Die Messung der Druck-Volumen-Kurve in der Mäuselunge

Zusammenfassung

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung’s structural changes with developing pathology.

Zusammenfassung

In den letzten Jahrzehnten hat die Maus hat sich die primäre Tiermodell einer Vielzahl von Lungenerkrankungen. Bei Modellen von Emphysem oder Fibrose sind die wesentlichen phänotypischen Veränderungen am besten durch Messung der Veränderungen der Lungenelastizität beurteilt. Um bestimmte Mechanismen, die solche Krankheiten in Mäusen am besten verstehen, ist es wichtig, Funktionsmessungen, die die Entwicklung der Pathologie reflektieren kann zu machen. Obwohl es viele Wege gibt, um die Elastizität zu messen, ist die klassische Methode, dass der Gesamt-Lungen Druck-Volumen (PV) Kurve über den gesamten Bereich der Lungenvolumina erfolgt. Diese Messung wurde an adulten Lunge aus nahezu allen Säugetierarten aus fast 100 Jahren unternommen wurden, und solche PV Kurven spielte auch eine wichtige Rolle bei der Entdeckung und Verständnis der Funktion von Lungensurfactant in der fetalen Lungenentwicklung. Leider sind solche Gesamtleistungskennlinie nicht weit verbreitet in der Maus berichtet, trotz der Tatsache, dass sie nützliche Informationen über die macrosc liefernopic Auswirkungen der strukturellen Veränderungen in der Lunge. Obwohl Teil PV Kurven misst nur die Änderungen des Lungenvolumens gelegentlich berichtet, ohne ein gewisses Maß des absoluten Volumens, die nichtlineare Natur des gesamten PV-Kurve macht diese Teil diejenigen sehr schwer zu interpretieren. In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine standardisierte Art und Weise, um die gesamte PV-Kurve zu messen. Wir haben nun untersuchten die Fähigkeit dieser Kurven auf Änderungen in Mauslunge Struktur in zwei gemeinsame Lungenerkrankungen, Emphysem und Fibrose zu detektieren. Die Ergebnisse zeigten signifikante Änderungen in mehreren Variablen mit den erwarteten strukturellen Veränderungen bei diesen Pathologien. Diese Messung des Lungen PV-Kurve bei Mäusen stellt somit eine relativ einfache Möglichkeit, um das Fortschreiten der pathophysiologischen Veränderungen über die Zeit und die mögliche Wirkung von therapeutischen Verfahren zu überwachen.

Einleitung

Die Maus ist nun der primäre Tiermodell einer Vielzahl von Lungenerkrankungen. Bei Modellen von Emphysem oder Fibrose sind die wesentlichen phänotypischen Veränderungen am besten durch Messen der Veränderungen der Lungenelastizität beurteilt. Obwohl es viele Wege gibt, um die Elastizität zu messen, ist die klassische Methode, dass der Gesamtdruck-Volumen (PV) Kurve vom Restvolumen (RV), gemessen bis zur Gesamtlungenkapazität (TLC). Diese Messung wurde an adulten Lunge aus nahezu allen Säugetierarten aus fast 100 Jahre ^1-3 vorgenommen. Solche Leistungskennlinie spielte auch eine wichtige Rolle bei der Entdeckung und Verständnis der Funktion von Lungensurfactant in der fetalen Lungenentwicklung ^7.4. Trotz Bedeutung der PV-Kurve als Maß der Phänotyp der Lunge, hat es keine standardisierte Möglichkeit, diese Messung durchzuführen. Es wurde einfach durch Aufblasen und Entleeren der Lunge mit diskreten Schritten (Wartezeit für eine variable Gleichgewichtseinstellung nach jedem) oder mit Pumpen gemacht, dasskontinuierlich aufzublasen und zu entleeren die Lunge. Die PV-Kurve wird oft über einen Volumenbereich zwischen Null und einigen benutzer definieren Lungenkapazität getan, aber die Zeitdauer jedes Druckvolumen Schleife durch verschiedene Labors berichtet extrem variabel gewesen, variierend von ein paar Sekunden bis ⁸ Stunden ^2. Einige Forscher bezeichnen diese totale Lungen PV-Kurve als statische oder quasistatische, aber diese sind qualitativ die kleinen Einblick bieten und sie nicht benutzt werden hier. Darüber hinaus ist die Leistungskennlinie nicht sehr stark in der Maus angegeben, ungeachtet der Tatsache, dass sie nützliche Informationen zu den makroskopischen Auswirkungen der strukturellen Veränderungen der Lunge bereitzustellen.

