend in der Stammzell Medien kultiviert auf 6 cm Petrischalen mit Basalmembranmatrix beschichtet wie Matrigel, um von MEFs loszuwerden kultiviert. Die H9-Zellen von> 80% konfluente Platten wurden für weitere Passage verwendet. H9-Zellen auf Basalmembranmatrix Platten kultiviert wurden EBs Bildung verwendet. Alle in dem folgenden Protokoll genannten Maßnahmen durchgeführt haben mit Standardmethoden für die aseptische und gute Zellkulturpraxis.

Teil 1. UKK-Test-System

1. menschlichen embryonalen Stammzellen Kultivierung

1. Splitting und Wartung von H9 auf Feeder-Zellen
   1. Pipette 2 ml 0,1% Gelatine in jede 6 cm Platte und Inkubation für 30 min in der Zellkultur Incubator (37 ° C und 5% CO _2). Saugen Sie Gelatinelösung mit sterilem Pasteurpipette.
   2. 2 ml MEF Medium, das 0,1 x 10 ⁶ MEF Zellen / ml in die beiden Gelatine-beschichteten Platten und inkubiert sie in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ O / N.
   3. Am nächsten Tag, entfernen Sie die H9-Zellen Fläschchen aus dem flüssigen Stickstoff Vorratsbehälter mit einer Pinzette und tauen Sie das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad mit langen Pinzette.
   4. Küvette aus Wasserbad, Bad mit 70% Ethanol, der Luft trocknen in der Biosicherheitswerkbank für 15 bis 30 Sekunden und übertragen Sie die Zellen zu 15 ml Falcon-Röhrchen.
   5. Hinzuzufügen 9 ml H9 Kulturmedium langsam auf der Innenwand und zentrifugiert, die Zellen bei 200 g für 5 min.
   6. Den Überstand aspirieren und wieder die Zellen in 6 ml Kulturmedium, das ROCK-Inhibitor (10 uM, Y27632) und sanft Pipette zu mischen. Saugen Sie MEF Medium von der Platte 6 cm und 3 ml Zellsuspension in jede Platte. Ändern Sie das Medium auf day 3 und dann jeden zweiten Tag. Subculture> 80% konfluenten Platte Zellen mit Splitverhältnis 1: 3.
      Hinweis: In der Regel in 5 bis 7 Tagen Platte wird konfluent. Feeders Verwendung von CF1-Mäuse Embryonen erhalten und durch Exposition gegenüber Strahlung inaktiviert γ.
2. H9 Zellkultivierung auf Basalmembranmatrix beschichteten Platten
   1. Thaw Stammzellenmedium (5x) Zuschlag bei RT und 100 ml in 400 ml Basismedium in Biosicherheitswerkbank.
   2. Thaw Basalmembranmatrix auf Eis. Fügen vorgeschlagen Volumen Basalmembranmatrix (siehe Analysenzertifikat für jede Charge) in 24 ml gekühlte DMEM / F-12 Basismedium für zwölf 6 cm Platten. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
   3. 2 ml je 6 cm Platte. Halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Entfernen Sie das Medium und 2 ml der Stammzellmedium.
   4. Nehmen Sie vier konfluenten H9 Platten auf MEFs. Entfernen Sie die differenzierte Kolonien mit 1 ml Pipettenspitze unter Stereomikroskop in Biosicherheitswerkbank gehalten.
   5. Aspirierendas Medium und waschen Sie die Zellen mit 4 ml PBS und fügen Sie 2 ml Zellmedium in jeder Platte einzudämmen. Schneiden Sie die undifferenzierte Kolonien mit 26 G Nadel, um 6 bis 9 je Stück.
   6. Vorsichtig sammeln die Zellen in 50 ml Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min.
   7. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 12 ml Zellmedium einzudämmen. Zählen Sie die Klumpen, indem 20 & mgr; l auf Glasobjektträger unter dem Mikroskop und die Lautstärke für 150 Klumpen pro ml. 2 ml Suspension in jedem 6 cm Platte.
   8. Bewegen Sie die Teller hin und her und von Seite zu Seite Bewegung für eine gleichmäßige Verteilung Klumpen und Inkubation der Platten in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO _2).
   9. Entfernen Sie die differenzierte Kolonien und geben Mediumwechsel jeden zweiten Tag.

