Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Zusammenfassung

Vektor-Mücken verursachen mehr menschliches Leid als jeder andere Organismus - und tötet mehr als eine Million Menschen pro Jahr. Die Moskitogenomprojekten erleichtert die Forschung in neue Facetten Moskito Biologie, einschließlich funktionale genetische Studien in der Primär afrikanischen Malariavektor Anopheles gambiae und dem Dengue-Fieber und Gelbfieber-Vektor Aedes aegypti. RNA Interferenz- (RNAi-) vermittelte Gen-Silencing ist verwendet worden, um Gene von Interesse in beiden dieser Krankheitsvektor Mückenarten zielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die mit Lebensmitteln kombiniert und durch Larven aufgenommen. Diese technisch einfach, mit hohem Durchsatz und relativ kostengünstige Methode, die mit langen doppelsträngigen RNA (dsRNA) oder kleine interferierende RNA (siRNA) Moleküle kompatibel ist, ist für die erfolgreiche Knockdown von einer Anzahl von verschiedenen Genen in A. verwendet gambiae und A. aegyptiLarven. Nach Larvenernährung, Knockdown, die durch qRT-PCR und in situ Hybridisierung überprüft wird, kann zumindest durch die späten Puppenstadium fortbestehen. Diese Methode kann für eine Vielzahl von vor allem Insektenarten, darunter landwirtschaftliche Schädlinge sowie andere nicht-Modellorganismen sein. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit im Forschungslabor, in der Zukunft, Chitosan, einem kostengünstigen, nicht-toxischen und biologisch abbaubaren Polymer, könnte möglicherweise in dem Gebiet verwendet werden.

Einleitung

Blut-Fütterung Trägermücken der Anopheles und Aedine Gattungen übertragen Krankheitserreger für einige der schlimmsten Geißeln der Menschheit verantwortlich. Schätzungsweise 3,4 Milliarden Menschen mit einem Risiko für Malaria zu erkranken, die für mehr als eine halbe Million Todesfälle pro Jahr weltweit verantwortlich ist. Malaria Ergebnisse vor einer Infektion durch Plasmodium sp. Parasiten, die den Menschen durch den Stich infizierter Mücken auf der Gattung Anopheles, einschließlich der Hauptnischen Vektor Anopheles gambiae (übertragen werden http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) ^1. Aedes aegypti ist die primäre Trägermücke für Dengue-Virus, die Dengue-Fieber, eine unspezifische fieberhafte Erkrankung, die die am weitesten verbreitete und wichtige arboviral Krankheit in der Welt ist, verursacht. Dengue-Virus ist derzeit eine Bedrohung für> 2,5 Milliarden Menschen in den Tropen, mit einer jährlichen incidence von rund 50 Millionen Fällen zu ~ 24.000 Todesfälle pro Jahr ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) ^2. Trotz der dramatischen weltweiten Auswirkungen der Moskitos übertragene Krankheiten auf die menschliche Gesundheit sind effiziente Mittel zur Prävention und Behandlung dieser Krankheiten fehlt. Moskito-Kontrolle ist derzeit die beste Methode zur Verhütung von Krankheiten.

Das Potenzial für die Steuerung von Arthropoden übertragene Krankheiten, die durch die genetische Manipulation von Wirtsinsekten ist seit mehr als vier Jahrzehnten ³ anerkannt worden. Transgene Stämme von A. aegypti entwickelt, um eine reprimierbaren frauenspezifische flug Phänotyp haben in jüngster Zeit, das Potenzial für den Einsatz von transgenen Kontrollstrategien zu verwirklichen ^4-6. Diese Fortschritte haben die Forscher herausgefordert, neue genetische Ziele für Vektorregelung und zusätzliche Mittel zum Manipulieren der Genfunktion in Überträgermücken zu identifizieren. Eine Veränderung der Genexpression dährend Entwicklung, wie in weiblich-flug Mücken ⁴ der Fall war, kann die Aufklärung von neuen Kontrollstrategien zu fördern. Jedoch hauptsächlich auf technische Herausforderungen, die Funktionen der wenigen Genen während der Entwicklung A. gekennzeichnet gambiae, A. aegypti oder andere Mückenarten.