Mehrere Probleme wurden in Variabilität der PV-Kurve Akquisition einschließlich geführt: 1) die Rate der Inflation und Deflation; 2) die Druck Ausflüge für Inflation und Deflation; und 3) das Mittel zur Bestimmung eines absoluten Lungenvolumenmessung. Bei dem Verfahren hier anwesend, eine Rate von 3 ml / min wurde als compromis gewählte, da nicht zu kurz, um die dynamische Elastizität mit normaler Belüftung und nicht zu langsam widerspiegelte, wie um die Messung nicht praktikabel, vor allem, wenn das Studium großen Kohorten. Da eine nominale totale Lungenkapazität in einer C57BL / 6 gesunden Maus ist in der Größenordnung von 1,2 ml ⁹ ermöglicht diese Rate in der Regel zwei komplett geschlossen PV-Loops, um in etwa 1,5 Minuten durchgeführt werden.

In der erweiterten Literatur, wo PV Kurven berichtet, hat die Spitzeninflationsdruck sehr variabel war, variierend von so niedrig wie 20 bis über 40 cm H ₂ O. Teil dieser Variabilität kann zu Spezies verwandt, aber ein primäres Ziel der Festlegung der oberen Druckgrenze für PV-Kurven an die Lunge bis zur Gesamtlungenkapazität (TLC) oder maximalen Lungenvolumen aufzublasen. Die TLC beim Menschen wird von der maximalen willkürlichen Anstrengung ein Individuum machen definiert, aber leider nie in irgendeiner Tiermodell dupliziert werden. Somit ist die maximale Lautstärke in experimentellen PV Kurven abzuschreckenvon einem Maximaldruck willkürlich vom Prüfer eingestellt abgebaut. Das Ziel ist, einen Druck in dem die PV-Kurve ist flach eingestellt, aber leider ist die Inflation Schenkel eines Säugetier-Lungen-PV-Kurve ist nicht flach. So sind die meisten Forscher setzen einen Druck, wo der Inflationskurve beginnt, deutlich abflachen, in der Regel 30 cm H ₂ O Bei der Maus ist jedoch der PV-Kurve noch komplexer mit einem doppelten Buckel an der Inflations Glied, und wo diese Inflation Schenkel oft noch steil auf 30 cm H ₂ O ¹⁰ steigt, so 30 ist keine gute Endpunkt für die PV-Kurve. Aus diesem Grund verwenden wir 35 cm H ₂ O als die Druckgrenze für die Maus PV-Kurve, die einen Druck, bei dem das Aufblasen Gliedmaßen aller Stämme von uns untersuchten beginnen zu glätten ist.

Da das DV-Kurve selbst ist sehr nichtlinear ist, wird das Auftreten eines PV-Schleife auf das Volumen, von wo die Kurve beginnt abhängen. Einige kommerzielle Ventilatoren können Benutzer große PV-Loops zu tun, beginnend mit FRC, aber wenn der FRC Volumen nicht bekannt, so ist es unmöglich, Änderungen solcher DV-Kurve mit jeder Pathologie zu interpretieren, da diese Veränderungen könnten einfach durch eine Veränderung der Ausgangsvolumen ergeben, und nicht die strukturellen Veränderungen in der Lunge. So ohne absolute Volumenmessung, sind PV-Kurven fast unmöglich zu interpretieren und somit wenig Nutzen. Zwar gibt es mehrere Möglichkeiten, um Lungenvolumen messen, diese sind oft umständlich und erfordern eine spezielle Ausrüstung. In der hier beschriebenen einfachen Ansatz, beginnt die Leistungskennlinie bei Nullvolumen nach einer in vivo-Entgasungsverfahren.

Zusammenfassend ist dieses Papier zeigt eine einfache Methode, um Lungen PV Kurvenmessung in der Mauslunge zu standardisieren, und definiert eine Reihe von Kennzahlen, die aus dieser Kurve, die Lungenstruktur geknüpft sind, berechnet werden kann. Die PV-Kurve stellt somit ein Lungenfunktionstest, die direkte Anwendung in der Lage, phänotypische Strukturveränderungen bei Mäusen mit comm erkennen istLungenerkrankungen wie Emphysem und Fibrose.

Protokoll

Die Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt alle Tier Protokolle.

1. Ausrüstung

Das Verbundsystem einzurichten bereit, den PV-Kurve zu messen, ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Volumenmessung:
   1. Erzeugen Sie eine konstante Rate der Inflation und Deflation durch Verwendung einer Spritzenpumpe mit einem Schalter, der es dem Benutzer, schnell umzukehren die Pumpe nach Erreichen der Druckgrenzen ermöglicht. Für Maus Leistungskennlinie, mit einem sehr leicht eingefettet 5 ml Glasspritze mit dem Anfangsvolumen (vor der Inflation) in 3 ml Luft gesetzt. 3 ml ausreichend groß ist, um Mengen in fast allen Maus-Leistungskennlinie zu messen.
   2. Messen des von der Pumpe geförderten durch Anbringen eines linearen Differentialtransformators mit dem Pumpengehäuse, mit einem kleinen Sensorstab mit dem beweglichen Spritzenkolben verbunden Volumen.
      Hinweis: Eine empirische Mittel zur Gaskompression im System zu beheben unter der PV cu beschriebenrve Aufzeichnungsteil.
2. Druckmessung:
   1. Verwenden Sie ein Standard kostengünstige Druckmessgerät mit einer Reichweite von 0-60 cm H ₂ O (0-1 PSI).
3. Aufnahme-Messung:
   1. So nehmen Sie die PV-Kurve verwenden jede Digitalrekorder mit XY-Funktionen (zB PowerLab). Stellen Sie einen Kanal, um den korrigierten Volumensignal und einen weiteren Kanal, den Transpulmonardruck (PTP) aufzunehmen, um die PV-Kurve grafisch aufzuzeichnen. Verwenden Sie eine Brücke Vorverstärker, die mit dem Haupt Powerlab verbindet, um den Druck zu messen. Kalibrieren Sie den Druckkanal 0-40 cm H ₂ O, und kalibrieren Sie die Lautstärke Kanal 0-3 ml.

2. Korrektur für Gasverdichtung

Hinweis: Dies ist ein entscheidender erster Schritt in der Einrichtung, da bei steigendem Druck, die Gasvolumen abnimmt, und damit das Luftvolumen auf die Maus geliefert werden immer weniger als die Verschiebung des syringe Barrel.

1. Schließen Sie den Hahn, die die PV-Anlage in die Lunge angeschlossen werden, so dass kein Gas kann das System verlassen. Starten Sie die Infusion und beobachten, ob der korrigierte Volumen Kanal des Recorders zeigt keine messbaren Veränderungen bei steigendem Druck auf etwa 40 cm H ₂ O. Wenn ja, dann korrekt, wie in den folgenden Schritten.
   1. Korrigieren für Gaskompression empirisch ermittelt, indem vom Kolben Wegmessung (dh der unkorrigierten Volumen) ein Term proportional zu dem Luftdruck. Tun Sie dies auf einem Powerlab Kanal (genannt Vc), um den Lautstärkesignal minus einem Koeffizienten mal der Druck zeigen.
   2. Bestimmen die Koeffizienten in der Gleichung. Stellen Sie zunächst eine erste Vermutung, schalten Sie das Diagramm der Aufnahme auf, und starten Sie die Pumpe. Da die Inflation Schlauch verschlossen ist, stellen Sie die Druck Koeffizientenmultiplizierer, um die Vc Kanal gelesen Null steigt der Druck von 0 bis 40 cm H ₂ O. Geht es nach oben oder unten, einfach den Korrekturfaktor einstellen, bis esbleibt flach über diesem Druckbereich. Dieser Korrekturfaktor wird immer die gleiche sein, wenn die gleichen 3 ml Ausgangsvolumen in der Spritze wird nicht verändert.

3. Experimentelle Tests bei Mäusen

1. Verfahren zur Messung der PV-Kurve bei Mäusen. Alle Tier Protokolle wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
   1. Anesthetize Mäusen (C57BL / 6-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen) mit Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (15 mg / kg), und bestätigen Narkose durch das Fehlen von Rückbewegung.
      Hinweis: Der PV-Kurve kann an narkotisierten Mäusen in weniger als 10 Minuten abgeschlossen sein und eine endständige Verfahren.
   2. Tracheostomize die Mäuse mit einer 18 G-Stub Nadelkanüle. Dies geschieht durch einen kleinen Schnitt in der Haut, die über der Luftröhre, der Lokalisierung der Luftröhre, dann einen kleinen Spalt in der Luftröhre, wobei der Stub-Nadel eingeführt werden kann. Sichern Sie die Kanüle durch die Kopplung mit Gewinde.
   3. Lassen Sie die Mäuse zu atmen 100% Sauerstoff für mindestens 4 min. Dies kann über die Spontanatmung aus einem Beutel oder mit einer Beatmungs nominell mit einem Atemvolumen von 0,2 ml bei 150 Atemzügen / min eingestellt sein.
   4. Schließen Sie die Trachealkanüle und innerhalb von 3-4 min für die Maus, um den gesamten Sauerstoff zu absorbieren. Dieses Sauerstoffabsorptionsverfahren ergibt den Tod der Tiere und in einer nahezu vollständigen Entgasung der Lungen ^11. Tod der Maus bestätigen, indem die Einstellung der Herzschlag mit EKG-Elektroden oder die direkte Beobachtung.
   5. Nachdem die Entgasung der Lunge ist abgeschlossen und das Lungenvolumen gleich Null ist, beginnt das Aufblasen der Lunge mit der Raumluft in die Spritzenpumpe bei einer Rate von 3 ml / min. Überwachen Sie die Druckspur auf dem Digital-Recorder, und wenn es 35 cm H ₂ O erreicht, kehren Sie die Pumpe.
   6. Folgen Sie der Kurve, bis die Deflation Druck erreicht negativen 10 cm H ₂ O, in welcher Zeit die Atemwege sind zusammengebrochen, das Einschließen von Luft in Alveolen Verhinderung weiterer Volumenreduzierung. Unmittelbar Reverse ter wieder zu pumpen, so dass die Lunge zu bergen, da die kollabierte Atemwege zu öffnen. Diese heterogene Öffnung ist normalerweise durch die laute suchen Inflation Glied in der Anfangsteil des zweiten Inflation deutlich.
   7. Wenn der Druck wieder 35 cm H ₂ O erreicht, kehren Sie die Pumprichtung, und halten Sie die Luft aus der Lunge, bis dieser zweite Deflation Gliedmaßen erreicht 0 cm H ₂ O. Dann die Pumpe stoppen.
   8. Sehen Sie sich die PowerLab-Chart Rekord von Druck und Volumenstrom und der PV-Kurve. Dann analysieren die PV-Kurve auf phänotypische Veränderungen im Lungenparenchym, die mit verschiedenen Lungenerkrankungen auftreten, zu erkennen.

Ergebnisse

Obwohl das Verfahren für die Leistungskennlinie wird in dem Video nur für Steuer gesunden Mäusen gezeigt, untersuchten wir die Fähigkeit der PV-Kurve, um funktionelle und pathologische Veränderungen bei Mäusen mit zwei unterschiedlichen gemeinsamen Pathologien, Emphysem und Fibrose zu detektieren. Einzelheiten zu diesen traditionellen Modellen beschrieben an anderer Stelle ^12,13. Ganz kurz nach der Narkose mit 3% Isofluran das Emphysem wurde von 3 oder 6 U Schweine-Pankreas-Elastase in die Luftröhre ei...

Diskussion

In diesem Artikel wird eine einfache reproduzierbare Methode wurde beschrieben, dass in Mäusen messen eine klassische Methode der Phänotypisierung Lungenelastizität, der Gesamtlungen PV-Kurve. Solche Kurven sind massgeblich an der Entdeckung von Lungensurfactant und seine Bedeutung bei der Bereitstellung von Lungen Stabilität. Hier wird gezeigt, wie die PV-Kurve ist auch nützlich bei der Bereitstellung einer Einrichtung, um verschiedene Variablen, um Lungenelastizität in erwachsenen Mauslungen genau gemessen. Es g...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syringe pump	Harvard Apparatus	55-2226	Infuse/withdraw syringe pump
Pump 22 reversing switch	Harvard Apparatus	552217	Included with pump
Linear displacement transformer	Trans-Tek, Inc.	0244-0000
5 ml glass syringe	Becton Dickenson		Several other possible vendors
Digital recorder	ADInstruments	PL3504	Several other possible vendors
Bridge amp signal conditioner	ADInstruments	FE221
Gas tank, 100% oxygen	Airgas, Inc		Any supplier or hospital source will work
Pressure transducer: 0 - 1 psi mV output	Omega Engineering	PX-137	Range ≈ 0 - 60 cm H2O