2. Embryoid Bodies (EBs) Bildung

Führen Sie alle unten nach aseptischen Bedingungen und in der Biosicherheitswerkbank genannte Verfahren.

1. Tag 0 & #8212; Beschichtung von H9-Zellen auf V Bodenplatten
   1. Bereiten Sie 5% Blockcopolymer, wie Pluronic F 127 in PBS und filtriert durch Vakuum angetrieben Filtersystem mit 0,22 um Sterilfilter.
   2. Coat V Boden 96-Well-Platten mit 40 ul 5% Blockcopolymer pro Well und Inkubation bei Raumtemperatur für 45 min.
   3. Entfernen Sie die konfluenten Basalmembranmatrix Platten mit H9-Zellen von Inkubator und entfernen Sie die differenzierte Kolonien mit 1 ml Pipettenspitze unter Stereomikroskop in Biosicherheitswerkbank.
   4. Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 4 ml PBS. 2 ml Zufallsdifferenzierungsmedium (H9 Kulturmedium ohne bFGF, RD-Medium) in jeder Platte. Verwenden Gang Werkzeug und schneiden Sie die H9 Zellkolonien in Klumpen von einheitlicher Größe und Form durch Beobachtung unter Stereomikroskop in Biosicherheitswerkbank und dann sanft kratzen mit dem Zellschaber.
   5. Sammeln Sie die Klumpen in 50 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren die cell in RD mittlere bis 1.000 Klumpen pro ml zu erhalten.
   6. Saugen Sie das Block-Copolymer aus V Bodenplatten. Gießen Sie die Klumpen in sterile quadratische Platte und mit Hilfe der Mehrkanalpipette 100 l Suspension in jede Vertiefung V Bodenplatte.
   7. Für die Kraft Aggregation von Klumpen Zentrifugation der V-Boden-Platten bei 4 ° C für 4 min bei 400 x g. Platten in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ inkubieren für vier Tage.
2. Tag 4 - Sammlung von EBs
   1. Sammeln Sie die EBs in der sterilen quadratische Platte von V Bodenplatten mit Mehrkanalpipette und weite Bohrung 200 ul Tipps.
   2. Sammeln Sie die EBs aus sterilen quadratische Platte in 15 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml sterile serologische Pipette. Lassen Sie EBs zu 2 min zu begleichen. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die EVG mit 5 ml PBS.
   3. Lassen Sie EBs zu 2 min absetzen und saugen Sie den Überstand. Re-suspend EBs in 5 ml Medium RD.
   4. Pipette aus 10 ml Medium in RD 10 cmbakteriologischen Platten. Übertragen Sie die EVG in 10 cm bakteriologischen Platten.
   5. Inkubieren bakteriologischen Platten auf Horizontalschüttler (Hin- und Herbewegung 50 / min) in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ für die erforderliche Zeitdauer gehalten wird. Geben Mediumwechsel (15 ml Medium RD) jeden zweiten Tag.
      Hinweis: Schonende Behandlung erforderlich ist, während die Kultivierung hESCs. Die Größe variiert EBs an Tag 4. Wählen Sie die einheitliche Größe EBs (± 20%) durch die Beobachtung unter Stereomikroskop für weiteres Experiment. Etwa 50% EBs mit diesem Verfahren gebildet werden, sind von einheitlicher Größe. Die Übertragung der EVG am Schüttler Ergebnisse in einheitlicher Form.

3. Zytotoxizitätstest für IC ₁₀ Bestimmung

1. Transfer von EBs auf Platten mit transparentem Boden
   1. Auftauen 0,1% Gelatine in einem Wasserbad bei 37 ° C für 15 min und Mantel Platten mit transparentem Boden mit 50 ul 0,1% Gelatine pro Vertiefung mit Mehrkanalpipette. Die Platten bei Raumtemperatur inkubieren45 min. Nach der Inkubation aspirieren die Gelatine aus Platten mit transparentem Boden.
   2. Nehmen Sie die an Tag 4 in 10 cm-Platte, die bakteriologische RD Medium gesammelt EBs.
   3. Halten Sie Platten mit transparentem Boden in Schräglage in Biosicherheitswerkbank. Transfer zwei einheitliche Größe von EBs in 100 ul RD Medium pro Vertiefung in optischen unteren Platte mit 96 Vertiefungen durch Beobachtung unter Stereomikroskop. Halten Sie ^12-ten Spalte leer.
   4. Platten in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ inkubieren 24 hr.
2. Arzneimittelexposition von Tag 5 bis Tag 14
   1. Wiegen Sie die Testverbindung und stellen höchste Konzentration auf bekannte Lösungsmittel.
   2. Führen Halb logarithmische Verdünnung der Testverbindung in Serie bis 8 Verdünnungen in dem Lösungsmittel Falcon-Röhrchen mit A bis H nummerierte enthält, halten Rohr nicht. I wie Fahrzeugkontrolle, Rohr Nr. J als Negativkontrolle (RD mittel) und Rohr nicht. K als positiv (70% Ethanol) Kontrolle.
   3. Auftauen RD mittel Wasserbad bei 37° C für 15 min. Nehmen Sie 5 ml Medium RD jeweils in 11 sterile Falcon-Röhrchen von 1 bis 11 beschriftet.
   4. Transfer 5 ul-Lösung von Rohr zu Rohr A K in dem Rohr 1 bis 11 jeweils und Vortex die Rohre. Nehmen Sie das optische Bodenplatte aus dem Inkubator und entfernen Sie vorsichtig die Medien mit der Nutzung der Mehrkanalpipette.
   5. Fügen Sie 200 ul Medium aus Rohrnummer 1 bis 11 in die jeweiligen Spalten der optischen Bodenplatte. Geben Sie jeden zweiten Tag mittel / Drogen Veränderung.
      Hinweis: Für die halb logarithmische Verdünnungen nehmen 6,48 ul Lösungsmittel in 7 Röhren von 2 bis 8 beschriftet Von höchste Konzentration Rohr no.1 Transfer 3 ul zu Rohr no.2, Wirbel und seriell übertragen 3 ul zum nächsten Rohr. Halten Sie Rohr no.9 zur Fahrzeugsteuerung und Rohr Nr.10 für Negativkontrolle. Rohr no.11 ist 70% Ethanol.
3. Tag 14: Resazurin Belichtung und Fluoreszenzmessung
   1. Tau-RD-Medium in einem Wasserbad bei 37 ° C für 15 min. Führen Sie alle Verfahren mention unten in Abwesenheit von Licht in der Biosicherheitswerkbank.
   2. Nehmen Sie 10 ml RD Medium in 15-ml-Röhrchen (A) und der empfohlenen Volumen von Resazurin Reagenz und mischen durch Pipettieren. Nehmen Sie das optische Bodenplatte aus dem Inkubator und alle Medium mit Mehrkanalpipette vorsichtig entfernen.
   3. Geben Sie 100 ul Medium aus Rohr A in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ für 90 min.
   4. Messen Sie die Fluoreszenz unter Verwendung Spektralphotometer (560 _Ex / 590 _Em).
4. IC ₁₀ Wert-Bestimmung
   1. Importieren Sie die Werte im Graph Pad Prism nach Abzug der Blindwerte. Set x-Achse als eine Dosis und y-Achse als Fluoreszenzeinheiten.
   2. Normalisieren die Werte in Prozent auf der y-Achse zu erhalten und zu transformieren die Werte (x-Achse als logarithmische Skala). Berechnen _IC50-Wert unter Verwendung von Dosis-Wirkungs-sigmoidal (variable Steigung) Parameter. Berechnen log IC ₁₀ Werte mit Hilfe folgenderGleichung:
      F = 10 ₅₀ = logEC logECF - (1 / Hang) * log (F / (100-F))
      Y = Bottom + (Oben-Unten) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * Hang))
   3. Bestimmen Sie die IC ₁₀ Werte für weitere Untersuchungen entnommen werden.