Seit ihrer Entdeckung in C. elegans ^7, RNA-Interferenz (RNAi), die in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen konserviert ist, wurde umfassend für funktionelle genetische Untersuchungen in einer Vielzahl von Organismen, einschließlich Insekten ^8,9 verwendet. Die RNAi wird von Dicer, das spaltet lange dsRNA in kurze 20-25 Nukleotide langen siRNAs, die als sequenzspezifische interfering RNA funktionieren begonnen. siRNAs Stille Gene, die in der Sequenz komplementär sind durch die Förderung Transkript Umsatz, Spaltung, und die Störung der Übersetzung ^9. Lange dsRNA-Moleküle (in der Regel 300 bis 600 bp) oder kundenspezifischen siRNAs eine particular Sequenz kann im Forschungslabor zur Dämpfung jedes Gen von Interesse verwendet werden. Durch die Verwaltung, wenn interfering RNA geliefert wird, können die Forscher die Zeit zu steuern, mit der Gen-Silencing-Eingeweihten. Dieser Vorteil ist nützlich, da es verwendet werden, um Herausforderungen wie die Entwicklung Letalität oder Sterilität, die die Produktion und Wartung von Stämmen Lager vererbbare Mutationen, eine kostspielige und arbeitsintensiver Prozess, der nicht in allen Insektenarten ist noch behindern überwunden werden können. Obwohl der Grad der Gen-Silencing durch RNAi von Gen zu Gen, Gewebe zu Gewebe und Tier zu Tier variieren, wird RNAi weithin für die funktionelle Analyse von Genen in Moskitos und andere Insekten ^8,9 verwendet.

Drei interfering RNA Lieferstrategien in Mücken verwendet: Mikroinjektion, Einweichen / topische Anwendung und Einnahme. Für eine detaillierte Geschichte und ein Vergleich der Verwendung dieser drei Techniken in Insekten, wenden Sie sich bitte an Yu et al ⁸ beziehen. WE erfolgreich als Mittel zur Bereitstellung von siRNAs verwendet Mikroinjektion ^{von 10} bis Entwicklungsgenen in A. Ziel aegypti Embryos, Larven und Puppen ^11-14. Diese arbeitsintensive Lieferstrategie erfordert jedoch sowohl eine Mikroinjektion Einrichtung und eine geschickte Hand. Darüber hinaus ist die Mikroinjektion stressig für den Organismus, ein Störfaktor, vor allem wenn Verhaltensphänotypen bewertet werden. Schließlich können die Mikroinjektion Lieferung nicht auf den Bereich für die Vektorregelung verlängert werden. Alternativ Einweichen der Organismus in interfering RNA-Lösung hat sich auch ein beliebtes Mittel zur Induktion Gen-Silencing, wie es bequem und erfordert wenig Ausrüstung oder die Arbeitskräfte. Einweichen wurde hauptsächlich in Insektenzelllinie angewendet wurde studiert ^8, jedoch in einer neuen Studie wurde Zuschlag in A. erreicht aegypti Larven in einer Lösung von dsRNA ^15, die die Tiere zu sein schien Einnahme eingetaucht. Für Studien, die Analyse von mehreren experimental Gruppen oder Phänotypen ist Einweichen ziemlich teuer. Lopez-Martinez et al. ¹⁶ beschrieben Rehydrierung angetrieben RNAi, einen neuen Ansatz für interfering RNA Lieferung, die Dehydratisierung in Kochsalzlösung und Rehydrierung beinhaltet mit einem einzigen Tropfen Wasser enthält interfering RNA. Dieser Ansatz bedeutet Senkung der Kosten mit ganzen Tiereint assoziiert, aber teurer ist als die Mikroinjektion und in ihrer Anwendung nicht auf Spezies, die eine hohe osmotische Druck tolerieren kann begrenzt werden. Darüber hinaus ist es schwierig, sich vorzustellen, wie Tauchen oder Dehydratation / Rehydratation Tauch Methode könnte zur Vektor-Kontrolle im Bereich angepasst werden. Aus diesen Gründen ist für die post-embryonale Studien, ist die Lieferung von interfering RNA mit aufgenommenen Nahrung eine Alternative Strategie.

Obwohl Einnahme basierte Strategien müssen nicht in allen Insektenarten, vor allem wohl Drosophila melanogaster ist orale Verabreichung von interfering RNA mit der Nahrung vermischt Gen si gefördertlencing in eine Vielzahl von Insekten ^8,17, einschließlich A. aegypti Erwachsene ^18. Wir beschriebenen Chitosan-Nanopartikel vermittelten RNAi in A. gambiae Larven ¹⁹ und haben diesen Ansatz zur Reduktion der Genexpression in A. erfolgreich angewendet aegypti Larven ^20,21. Hier Methodik für diese RNAi Verfahren, das Einschließen von interfering RNA durch das Polymer Chitosan umfasst, ist detailliert. Chitosan / interfering RNA Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationen mit interferierenden RNA durch die elektrostatischen Kräfte zwischen den positiven Ladungen der Aminogruppen in Chitosan und negativen Ladungen von den Phosphatgruppen auf der Hauptkette des interferierenden RNA ¹⁹ durch gebildet. Das beschriebene Verfahren ist sowohl mit langen dsRNA-Moleküle (im folgenden als dsRNA bezeichnet) oder doppelsträngigen siRNA (nachstehend als siRNA bezeichnet) kompatibel. Nach der Synthese Chitosan / interfering RNA Nanopartikel mit Futtersaft gemischt und geliefertLarven bei Einnahme. Diese Methode ist relativ kostengünstig, erfordert wenig Ausrüstung und Arbeits ¹⁹ und ermöglicht Hochdurchsatz-Analyse von mehreren Phänotypen, einschließlich der Analyse der Verhaltensweisen ^20,21. Diese Methodik, die für die Gen-Silencing-Studien in anderen Insekten, einschließlich anderer Krankheitsvektoren und Insekten landwirtschaftlichen Schädlingen angepasst werden kann, könnte möglicherweise für das Gen-Silencing in einer Vielzahl von anderen Tierspezies verwendet werden. Außerdem könnte Chitosan, ein kostengünstiges, nicht-toxische und biologisch abbaubares Polymer ^22, möglicherweise in dem Feld für artspezifischen Moskitobekämpfung genutzt werden.

Protokoll

1. Mückenarten und Aufzucht

1. Pflegen A. gambiae G3 und A. aegypti Liverpool IB12 Stämme (in den repräsentativen Studien unten verwendet) oder andere Stämme von Interesse nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor beschrieben ^23,24.

2. dsRNA und siRNA-Design und Produktion

1. Design Primer an die dsRNA spezifisch für das Gen von Interesse Vorlagen zu konstruieren. Verwenden Sie die E-RNAi-Tool ^25. Produzieren dsRNA gemß der Methode der Wahl oder, wie zuvor beschrieben ^19.
   1. Für eine negative Kontrolle, synthetisieren dsRNA ¹⁹ entsprechend der Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), β-Galactosidase (β-gal) oder ein anderes Gen nicht in Moskitos ausgedrückt. Falls gewünscht, kann dsRNA dazu verwendet, die unten zusammengefaßt sind repräsentative Ergebnisse erzeugen ¹⁹ als eine positive Kontrolle verwendet werden. Shop dsRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 °; C, bis sie benötigt.
2. Alternativ Design-Gen-spezifische siRNA nach Standardlaborpraxis oder wie zuvor ¹⁰ beschrieben. Verwürfeln die Sequenz eines Zuschlags siRNA negative Kontroll-siRNA, die keinem Moskito Gen nicht entspricht entwerfen. Kaufen Sie die kundenspezifischen siRNAs, die durch eine Reihe von seriösen Anbietern zur Verfügung stehen.
   1. Falls gewünscht, können siRNAs verwendet, die im Folgenden zusammengefasst sind repräsentative Ergebnisse erhalten ^20,21 als positive Kontrollen verwendet werden. Shop siRNA in RNase-freiem Wasser gelöst bei -80 ° C, bis sie benötigt.

3. Vorbereitung Chitosan / interfering RNA Nanopartikel

1. Sammeln vorgefertigten RT 100 mM Natriumsulfat (100 mM Na ₂ SO ₄ in deionisiertem H ₂ O) und 0,1 M Natriumacetat (0,1M NaC ₂ H ₃ O ₂ -0.1 M Essigsäure, pH 4,5, in entionisiertem H ₂ O) Puffer.
2. Auflösen von Chitosan (≥75%deacetylierten) in 0,1 M Natriumacetat-Puffer auf 0,02% (w / v) Arbeitslösung und Halten der Lösung bei RT vor der Verwendung.
3. Löse dsRNA oder siRNA in 50 ul entionisiertem H ₂ O und sie dem 100 mM Natriumsulfat-Puffer zu einer 100 ul Lösung von 32 ug dsRNA / siRNA pro 100 ul 50 mM Natriumsulfat bilden.
4. 100 l Chitosanlösung zur dsRNA / siRNA-Lösung und dann das Gemisch in einem Wasserbad bei 55 ° C für 1 min. Eine Steuer durch Zugabe von 100 ul 50 mM Natriumsulfat zu 100 ul Chitosan-Lösung zu stellen und die gleiche Vorgehensweise.
5. Mischen der Lösungen sofort für 30 sec mittels Hochgeschwindigkeits Verwirbeln bei RT, um die Bildung von Nanopartikeln zu erleichtern.
6. Zentrifugiere das Gemisch bei 13.000 × g für 10 min bei RT, nach welcher Zeit sich ein Pellet sichtbar sein soll. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube. Der Luft trocknen das Pellet für ≈10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie es an Moskito Essen zuzubereiten.
7. Measure die Konzentration von dsRNA / siRNA im Überstand unter Verwendung des Überstands von der Steuerung (siehe 3.5) als leer, um die Gesamtmenge an dsRNA / siRNA, die im Überstand blieb berechnen. Verwenden der Differenz zwischen den Ausgangsmengen an dsRNA / siRNA und in den Überständen verbleibende, den Prozentsatz der dsRNA / siRNA in Nanopartikel eingeschlossen berechnen Mengen. Dieser Ladeeffizienz ist in der Regel über 90%.
8. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn mehr Nanopartikel benötigt werden. Verwenden Sie die getrockneten Nanopartikel sofort. Der Einfluss der Kühllagerung der Teilchen vor der Verwendung wurde nicht untersucht.

4. Vorbereitung Mosquito Lebensmittel enthalten Chitosan / interfering RNA Nanopartikel

1. Herstellung von 1 ml einer 2% igen Lösung (w / v) in entionisiertem Wasser, schmelzen die Agarose und Halten geschmolzenen Agarose-Lösung in einem 55 C-Wasserbad vor dem Gebrauch.
2. Mix Fischfutter Flocken (47% Rohprotein, min. Rohfett 10%, max. Rohfaser 3%) und Trockenhefe in eineVerhältnis von 2: 1 (w / w). Schleifen Sie die Mischung, um kleine Partikel mit einem Mörser und Stößel (passable bis Nr 50 USA Standard-Test-Sieb). Verwenden Sie die Grundnahrung, die bräunlich gefärbt sein sollte, entweder sofort oder lagern Sie es in einem verschlossenen Behälter bei 4 ° C für mehrere Wochen.
3. In einer 1,5-ml-Tube, mischen 6 mg Boden Nahrung mit den getrockneten Nanopartikel aus Abschnitt 3.7 mit einem Zahnstocher.
4. Zugabe von 30 ul 2% vorge geschmolzener Agarose-Gel-Lösung auf die Lebensmittelnanopartikelmischung; sofort und gründlich zu rühren, indem Sie einen Zahnstocher oder Pipettenspitze.
5. Verwenden Sie das Gel Essen und Nanopartikel enthalten, um die Mückenlarven sofort füttern. Alternativ, wenn das Gel vollständig bei RT erstarrte, speichern das Gel bei 4 ° C lagern und am nächsten Tag oder bei -80 ° C für die spätere Verwendung.

5. Ernährung Mückenlarven mit Lebensmittel, die Chitosan / interfering RNA Nanopartikel

1. Feeding A. gambiae Mückenlarven:
   1. Entfernen eines single Gel-Pellet aus der 1,5-ml-Röhrchen mit einem Zahnstocher und schneiden Sie es in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher.
   2. Übertragungs 20 dritte Larvenstadium in einen 500 ml Petrischale mit 100 ml entionisiertem Wasser.
   3. Führen Sie das Mückenlarven, indem eine Scheibe des Gels Pellet (fein in kleine Stücke gehackt) pro Petrischale einmal täglich für vier Tage. Achten Sie darauf, Larven auf dem Pellet, die in der Größe deutlich reduziert werden sollte oder am nächsten Tag völlig abwesend zu beobachten. Nach der Zeit wird Mücken in späten vierten Larvenstadium entwickeln.
   4. Notieren Sie alle sichtbaren phänotypischen Veränderungen während des Experiments. Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 am Ende der viertägigen Zeitraum diskutiert.
2. Feeding A. aegypti Mückenlarven:
   1. Schneiden Sie die Gel-Pellet in 6 gleiche Scheiben mit einem sauberen Rasierklinge oder Zahnstocher.
   2. Zeigen 50 alters synchronisiert 24 Stunden nach dem Schlüpfen Ei fierste Larvenstadium in eine Petrischale in ≈40 ml entionisiertem Wasser.
   3. Feed-Larven eine Scheibe pro Petrischale 4 Stunden / Tag, dann Transfer Larven zurück zu den regelmäßigen Larven Ernährung von 2: 1 Bodenfischfutter Flocken und Trockenhefe für den Rest des Tages. Wiederholen Sie den Vorgang täglich während der vier Larvenstadien.
   4. Untersuchen Sie die Transkriptionsniveaus und andere phänotypische Veränderungen, wie in Abschnitt 6 an den gewünschten Entwicklungszeitpunkten diskutiert.

6. Bestätigung der Gene Knockdown

1. Relative Transkript Quantifizierung durch qRT-PCR in A. aegypti und A. gambiae Larven.
   1. Führen und qRT-PCR-Assays zu analysieren mit drei biologischen Replikaten auf mindestens 10 gepoolten Kontroll vs. experimentelle Larven, wie beschrieben, ^11,19,20, oder nach Standard-Laborverfahren. Repräsentative Ergebnisse sind unten aufgeführt.
   2. Für die Analyse eines bestimmten Gewebetyp / Körperteil (dh., Gehirn oder Antenne), perform qRT-PCR, wie in 6.1.1 folgende Präparation beschrieben, um das Gewebe von Interesse zu erholen (siehe zB Mysore et al. ^21).
2. Bestätigung der Zuschlags durch in situ Hybridisierung
   1. Synthetisieren Digoxygenin-markierte Antisense-und Sense-Steuer Ribosonden nach Standardlaborpraxis oder wie beschrieben ^26.
   2. Ausführen der in situ Hybridisierung gemäß dem Haugen et al. ²⁷ Protokoll zur Bestätigung der Zuschlags wie zuvor ^11,20 beschriebene und in der repräsentative Ergebnisse weiter unten diskutiert.
3. Bestätigung der Zuschlags immunhistochemisch
   1. Wenn Antikörper gegen das Proteinprodukt des Gens gezielt zur Verfügung stehen, ausführen Immunhistochemie wie zuvor beschrieben ^28, die Identifizierung von Individuen mit den höchsten Niveaus der Zuschlags für Phänotypanalyse ²⁰ erleichtert, wie in der Vertre exemplifiziertve Ergebnisse unten.

Ergebnisse

A. gambiae:

Chitosan / dsRNA Nanopartikel aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen den Aminogruppen des Chitosans und der Phosphatgruppen des dsRNA gebildet. Die Effizienz der dsRNA Einbau in Nanopartikel der Regel über 90%, wie durch Abreicherung von dsRNA aus der Lösung gemessen. Rasterkraftmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Chitosan-dsRNA Partikelgröße im Durchschnitt 140 nm im Durchmesser reichen von 100 bis 200 nm (Abbildung 1...

Diskussion

Das Chitosan / interfering RNA Nanopartikel hierin beschriebenen Methodik wurde verwendet, um Gene während Larvenentwicklung in A. zielgerichteter gambiae (2, 3) und A. aegypti (Figuren 4, 5, 6, Tabelle 1, 2). Chitosan-Nanopartikeln kann entweder mit langen dsRNA oder siRNA, die beide erfolgreich in Moskitos verwendet worden, wie durch die hierin beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigten weiterhin hergestellt werden. Synthese der dsRNA ist weniger teu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.02 ml pipetteman	Rainin	PR20	for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman	Rainin	PR200	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-120	for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman	Rainin	PR1000	for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube	Fischer Scientific	05-408-046	for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5	TEKnova	S0299	to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade	BDH	VWR BDH3092-500MLP	to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade	MP Biomedicals LLC.	800668	to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge	Eppendorf AG	5415D	to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells	Sigma-Aldrich	C3646-25G	to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast	Universal Food Corp	NA	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool	German Cancer Research Center	NA	for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food	Wardley	Goldfish FLAKE FOOD	to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath	Thermo Scientific	51221048	to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice	not applicable	not applicable	for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
[header]
Ice bucket	Fisher Scientific	02-591-44	for storage of ice used during the procedure
liver powder	MP Biomedicals LLC.	900396	to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven	A variety of vendors	not applicable	to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm)	Fischer Scientific	875713	interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter	Mettler Toledo	S220	for preparation of buffers
Razor blade	Fischer Scientific	12-640	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA	Thermo Scientific/Dharmacon	custom	for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)	BDH/distributed by VWR	VWR BDH0302-500G	to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer	VWR	61066-046	to measure the water bath temperature
Tooth picks	VWR	470146-908	for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer	A variety of vendors	not applicable	for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer	Fischer Scientific	02-216-108	for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper	Fischer Scientific	NC9798735	to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings