Physiology Lab Demonstration: glomeruläre Filtrationsrate in einem Ratten-

Zusammenfassung

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Zusammenfassung

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Einleitung

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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Protokoll

Vor jeder Tierverfahren muss der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) das Protokoll zu genehmigen. Das Protokoll wurde von der Michigan State University IACUC genehmigt.

1. Pre-lab Herstellung von FITC-Inulin-Lösung

1. Warm 20 ml Kochsalzlösung auf 70 ° C langsam einrühren 100 mg FITC-Inulin (5 mg / ml FITC-Inulin), bis alle Inulin gelöst.
2. Coole Lösung für RT und fügen Sie 800 mg Rinderserumalbumin (40 mg / ml BSA, gefriergetrocknetes Pulver, im wesentlichen Globulin frei, Endotoxin, ≥98% Reinheit durch Agarose-Gelelektrophorese).
3. Filtern Sie die Inulin-BSA-Lösung mit Filterpapier (Grad 1). Legen Sie die filtrierte Lösung in einem 20-ml-Spritze mit einer Spritze-tip Filter (0,2 um) und mit Folie abdecken, um vor Licht zu schützen.

2. Anästhesie und Chirurgie

1. Legen Sie die Ratte in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran gefüllt Anästhesie zu induzieren. Nehmen body Gewicht (250-350 g) und legen Sie die Ratte auf einem beheizten chirurgische Plattform, die 37 ° C Körpertemperatur während des Experiments zu erhalten. Sichern Sie vorsichtig die Ratte auf die Plattform mit Labor-Band in den Pfoten. Aufrechterhaltung einer Narkose mit 1-2% Isofluran mit medizinischer Qualität 100% O ₂ in Luftströmungsgeschwindigkeit von 0,8 bis 1,0 l / min.
2. Legen Sie eine verjüngte Katheter (intravaskuläre Spitze OD, 2.7F) in die Oberschenkelarterie für Blutdruck und Herzfrequenzmessung und Blutabnahme.
3. Legen Sie einen Katheter (PE-50) in die Oberschenkelvene für Inulin Infusion. Sichern Sie den Katheter umgebende Gewebe mit 5-O geflochtenen Seide chirurgisches Naht ^6.
4. Befestigen Sie den arteriellen Katheter mit einem DMS-Druckaufnehmer. Aufzeichnung des Blutdrucks und der Herzfrequenz mit Datenerfassungssoftware und Anzeige auf einem Computerbildschirm in Echtzeit. Diese Technik wird im Detail auf Video ⁶ gezeigt.
5. Setzen Sie die Blase über einen suprapubischen Einschnitt. Schneiden Sie ein kleinesLoch in der Spitze der Blase und legen Sie eine Kanüle (PE-190) mit einer Wärme abgefackelt Spitze in der Blase zur Urinsammlung. Sichern Sie die Kanüle in die Blase mit einer Tabaksbeutelnaht.

3. Urin- und Blutentnahme

1. Die Spritze wird von FITC-Inulin in einer Spritzenpumpe mit Durchflussrate einzustellen von 1 ml / h pro 100 g Körpergewicht (3 ml / h bei einer Ratte mit einem Gewicht von 300 g). Befestigen Sie die Spritze in die Vena femoralis-Katheter. Starten Sie das Inulin Infusion und ermöglichen eine 1-2 hr Äquilibrierungsperiode. Halten Spritze mit Folie zum Schutz vor Licht bedeckt.
2. Festzustellen, ob Urinflußrate stabil und angemessen für die Probenanalyse (20 ul / min) durch Sammeln einer Urinprobe in ein vorher gewogenes Sammelgefß für einen Zeitraum von 10 min. Bestimmen Sie Urinvolumen gravimetrisch mit einer digitalen Waage. Eine ausreichende Urinvolumen für eine 10 min Erfassungszeitraum beträgt 0,2 ml. Weiterhin Urinproben zu sammeln, bis zwei aufeinanderfolgenden Sammlungen zeigen eine Urinflussrate von 20 ul / min oder mehr.
3. Pre-Drug Samples
   1. Sammeln einer Urinprobe während eines 20 min Periode. Sammeln einer Blutprobe (0,5 ml) aus dem Arterienkatheter in der Mitte des Urinsammelperiode. Seien Sie vorsichtig, um ganz klar den arteriellen Katheter von Kochsalzlösung vor dem Sammeln einer Blutprobe in einer Sammlung Fläschchen mit 1 U Heparin. Verwenden Sammlung Fläschchen mit Volumenmarkierungen, um die Sammlung von 0,5 ml des arteriellen Blutes zu erleichtern.
   2. Spülen der arterielle Katheter mit Heparin-Kochsalzlösung (20 U / ml), um den Katheter von Blut (ca. 0,1 ml) gelöscht. Die Länge der arteriellen Katheter sollte so kurz wie möglich sein, um das Volumen der Heparin-Kochsalzlösung benötigt, um bündig zu begrenzen.
      Hinweis: Das verwässerte Blutproben ungenaue Berechnungen der GFR und gebrochene Ausscheidung von Na und K.
   3. Warten Sie 10 Minuten, und wiederholen Sie die Sammlung von einer zweiten Pre-Droge Urin und Blutprobe.
4. Nach der Sammlung von zwei Pre-Drogenproben, verwalten ein Diuretikum drug, Furosemid (10 mg / kg) über den arteriellen Katheter. Spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung, um den Katheter von Drogen löschen. Kümmern, um die Injektion von Luft durch den arteriellen Katheter zu verhindern. Notieren Sie sich die Zeit des Furosemid Injektion.
5. Post-Drogen Samples: An jedem der 3 Zeitpunkte unter, sammeln eine Urinprobe während eines 10 min Erfassungszeitraum, und eine Blutprobe (0,5 ml) in der Mitte des Urinerfassungszeitraum.
   1. Für Post-Drug Probe 1 - sammeln fünf Minuten nach Furosemid.
   2. Für Post-Drug Probe 2 - sammeln zehn Minuten nach Furosemid.
   3. Für Post-Drug Probe 3 - sammeln fünfzehn Minuten nach der Furosemid.
6. Nachdem alle Proben gesammelt worden sind, euthanize die Ratte gemäß institutionellen Verfahren durch Thorakotomie und Entfernung des Herzens. Entfernen Sie die beiden Nieren. Decapsulate (entfernen Sie die umgebenden Membran) und tupfen Sie die Nieren, um überschüssiges Blut zu entfernen. Wiegen die Nieren.

4. Probenanalyse

1. Messen Sie alle Urinprobenvolumen gravimetrisch mit einer Digitalwaage und Rekordgewichte.
2. Zentrifuge Vollblutproben mit einem Tischzentrifuge (1800 x g), um Plasma abzutrennen. Übertragen Plasmaproben, kleine Fläschchen beschriftet.
3. Analysieren Na und K-Konzentrationen in Urin und Plasma-Proben mit einer Natrium / Kalium-Analysator.
4. Messung von FITC-Inulin in Plasma und Urin
   1. Verdünnter pre-drug Harn (von 1: 200 bis 1: 400), und post Medikament Urin (1:10) mit HEPES-Puffer (500 mM, pH 7,4).
   2. In 40 ul Standard oder Probe und 60 ul HEPES-Puffer in einer 96-Well-Platte (eine Probe pro well) und lassen Sie sie für 10 Minuten mischen mit Aluminiumfolie abgedeckt, während.
   3. Erzeugen eine Standardkurve für FITC-Inulin-Konzentrationen von 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug / ml (Abbildung 1). Bestimmen Sie FITC-Inulin Fluoreszenz in Proben und Standards unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader mit der Ex-Zitat und Emissionswellenlängen von 485 und 538 nm.
   4. Setzen Sie die Werte für die Fluoreszenzstandards zu einem 4-Paramter logistische Funktion Regressionsanalyse. Die Regressionsfunktion Parametern werden FITC-Inulin-Konzentration im Plasma und Urinproben (Tabelle 1) zu berechnen.

5. Post-lab Ergebnisanalyse Berechnungen

1. Berechnen Urinflussrate (UV; ml / min): [Volumen der Urin gesammelt (ml)] ÷ [Zeitpunkt der Erhebung (min)]
2. Berechnen glomerulären Filtrationsrate (GFR; ml / min): [Urin-Inulin-Konzentration (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma Inulin konz. (Ug / ml)]
3. Berechnen Gefilterte Sodium Load (umol / min): Plasma-Natrium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x GFR (ml / min)
4. Berechnen Natriumausscheidungsrate (U _Na V; mol / min): Urin-Natrium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x UV (ml / min)
5. Berechnen Fractional Ausscheidung von Natrium (Na FE;%): [U _Na V (& mgr; mol / min)] ÷ [Gefiltert Sodium Load (& mgr; mol / min)] x 100
6. Berechnen Filtered Potassium Load (& mgr; mol / min): Plasma-Kalium-Konzentration (& mgr; mol / ml) x GFR (ml / min)
7. Berechnen Kaliumausscheidung Rate (U _K V; & mgr; mol / min): Urinkaliumkonzentration (& mgr; mol / ml) x UV (ml / min)
8. Berechnen Fractional Ausscheidung von Kalium (FE K;%): [U _K V (& mgr; mol / min)] ÷ [Gefiltert Potassium Load (& mgr; mol / min)] x 100

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Ergebnisse

Die im Labor Demonstration verwendet Diuretikum Furosemid war die sehr schnell hemmt die Wiederaufnahme von Na und K von der Niere zu einer erhöhten Na, K und Wasserausscheidung innerhalb von Minuten nach der Arzneimittelverabreichung filtriert. Durch seine primäre Mechanismus sollte Furosemid minimale Auswirkungen auf die GFR und dem gefilterten Last von Na und K, aber wird Harnfluss und fraktionierte Ausscheidung von Na und K zu erhöhen

Die repräsentativen Ergebnisse in Tabelle...

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Diskussion

Ein geeigneter Marker für die GFR Messung muss vier Kriterien erfüllen: frei im Glomerulus filtriert werden, sein ungebundenes an Plasmaproteine, und weder absorbiert noch im Nephron sezerniert werden. Inulin ist ein Fructose-Polymer, das diese Kriterien erfüllt. Als Ergebnis wird die renale Clearance von Inulin als Goldstandard für die Messung GFR ^7. Das demonstriert Technik stellt den traditionellen Ansatz zur Bestimmung der renalen Clearance von Inulin am Urin Sammlungen während einer konstanten Infus...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420