4. Biomarker-Studie Basierend auf Microarrays

1. Tag 0 bis Tag 5:
   1. Embryoidkörper Bildung und Transfer zum 10 cm bakteriologischen Platten - folgen Sie den in Punkt 2 für Embryoidkörper Bildung genannten Schritte.
      Hinweis: Verwenden Sie drei biologischen Wiederholungen für jede Studie. Unterteilen Sie jede biologische Replikation in zwei Teile - Medikamentöse Behandlung bei IC ₁₀ Konzentration und Fahrzeugsteuerung. Bereiten Wirkstoffkonzentration 10000-fach über dem IC ₁₀ Konzentration im Fahrzeug und von diesem Add 10 ul bis 100 ml RD Medium mit H9 Zellklumpen in 50 ml-Eppendorf-Röhrchen gut mischen und Samen auf V Bodenplatten. Folgen Sie dem gleichen Verfahren für die Vehikel-Kontrollgruppe.
2. Für Arzneimittelexposition an Tag 5 bis 14, sammelt die EB's und übertragen sie in 10 cm bakteriologischen Platten am Tag 4 nach den in Punkt genannten Schritte 2. Transfer die Platten auf Horizontalschüttler (Hin- und Herbewegung 50 / min) in Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO ₂₎ für 14 Tage. Geben Sie jeden zweiten Tag Mediumwechsel.
3. Für die Probenentnahme an Tag 14, sammelt die EBs aus 10 cm-Platten in 15 ml Falcon-Röhrchen mit sterilen serologischen Pipette. Lassen Sie EBs zu 2 min zu begleichen. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die EVG mit 5 ml PBS. Lassen Sie EBs zu 2 min absetzen und saugen Sie den Überstand. Re-suspend EBs in 1 ml RNAlater Lösung oder Trizolreagenz, Wirbel und lagern Sie die Probe bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung.
   Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in Biosicherheitswerkbank nach guter Laborpraxis. Drehen Sie die Platten in Kreisbewegung um das Zentrum, um alle EBs in Zentrum von umgebenden mit Hilfe von sterilen Glas pastu bringen, saugen das Mediumre Pipette 15 ml RD Medium und fügen Sie dann 15 ul Arzneimittel / Träger für jeweils eine Gruppe.

5. RNA-Isolierung und Integritätstest

1. RNA-Isolierung:
   Die meisten der nachfolgend genannten Schritte sind für die RNA-Reinigung unter Verwendung von RNeasy Mini Kit nach der Anleitung durchgeführt werden. Verwenden Sie immer nukleasefreiem Rohre, Pipettenspitzen und Wasser. Während der Arbeit mit TRIzol führen alle Verfahren in der chemischen Schutzhaube und Schutzbrille sowie Chemikalienschutzhandschuhe.
   1. Tauen Sie die Proben auf Eis. Wenn die Proben in RNAlater Lösung gelagert Zentrifugation der Röhrchen bei 12.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Überstand verwerfen und 1 ml Trizolreagenz.
   2. Man reibt die Proben mit 24 G Nadel und 1-ml-Spritze. Etwa 15 mal Verreiben reicht für Störung der EBs, Zellwand und Plasmamembranen.
   3. Fügen Sie 200 ul Chloroform in jeder Probe. Vortex, um den Inhalt gleichmäßig zu mischen. Zentrifugebei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Nehmen Sie die RNeasy Mini-Spinsäulen, 1,5-ml-Röhrchen und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.
   4. Sammeln Sie den Überstand in 1,5-ml-Röhrchen (Während das Sammeln Stand nicht den mittleren oder unteren Schicht zu stören). Hinzuzufügen gleichen Volumen von gekühltem 70% Ethanol. Mischen Sie den Inhalt durch leichtes Schütteln.
   5. Apply 700 ul aus den Rohren zu entsprechenden Mini-Spinsäulen und zentrifugieren bei 12.000 · g für 20 s bei Raumtemperatur. Führen Sie alle weiteren Schritte bei RT.
   6. Entsorgen Sie das Filtrat und gelten verbleibende Lösung den jeweiligen Spalten und zentrifugieren bei 12.000 · g für 20 sec. Filtrat verwerfen.
   7. Apply 350 ul RW1-Puffer auf die Säule und zentrifugieren bei 12.000 · g für 20 sec. Entsorgen Sie das Filtrat und gelten 10 ul DNAse und 70 ul RDD Puffer auf die Säule.
   8. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Apply 350 ul RW1-Puffer auf die Säule und zentrifugieren bei 12.000 · g für 20 sec. Filtrat verwerfen. Gelten 500 ulRPE Waschpuffer in der Säule und zentrifugieren bei 12.000 · g für 20 sec. Filtrat verwerfen. Wieder Apply 500 ul RPE-Waschpuffer auf die Säule und zentrifugieren bei 12.000 × g für 2 min. Filtrat verwerfen.
   9. Verschieben Sie die Spalten, neue 2 ml Sammelröhrchen und zentrifugieren bei 12.000 · g für 1 min. Übertragen Sie die Spalten, um markierte 1,5 ml Sammelröhrchen und anwenden 22 ul Nuklease-freies Wasser. Zentrifugieren der Röhrchen bei 12.000 × g für 1 min.
   10. Entfernen Sie das Sammelröhrchen und setzte sie auf Eis. Quantifizieren RNA mit automatisierten Elektrophorese-System.
2. RNA-Konzentration, Reinheit und Integritätstests.
   Für die RNA-Reinheit und Integrität testen Verwendung automatisierten Elektrophorese-System und den jeweiligen Kit ^33.

