Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.

Zusammenfassung

Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Vorgestellt werden verschiedene Techniken für die Verarbeitung von EVs und zwei Protokolle zur Analyse von EVs entweder Einzelerkennung oder einen Wulst-basierten Ansatz. Die hier beschriebenen mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten unterstützen Methoden ansteigendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in einer rationalen fashion das Detektieren von Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Wulst basierten Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.

Einleitung

Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Vorgestellt werden verschiedene Techniken für die Verarbeitung von EVs und zwei Protokolle zur Analyse von EVs entweder Einzelerkennung oder einen Wulst-basierten Ansatz. Die hier beschriebenen mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten unterstützen Methoden ansteigendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in einer rationalen fashion das Detektieren von Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Wulst basierten Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.

EVs, die auch als Mikropartikel bekannt, sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse ¹ gefunden. Durch Expression von verschiedenen Oberflächenmarkern und / oder die direkte Übertragung von biologischem Material sind EVs Lage, die Funktion der Empfängerzellen zu ändern, um zu spielen, entweder Aktivierung oder Unterdrückung von Rollen bei der interzellulären Kommunikation ^2-4. Klinisch Blutplättchen stamm EVs sind dafür bekannt, starke Antikoagulansaktivität ⁵ müssen und andere haben gezeigt, dass für eine Vielzahl von Bedingungen beitragen, von der Förderung des Tumor metastasis ⁶ zum Schutz vor Krankheiten ^7. EVs in kleinere Gruppen von Zellen abgeleiteten Vesikeln wie beispielsweise Exosomen und Mikrovesikel (MVs) klassifiziert werden, abhängig von ihrer Größe und dem Mechanismus der Erzeugung ^8. Die Nomenklatur der Zellen stammenden Vesikel Subpopulationen weiterhin ein Thema der aktuellen Debatte ^8,9 sein, jedoch Exosomen sind im Allgemeinen als klein beschrieben, 40 bis 100 nm Teilchen endosomalen Fusion mit der Plasmamembran abgeleitet, während MVs größer 100 bis 1.000 durch den Abbau der Plasmamembran ¹⁰ ausgebildet nm Teilchen. Hier wird der allgemeine Begriff "Elektrofahrzeuge" verwendet werden, um alle Arten von extrazellulären biologischen Vesikel von den Zellen freigesetzt zu verweisen.

Isolierung von EVs aus Vollblut ist ein mehrstufiges Verfahren und viele verschiedene Verarbeitungsvariablen gezeigt worden, EV Inhalt einschließlich Lagertemperatur und Dauer ^11,12 Antikoagulans / Konservierungsmittel ¹³ und beeinflussenZentrifugationsverfahren verwendet ^14. Eine Notwendigkeit der Standardisierung dieser Variablen hat den Empfehlungen der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase Wissenschaftliche und Standardization Committee (ISTH SSC) für die Blutverarbeitung und EV Isolierungsverfahren ^15,16 geführt, doch gibt es keinen Konsens unter den Wissenschaftlern über die optimale Protokoll verwenden ^12. Die meisten sind sich aber einig, dass streng kontrolliert präanalytische Variablen sind entscheidend für genaue und reproduzierbare Daten.

Um EVs analysieren, haben Forscher verschiedene Verfahren verwendet, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie ^17, Rasterelektronenmikroskopie ^18,19, Atomkraftmikroskopie, der dynamischen Lichtstreuung ^20,21 und Western Blotting ^22,23. Während FCM ist die Methode der Wahl für viele Forscher ^{9,24 - 26} wegen seiner hohen Durchsatzkapazitäten, Analyse von Elektrofahrzeugen mit FCM istnotorisch schwierig aufgrund ihrer Größe und der Mangel an diskreten positive Bevölkerungs ^27-32. Im Vergleich zur Analyse von Zellen, die geringe Größe der EVs ergibt 1) weniger Fluoreszenz aufgrund der geringeren Anzahl von Antigenen pro Teilchen emittiert wird, und 2) begrenzter Durchführbarkeit post-Fleck Waschen, die notwendig ist, die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Gemeinsame Herausforderungen unter den Forschern umfassen Signale, die aus Immunoglobulinaggregaten ^27,28 und Selbstaggregation von Antikörpern ^29. Außerdem sind die langen Bearbeitungszeiten und langwierigen Wasch / Isolationsverfahren von vielen der derzeitigen Protokolle ^33,34 verwendet werden, erfordern Mehrtageszeit Zusagen, um eine kleine Anzahl von Proben zu analysieren, so dass sie weniger als ideal für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Einige Forscher verzichten einen Waschschritt zusammen und macht traditionell verwendet FCM Negativkontrollen wie Fluoreszenz minus eins (FMO) und Antikörper-Isotypen nutzlos für eine präzise Bewertung background Fluoreszenz ^30.

Unsere Protokolle adressieren drei häufige Probleme, die richtige FCM-Analyse von Elektrofahrzeugen behindern können: Signale, die aus Antikörperaggregate und andere nicht-Vesikel, Schwierigkeiten beim Entfernen ungebundener Antikörper und Mangel an erkennbaren positiven Populationen. Die hier beschriebenen Techniken mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten erhöht Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in rationeller Weise, die Detektion von Hintergrundfluoreszenz minimiert unterstützen. Zwei unterschiedliche Detektionsmethoden werden hier präsentiert: das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Kügelchen basierenden Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Protokolle wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle menschlichen Subjekt Proben wurden unter einem Institutional Review Board (IRB) -zugelassene Protokoll und mit Einwilligung der Versuchspersonen getestet.

1. Methode A: Individuelle Erkennungsmethode

1.1) Die Verarbeitung von Blut-Probe / Isolation von Elektrofahrzeugen

1. Blutentnahme vom Spender / Patienten in zwei 10 ml Glasröhrchen mit 1,5 ml ACD-A-Lösung oder einem anderen geeigneten Antikoagulans und Prozess sofort (innerhalb von 30 Min), mit dem folgenden 2-Schritt differentielle Zentrifugation Protokoll.
   Hinweis: Dieses Protokoll wird aus den kombinierten ~ 17 ml Blut entnommen etwa 10 ml plättchenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Wenn mehr oder weniger PPP benötigt wird, kann die Anzahl der Rohre von Blut gesammelt entsprechend angepasst werden.
2. Zentrifugiere die Proben bei 1500 g für 10 min bei RTum das Plasma aus dem Buffy-Coat und rote Zellen zu trennen. Übertragen Sie 1,2 ml Aliquots der Plasmaüberstand bis 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, darauf achten, daß die unteren Schichten mit dem Buffy-Coat und roten Zellen zu stören.
3. Schleudern bei 13.000 xg für 10 min bei RT an Blutplättchen und große Zelltrümmer zu entfernen. Sorgfältig überweisen Sie den PPP und hinterließ 200 ul zu vermeiden, das Pellet aufzurühren und fügen Sie die PPP in ein neues Röhrchen.
4. An dieser Stelle verwenden PPP sofort für die Analyse oder die Übertragung in 1,0 ml Aliquots auf neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und bei -80 ° C für bis zu zwei Jahren für eine spätere Analyse (siehe 1A Übersicht Abbildung).
5. Wenn gereinigt EVs sind für funktionelle Experimenten Übertragungs 6 ml des PPP zu einem Ultrazentrifugenröhrchen benötigt und füge 28 ml von 0,2 & mgr; m filtriert, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Spin für 60 min bei 100000 · g bei RT mit einer Ultrazentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet. Überstand entfernen und resuspendieren EV pellassen Sie in 1,5 ml Medium.
   HINWEIS: Für höchste Reproduzierbarkeit, Blutproben sollten so konsequent wie möglich von Spender zu Spender verarbeitet werden. Eine Differenzierung der EV Isolation Methode könnte einen wesentlichen Einfluss auf die Anzahl und Art von Elektrofahrzeugen erkannt.

1.2) Vorbereitung Proben für die Analyse

HINWEIS: Von diesem Zeitpunkt an werden die Schritte erläutern, einen hohen Durchsatz Protokoll zur Analyse von 12 Proben für 14 Marker in 3 Panels. Jedoch können auch andere Kombinationen von Antikörpern, hier verwendet werden; das Protokoll angepasst, um andere EV Bevölkerung, indem die vorgeschlagenen Marker für diejenigen von Interesse zu untersuchen.

1. Entfernen 12 Proben aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei 37 ° C (wenn bei -80 ° C gelagert).
2. Pipette Inhalt nach oben und unten mehrere Male, um zu mischen. Entfernen Sie 320 ul von jeder Probe und zu der oberen Reihe einer 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Ein breitenverstellbar Multi-Well-Pipette ist äußerst hilfreich für diese und viele andere Schritte in der ganzen Arschay, insbesondere bei der Analyse von mehreren Proben gleichzeitig.

1.3) Die Färbung EV Proben

1. Vor dem Färben, filtern alle Antikörper (Abs), um Aggregate zu entfernen, die positive Signale verursachen können.
   1. Kombinieren Antikörper in jeder der Platten 3 in einzelne 0,22 um Filterzentrifuge und Zentrifugenröhrchen mit einem festen Winkel einzigen Geschwindigkeitszentrifuge (~ 750 · g) bei RT für 2 Minuten verwendet werden, oder bis der gesamte Ab Mischung durch den Filter geleitet und keine Antikörperflüssigkeit auf der Oberfläche des Filters bleibt. Shop Ab Cocktails im Kühlschrank bis zu zwei Wochen, aber erneut Filter vor jedem Gebrauch.
2. Fügen Sie die entsprechende Menge des gefilterten Ab Mischung in jede Vertiefung in der Reihe 2 (zB Proben in Panel I werden mit 2 ul jeder Ab gefärbt, so dass insgesamt 12 ul des gefilterten Ab Cocktail pro Vertiefung zugegeben zu Zeile 2). Siehe 1B für einen Überblick über die vorgeschlagene Platten Karte Abbildung. Wiederholen Sie diese zusätzlichs zu den Zeilen darunter, wenn mehr Platten ausgeführt (dabei ist, füge 8 ul / Vertiefung des Panel II Cocktail bis 3 und 11 ul / Vertiefung des Panel III Cocktail zu Zeile 4 Zeile, siehe Materialliste für spezifische Panel Informationen).
3. Mit dem Mehrkanalpipette, mischen Sie die PPP-Proben in Reihe 1 nach oben und unten und dann 100 & mgr; l aus den Vertiefungen in Zeile 1 in die Vertiefungen in Reihe 2. Mischen Sie nach oben und unten. Tipps und wiederholen Sie die Änderung, Übertragung 100 ul von Reihe 1, Zeilen 3 und 4. Inkubation bei 4 ° C für 30 min.

1.4) Wasch MV Proben

1. Entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen von 4 ° C und Transfer zum biologischen Sicherheitsschrank. Mit einer Mehrkanal Pipette 220 ul PBS / Well, Zeilen 6-8 (bis zum Spülen / Waschen der Vertiefungen mit Bunt PPP verwendet werden).
2. Den Inhalt der Vertiefungen zu voretikettierten Kreiselfilterrohre mit Hilfe der Breite anpassbare Mehrkanalpipette (für 12 Proben, mit 3 Panels von Antikörpern, 12 x 3 = 36 Filterrohre werdenbenötigt werden). Mit den gleichen Spitzen, nehmen 200 ul PBS aus den Wasch Zeilen und fügen Sie in die entsprechenden Wells, von der PPP war einfach entfernt werden.
3. Mischen Sie nach oben und unten, um die Wells spülen und übertragen Sie die Spüllösung auf dieselben Filter auf die der PPP wurde zuvor aufgenommen. Schließen Spitzen der Kreisel Filter. Tipps ändern.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen gefärbte Proben, bis alle befleckt PPP Proben wurden zusammen mit ihren Spüllösungen zu Schleuderfilter übertragen.
5. Übertragen Sie die Kreisel Filter auf einen festen Rotor Zentrifuge und Spin bei 850 × g für 3 min bei RT.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit auf die Filterplatten bleibt. Nach der Zentrifugation sollte der Filter erscheinen "trocken" mit keinen sichtbaren Flüssigkeitsschicht auf der Oberseite verbleibenden sein. Obwohl unwahrscheinlich, dass bestimmte PPP Proben erfordern eine längere Zentrifugationszeit, effektiv durch den Filter bewegen.
6. Die zentrifugalen Filterrohre entfernen und zur biologischen Sicherheitsschrank.Mit dem Mehrkanalpipette resuspendieren die Oberseiten der Filter in 300 ul PBS. Bringen Sie zur sofortigen FCM-Analyse die resuspendierten Inhalte vorab markierten Röhrchen.
   HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um die Kraft und die Anzahl der Pipettenkolbenvertiefungen konsistent zu halten, um Proben von Probe zu Probe Variation zu vermeiden. Diese sollte im Idealfall unter Verwendung einer elektronischen Pipette, die programmiert ist, um auf und ab einem bestimmten Volumen pipettieren geführt werden (beispielsweise 280 & mgr; l) einer genauen Anzahl von Malen (beispielsweise 8-fach) für jede Probe.

1.5) Cytometer-Setup

1. Öffnen Sie die FCM-Software. Vor dem Setup zu experimentieren, gehen täglich Gerätekalibrierung und Setup mit Geräteeinstellung Perlen (nach Herstellerangaben).
2. Wenn der EV-Proben mit mehr als einem Antikörper gefärbt worden und mehrere Fluorochrome auf einmal gemessen werden, zu berechnen Korrekturwerte wie folgt:
   1. 2 Tropfen Entschädigung Perlen vor,-markierten Rohre (1 Röhre für jedes Fluorochrom konjugierte Antikörper), und fügen Sie die empfohlene Menge an Antikörper. 2 Tropfen negative Kompensations Perlen in ein anderes Röhrchen als ungefärbte Kompensationssteuerung zu verwenden.
   2. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten, Waschen mit PBS und Resuspendieren in 400 ul PBS.
   3. Mit dem Durchflusszytometer-Software mit dem Gerät enthalten sind, laufen jede Ausgleichsrohr und passen fluoreszierende Spannungen, jeden Peak bei etwa 10 ⁴ auf einer 5-Dekade logarithmischen Skala zu platzieren. Sicherzustellen, dass der Fluoreszenz-Peak am höchsten (am hellsten) in einem eigenen Fluoreszenzkanal im Vergleich zu allen anderen Kanälen und erneut einstellen Spannungen Fluoreszenzparameter, falls erforderlich. Führen Sie jede einzeln gefärbten comp Rohr und erfassen mindestens 5.000 Veranstaltungen pro Röhrchen.
   4. Wählen Sie die Registerkarte "Experiment", wählen Sie dann "Compensation", wählen Sie dann "Vergütung berechnen", um Korrekturwerte für alle Proben beantragen.
3. Stellen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) Spannungsparameter maßstabs anmelden und wählen Sie den niedrigsten Schwellenwerte vom Zytometer (FSC = 200 und SSC = 200) für jeden erlaubt.
4. Während der Ausführung eines Rohrs von 0,22 & mgr; m-filtriert PBS, passen die FSC und SSC Spannungen an die höchsten Werte, die den Großteil der Hintergrundrauschen (dh knapp unterhalb der Schwellenspannung, bei der Ereignisrate überschreitet 5-Ereignisse / sec) aus.
5. Als nächstes führen Sie ein Röhrchen mit 0,2 um - 1,0 um Glasperlen, in PBS verdünnt, wenn nötig. In einem FCS vs. SSC Plot, ziehen ein Gatter um den Wulst Bevölkerung, an Veranstaltungen finden zwischen 0,2 um und 1,0 um zu erfassen. Alternativ kann in einem SSC-H Histogramm, zeichnen Sie ein Tor, um alle Ereignisse kleiner als die 1,0 um Kügelchen enthalten.
6. Durchflussrate der Zytometer ist auf "Lo" (etwa 8-12 & mgr; l / min). Verwendung der Kügelchen Rohr (oder anderen Röhre mit einer bekannten Konzentration von Kugeln) die Durchflussratenscheibe am Zytometer bis Vorabendnt Rate erreicht rund 200 Veranstaltungen / sec. Alle Probenröhrchen mit der gleichen Fließrate und die gleiche Perlenkonzentration in zukünftigen Experimenten zu gewährleisten, dass die Durchflussmengen konsistent bleiben zwischen den Läufen.
7. Führen Sie einen Schlauch von Regenbogen fluoreszierende Partikel in PBS verdünnt. Erwerben 5.000 Veranstaltungen. Werden die Mittelintensitätswerte für FSC, SSC, und jeden Farbkanal. Verwenden Sie diese Werte, um Spannungen in zukünftigen Experimenten anpassen, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten konsistent bleiben zwischen den Experimenten.

1,6) Probenlese

1. Durchflussrate der Zytometer ist auf "Lo" (etwa 8-12 & mgr; l / min) und führen Sie jede Probe für genau 1 oder 2 min.
2. Nach dem ersten Lesen, mit 20 ul 10% NP-40 zu jeder Probe, einer Pipette auf und ab, und für die gleiche Zeitspanne (1 oder 2 min) erneut zu lesen, um die Subtraktion der positiven Ereignisse erfasst ermöglichen die lysierte Probe über eine gleiche Zeitrahmen.
   HINWEIS: Es ist sehr important, dass die Proben mit einer Pipette, anstatt einen Wirbel gemischt werden. Nach unserer Erfahrung kann Vortex Selbstaggregation von einigen Antikörpern verursachen, was zu EV-imitiert positive Ereignisse.
3. Nachdem alle Proben eingelesen wurden, exportieren alle .fcs Dateien in eine separate Datei zur weiteren Analyse mit FCM-Analyse-Software verwendet werden.

1.7) Datenanalyse

1. Öffnen Sie die FCM-Analyse-Software. Importieren Sie alle .fcs Dateien in ein neues Experiment-Datei.
2. Öffnen Sie die Perlen nur Rohr. In der FSC-A vs. SSC-A-Grundstück, zeichnen Sie ein Tor um alle Perlen zwischen 0,2 um und 1,0 um Größe. Dies ist die EV-Gatter. Ziehen Sie, um zu allen Proben hinzuzufügen.
3. Mit den lysierten Proben als negative Kontrollen, zeichnen Gates an der Kante der Hintergrundfluoreszenz in jedem Fluoreszenzkanal verwendet. Ziehen fluoreszierende Tore in die EV-Gate jeder entsprechenden nicht-lysierte Probe.
   HINWEIS: An diesem Punkt ist es nützlich, dual Fluoreszenz bi-Parameter Stücke zu prüfen. Rocket-Formen indie doppelt positiven Quadranten (siehe Abbildung 8), insbesondere wenn die Markierungen bekannt, auf unabhängige Zelltypen befinden, kann ein Hinweis auf Artefakt Aggregation oder andere Vesikel ähnliche Ereignisse.
4. Für jeden fluoreszierenden Marker, Subtrahieren der Anzahl an Ereignissen in der lysierten Probe von der Anzahl von Ereignissen in der nicht-lysierten Probe. Optional teilen diese Zahl durch die Gesamtzahl von Elektrofahrzeugen in der nicht-lysierten EV Tor% positive Werte zu erhalten.

2. Methode B: Perlen-Methode

2.1) Die Verarbeitung von Blut-Probe / Isolation von Elektrofahrzeugen

1. Beziehen sich auf die in Verfahren A (Abschnitt 1.1) beschriebenen Blutverarbeitungsmethode.

2.2) Vorbereitung Proben für die Analyse

1. Wenn gewünscht, fraktioniert PPP oder ultrazentrifugierten EVs in Exosomen und Mikrovesikel. Fügen Sie 250 ul PPP oder ultrazentrifugierten EVs bis 0,22 um zentrifugale Filter und Transfer zu einem festen Rotorzentrifuge und Spin bei 750 xg für 2 min bei RT.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit auf die Filterplatten bleibt. Nach der Zentrifugation sollte der Filter erscheinen "trocken" mit keinen sichtbaren Flüssigkeitsschicht auf der Oberseite verbleibenden sein. Wenn unwahrscheinlich können bestimmte Proben erfordern eine etwas längere Zentrifugationszeit das Fluid wirksam durch den Filter zu bewegen.
2. In 2 ml waschen unbeschichteten 6 um Polystyrolkügelchen (zB negativ AbC Perlen) 2x mit RPMI-Medium, und resuspendieren. In 6000 Perlen zu jedem FACS-Röhrchen. Um den negativen Kontrollröhrchen 400 ul RPMI-Medium allein an die Perlen. An alle anderen Röhren, fügen Sie 200 ul PPP oder ultrazentrifugierten EVs (oder deren Fraktionen) und 200 ul RPMI-Medium.
3. Stellen Sie die Endvolumen von allen Röhrchen zu 400 ul mit Medien und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler.
4. Am nächsten Morgen, waschen Perlen mit 2 ml Medium. Saugen Sie den Überstand.
5. Blockieren mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in Medium (400 ul) für 3 h bei 4 &# 176; C auf einem Schüttler.
6. Mit 2 ml Medium zu waschen Perlen. Verwerfen und Pellet in 100 ul Medium.

2.3) Die Färbung EV Proben

1. Filtern Sie alle Antikörper. Verwenden Sie die gleichen Antikörper-Panels in Verfahren A verwendet werden, oder, falls gewünscht, erstellen Sie eine andere Kombination von Antikörpern, solange ihre Fluorochromen untereinander kompatibel sind.
2. Kombinieren alle Antikörper in einer einzigen Platte in einer 0,22 um Filterzentrifuge Röhre verwendet werden. Zentrifuge mit einem Festwinkel einzigen Geschwindigkeitszentrifuge 2 Minuten lang oder bis die gesamte Ab Mischung durch den Filter geleitet und keine Antikörperflüssigkeit auf der Oberfläche des Filters bleibt.
3. In geeigneten Volumen gefiltert Antikörper-Cocktail in alle Röhrchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
4. Waschen Sie Perlen mit 2 ml Medium, resuspendiert in 400 ul Medium und sofort ausgeführt werden (oder innerhalb des gleichen Tages) am Durchflusszytometer.

2.4) Cytometer-Setup und Sample Lesen

1. Öffnen Sie die FCM-Software. Vor dem Setup zu experimentieren, gehen täglich Gerätekalibrierung und Setup mit Geräteeinstellung Perlen (nach Herstellerangaben).
2. Wenn der EV-Proben mit mehr als einem Antikörper gefärbt worden und mehrere Fluorochrome auf einmal gemessen werden, zu berechnen Korrekturwerte wie folgt:
   1. 2 Tropfen Entschädigung Perlen an vorher markierten Röhrchen (1 Röhrchen für jedes Fluorochrom konjugierte Antikörper), und fügen Sie die empfohlene Menge an Antikörper. 2 Tropfen negative Kompensations Perlen in ein anderes Röhrchen als ungefärbte Kompensationssteuerung zu verwenden. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten, Waschen mit PBS und Resuspendieren in 400 ul PBS.
   2. Mit dem FCM-Software, laufen jede Ausgleichsrohr und passen fluoreszierende Spannungen, jeden Peak bei etwa 10 ⁴ auf einer 5-Dekade logarithmischen Skala zu platzieren. Sicherzustellen, dass der Fluoreszenz-Peak am höchsten (am hellsten) in einem eigenen Fluoreszenzkanal im Vergleich zu allen anderen Kanälen, underneut einstellen Spannungen von Fluoreszenzparameter, wenn nötig. Führen Sie jede einzeln gefärbten comp Rohr und erfassen mindestens 5.000 Veranstaltungen pro Röhrchen.
   3. Wählen Sie die Registerkarte "Experiment", dann "Compensation", dann "Compensation berechnen", um Korrekturwerte für alle Proben beantragen.
3. Ändern Sie den FSC und SSC Spannungsparameter maßstabsloggt und wählen Sie den niedrigsten Schwellenwerte vom Zytometer (FSC = 200 und SSC = 200) erlaubt für jeden.
4. Führen Proben, Tor auf der Singulett-Perlen Bevölkerung und erwerben 2.000 Veranstaltungen in diesem Tor. Export .fcs Dateien.
5. Verwenden FCM-Analyse-Software zu analysieren .fcs Dateien. Tor auf Singulett-Perlen. Berechnen des geometrischen Mittels der Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes Fluorochrom und Vergleichen mit dem MFI der negativen Kontrolle.

Ergebnisse

Abbildung 1 skizziert den gesamten Verarbeitungssystem für die Isolierung und den Nachweis von EVs entweder mit dem Wulst-basierten Verfahren oder einzelne Nachweismethode. Individuelle Detektion EVs mit FCM funktioniert gut für die Analyse großer EVs aber die meisten Zytometer nicht fähig sind einzeln Detektieren von Teilchen so klein wie Exosomen. Ein Wulst basierte Ansatz erlaubt kleine EVs nachzuweisenden jedoch gibt es Nachteile bei der Verwendung dieser Verfahren verbunden sind, wie in <...

Diskussion

Zwei verschiedene Protokolle für die Isolierung, Behandlung und Analyse EVs vorgestellt, unter Verwendung entweder eines einzelnen Detektions oder Wulst-basierten Ansatz. Die Auswahl des geeignetsten Methode zu verwenden, ist nicht immer einfach und erfordert ein Verständnis der Probe, die ebenfalls getestet, wie die einzelnen Subpopulationen von Interesse. Weiterhin muss die Empfindlichkeit des Zytometer zur Erfassung verwendet bei der Auswahl des am besten geeigneten Verfahren sein. Oft gibt es keine einzelne beste ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12x75 polystrene	BD Biosciences	352058
50 ml Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230