6. Microarray-Studien

1. Führen Transkriptionsprofilierung mit handelsüblichen Personal Array-Chips. Für die RNA-Zielpräparation, Fragmentierung, Hybridisierung ³⁴ und ArrayChip-Färbung, Waschen ³⁵ Verwendung kommerziell erhältlichen Kits.
2. Führen Sie Array-Chip Scannen und Qualitätskontrolle mit Hilfe von Standard Fluidik Station, Array-Scanner und Standard-Betriebs Software ^36. Für die Genexpressionsanalyse importieren die von Scannern an den handelsüblichen verfügbaren Software ³⁷ erzeugten Dateien, führen Sie eine Hintergrundkorrektur, Verdichtung und die Normalisierung mit Robust Multiarray Analysis (RMA).
3. Zum Erhalt Liste differentiell exprimierte Gene (DEG) führen Sie eine ANOVA-Analyse. Aus dieser Liste filtern, die Gene auf der Basis des fache Veränderung (± 2) und FDR-gesteuerte p-Wert (<0,05). Besorgen Sie sich die Hauptkomponentenanalyse (PCA), Heat Map etc. mit dieser Software.

Teil 2. UKN 1-Testsystem

1. Wartung von hESC

1. Aussaat von MEFs
   1. Für die Differenzierung verwenden NSCB # 8534 (H9) Zelllinie. Kultur cells auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) als Feeder-Zellen. Mantel T25-Flasche mit 4 ml 0,1% Gelatine und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
   2. Thaw MEFs in 37 ° C-Wasserbad und übertragen Sie die Zellen in vorgewärmten DMEM / 10% FBS.
   3. Spin 3,5 min mit 500 × g Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen auf 1 × 10 ⁷ Zellen / ml zu erhalten. Platte MEFs 4 x 10 ⁴ / cm ² in T25-Kolben auf Gelatine. Optional können Sie die MEFs für die nächsten zwei Tage. Qualität der MEF Chargen sind ein sehr wichtiges Thema für hESC Wartung. Daher empfiehlt es sich, das beste Unternehmen und Herstellungsverfahren für die H9-Zellen aufzuklären. Wir verwenden PMEF P3.
2. Splitting und Wartung von H9
   1. 1 ml vorgewärmten Dispase pro T25-Kolben H9 und inkubieren 9 min bei 37 ° C.
   2. 2 ml Waschmedium zu behandelnden Zellen und Pipette 5 mal nach oben und unten mit 5 ml-Pipette und Transfer Zell-Lösung in eine Falcon-Röhrchen Dispase.
   3. Der Kolben abwaschen mit 9 ml Waschmediumund fügen Sie Zellen zu den anderen. Spin 3,5 min bei 500 · g, zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 10 ml Medium hESC.
   4. Spin 3,5 min bei 500 · g, zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 4 ml hESC Medium. 0,5 ml Zellsuspension und 4,5 ml hESC mittleren und Platte in einem neuen (PBS) T25-Kolben mit MEFs. Ändern Sie jeden Tag ganze hESC Medium (5 ml) des Kolbens.

2. Differenzierung von hESC in Richtung Neuroektodermale Progenitorzellen (NEP)

1. Bereiten hESC mittleren und KCM Medium. Coat einer 10 cm Schüssel mit Gelatine (0,1% in PBS) pro T25-Kolben und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Entfernen Sie Medium aus hESC und fügen Sie genug Accutase, um die ganze Boden des Kolbens (1 ml pro T25-Kolben) abdecken und inkubieren Sie 25 bis 30 Minuten bei 37 ° C.
2. Vorbereitung Basalmembranmatrix beschichteten Platten während Accutase Inkubation. In kaltem DMEM / F12, um gefrorene Basalmembranmatrix Pellet und lösen es 01.20 Uhr. Filter Basalmembranmatrix Lösungention durch ein 40 & mgr; m Zellsieb. In filtrierte Lösung auf die Platte, hat die gesamte Unterseite abgedeckt werden (1 ml pro 6-well ist erforderlich) und Inkubation für 2 Stunden bei RT.
3. Nach der Inkubationszeit entfernen Basalmembranmatrix Stand und Samenzellen auf den beschichteten Vertiefungen. Nach Accutase Schritt (2.1) zu stoppen Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml HES Medium. Kratzen Zellen aus dem Kolben, 8 ml hESC mittleren und erzeugen eine einzelne Zelle Lösung durch Pipettieren mit 10 ml Pipette gründlich. Filterzellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb.
4. Spin-Zellen 3 min mit 500 · g, zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 10 ml hESC. Spin Zellen wiederum 3 min mit 500 · g, Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in hES enthaltenden ROCK Inhibitor Y-27632 in einer Endkonzentration von 10 uM.
5. Überstand entfernen Gelatine beschichtete Schale. Plattenzellsuspension auf Gelatine beschichtete Schale, um die MEFs zu entfernen und in den Inkubator für genau 1 Stunde.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt wird die MEFs sEttle auf die Gelatine beschichtete Platte, während die hESC nicht zu Gelatine zu befestigen. Deshalb ist dies von entscheidender Bedeutung, um eine Zuführung freien Differenzierung zu erhalten. Es ist ein kritischer Schritt, da zu lange Inkubation ergibt hES Klumpen und zu kurzen Inkubation in ineffiziente Entfernung von MEFs. Nach 45 min Inkubation sollte die Platte bereits niedergelassen MEFs und hESC Klumpen untersucht werden.
6. Wenn die MEFs wurden angebracht, vorsichtig waschen nicht anhaftende Zellen (hESC) off nach der Inkubation mit dem Medium bereits in der Platte. Wenn mehrere T25 wurden verwendet, um mehr Zellen zu bekommen, nun einzelne Zellen können kombiniert werden. Einmal zu waschen Teller mit hESC Medium.
7. Schleuderzellen 3 min mit 500 · g, Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in ungefähr 4 ml KCM, enthaltend 10 uM ROCK Inhibitor Y-27632 und 10 ng / ml FGF-2.
8. Zählen von Zellen in einem Hämocytometer unter Verwendung von Trypanblau. Platte 18 x 10 ³ Zellen / cm ² auf Basalmembranmatrix beschichteten Platten in KCM, enthaltend 10 & mgr; M Inhibitor ROCK Y-27632 und10 ng / ml FGF-2 (6 auch verwendet 1,5 ml pro Vertiefung). Es ist entscheidend, um die Zellen in der richtigen Dichte der Platte, um sie erfolgreich in NEPs unterscheiden.
9. Nach 24 Stunden wechseln Medium an die frische KCM, das 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor Y-27632 und 10 ng / ml FGF-2. Nach weiteren 24 Stunden, ändern Medium an die frische KCM, das 10 ng / ml FGF2.
10. 72 Stunden nach dem Aussäen der Zellen beginnt die Differenzierung durch Mediumwechsel in Richtung KSR Medium. Dieser Zeitpunkt wird als Tag der Differenzierung 0 (DoD0) bezeichnet. Der Zusatz von Testsubstanzen ist nun möglich.
11. Auf DOD1 und DOD2 das Medium genau wie auf DoD0 geändert. Weiter Mediumwechsel ist bei DoD4 die 25% N2-S und 75% KSR. Bei DoD6 die Differenzierung gestoppt und die Zellen werden für die Analyse entnommen.

3. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von hESC und NEP

1. Herstellung der Kerne
   1. Fügen Sie 500 ul Accutase jedem 6 gut, die untersucht werden sollten und Inkubation für 25 bis 30 min. Count-Zellen in einer Neubauer-Kammer unter Verwendung von Trypanblau.
   2. Die Zellen in 1% Formaldehyd in DMEM / F12 für vernetzen. Hinzuzufügen Tris pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 125 mM nach 10 min auf die Vernetzungs stoppen.
   3. Schleuderzellen 3 min mit 500 × g bei 4 ° C, Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in kaltem PBS.
   4. Schleuderzellen 3 min mit 500 × g bei 4 ° C, Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in 1 ml Puffer L1- / 1 x 10 ⁶ Zellen.
   5. Inkubation für 5 min auf Eis. Spin 5 min mit 800 × g bei 4 ° C, Überstand abnehmen und resuspendieren Kerne in 1 ml Puffer L2- / 2 × 10 ⁶ Zellen.
2. Beschallung und Qualitätskontrolle
   1. Ultraschall behandeln, so dass DNA-Fragmente von 300-700 bp Länge erzeugt werden. Spin 1 min mit 10.000 × g bei 4 ° C. Überstand in ein neues Röhrchen. Die Bruchstücke müssen die richtige Größe haben, sonst wird die Immunfällung wird ineffizient sowie die qPCR gefolgt sein.
   2. Entfernen Sie 50 ul eined Mischung mit 50 ul L2-Puffer, um die Effizienz der Ultraschallbehandlung durch Ausführen eines Agarose-Gel zu überprüfen.
   3. Umgekehrte durch Inkubation bei 65 ° C für 4 Stunden und 500 Upm vernetzt. Last Proben 1: 5 mit Orange G Ladefarbstoff auf einem 1,5% Agarose-Gel, und führen Sie 45 Minuten bei 110 V in 1x TBE-Puffer. Steuerfragmentgröße (sollte zwischen 300-700 bp).
3. Chromatin Immunopräzipitation
   1. Verdünnte Proben 1: 5 in Verdünnungspuffer und 1 ml Aliquot pro IP in silikonisierten Röhrchen.
   2. Entfernen Sie 5% (Volumen) von verdünnten Chromatin Probe (Schritt 3.3.1) und bei 4 ° C als "Input".
   3. Proben inkubieren mit Antikörpern, die Sie wünschen und mit unspezifischen IgG O / N bei 4 ° C auf einem Rotator.
   4. In 50 ul Protein-A / G Sepharosekügelchen zu jeder Probe nach der Immunpräzipitation. Inkubieren Sie die Proben 3 Stunden bei 4 ° C auf einem Rotator. Spin 1 min bei 1.500 × g bei 4 ° C und entfernen Überstand.
   5. Mit 1 ml Waschperlen waschen. Spin 1 min bei 1.500 × g bei4 ° C und entfernen Überstand. Wiederholen Sie die Schritte g bis h. Mit 1 ml abschließenden Waschpuffer waschen. Während der Waschschritte sollten Sie verlieren keine der Sicken, da dies verändert die Menge des Eluats direkt.
   6. Zentrifuge 1 min bei 1.500 × g bei 4 ° C Überstand zu entfernen. Add 125 ul Elutionspuffer und inkubiere 15 min bei 65 ° C bei 1000 rpm auf einem Schüttler.
   7. Spin 1 min bei 1.500 xg und Überstand in ein neues Röhrchen Wiederholen Sie Schritt k und l. Fügen Sie 200 ul Elutionspuffer, um Eingang (3.3.2). Hinzuzufügen Proteinase K und RNase zu jeder Probe und inkubiere 30 min bei 37 ° C bei 500 rpm auf einem Schüttler und anschließend 4 h bei 65 ° C bei 500 rpm auf einem Schüttler.
      HINWEIS: Bei Verwendung der DNA-Extraktion kommerziellen verfügbaren Chip DNA Clean and Concentrator Kit ^38.

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Ergebnisse

Methylquecksilberbelastung in UKK Testsystem

Zytotoxizitätstest wurde mit H9 EBs geführt, um einen IC _{10 -Wert} (Verringerung der Lebensfähigkeit um 10%) für die Zytotoxizität von Methylquecksilber (Figur 1) erhalten. Wir führten auch eine Microarray-basierte (Affymetrix-Plattform) Biomarker-Studie. Die H9 EBs wurden Methylquecksilber (0,25 und 1 & mgr; M) für 14 Tage ausgesetzt wurde. Am Tag 14 wurden Proben unter Verwendung von TRIzol gesammelt und RNA...

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Diskussion

Traditionelle Ansätze zur toxikologischen Prüfung beinhalten umfangreiche Tierversuche damit Tests teuer und zeitaufwendig. Darüber hinaus aufgrund der Unterschiede zwischen den Arten die vorklinischen Tiersicherheitsstudien sind nicht immer gültig Toxizität Auswirkungen möglicher Medikamente für den Menschen relevant vorherzusagen. Obwohl nichtmenschliche Primaten sind sehr vorhersehbar, noch starke ethische und sozioökonomischer Anforderungen schnell Anhebung von modernen Gesellschaften für die Entwicklung em...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory