Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Zusammenfassung

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Zusammenfassung

Sowohl der Transkription und post-transkriptionelle Regulation haben einen großen Einfluss auf Gene Expression. Jedoch konzentrieren sich allgemein angenommen zellbasierten Screening-Assays auf der transkriptionellen Regulation, wobei im wesentlichen auf die Identifizierung von Promotor-Targeting-Moleküle ab. Dadurch werden posttranskriptionale Mechanismen weitgehend durch Genexpression gezielte Medikamentenentwicklung aufgedeckt. Hier beschreiben wir ein Assay auf Zellbasis bei der Untersuchung der Rolle von der 3'-untranslatierten Region (3 'UTR) in der Modulation des Schicksal der mRNA ist, sowie für die Identifizierung von Verbindungen in der Lage, ihn zu ändern. Der Test basiert auf der Verwendung eines Luziferase-Reporterkonstrukt, das die 3'-UTR des Gens von Interesse stabil in einer krankheitsrelevanten Zelllinie integriert basiert. Das Protokoll wird in zwei Teile aufgeteilt, wobei die anfängliche Konzentration auf der primären Screening auf die Identifizierung von Molekülen beeinflussen Luciferase-Aktivität nach 24 Stunden der Behandlung ab. Der zweite Teil des Protokollbeschreibt die Gegen Screening notwendig, Verbindungen modulieren Luciferase-Aktivität spezifisch durch die 3'-UTR diskriminieren. Neben dem detaillierten Protokoll und repräsentative Ergebnisse stellen wir wichtige Überlegungen über die Assay-Entwicklung und bei der Validierung des Treffers (en) des endogenen Ziel. Die beschriebene zellbasierten Reportergentest ermöglicht es den Wissenschaftlern, um Moleküle zu modulieren Protein-Ebene über posttranskriptionale Mechanismen abhängig von einer 3'-UTR identifizieren.

Einleitung

Für eine lange Zeit der Transkriptionsregulation der Genexpression wurde gedacht, eine wichtige, wenn nicht ausschließliche Rolle bei der Kontrolle der Proteinproduktion zu spielen. Immer mehr deutet jedoch an, dass nach der Transkriptionsregulation trägt so viel, wenn nicht mehr als, Transkriptionsregulation, zelluläre Proteinmenge ^1,2 zu bestimmen. Post-Transkriptionskontrolle der Genexpression ist viel komplexer und aufwendiger, als es auf den ersten Gedanken. In der Tat, alle verschiedenen Phasen der Post-Transkriptionskontrolle sind entstanden, um zu regeln, einschließlich mRNA-Prozessierung, Lokalisierung, Umsatz, Übersetzung ³ sowie die neu beschriebene reversible RNA-Methylierung ^4. Aus einer Reihe von post-transkriptionale Regulationsprozesse potenziell betroffenen nachfolgend beschriebene Test konzentriert sich auf solche, die 'untranslatierten Region (3'-mRNA 3 UTR). 3'UTR breit wirkt mRNA Schicksal hauptsächlich über spezifische Wechselwirkung von RNA-bindenden proteins und nicht-kodierenden RNAs seine regulatorischen Sequenzen und / oder Sekundärstrukturen ^5. Daher werden kleine Moleküle, die diese Interaktionen zu verändern oder beeinträchtigen aufwärts Signaltransduktionswege die Balance, die Proteinmenge reguliert verschieben. Dieser Therapieansatz ist für den menschlichen Krankheiten, für die Beweise vorliegen, die zeigen, dass krankheitsrelevante Gene zu posttranskriptionale Verordnung, die somit eine potenzielles Ziel für pharmakologische Intervention ausgesetzt besonderer Bedeutung. Daher können Systeme erlauben zum Screenen von mRNA-Niveaus "Modulatoren durch Beeinträchtigung posttranskriptionalen Kontrollmechanismen in einem Hochdurchsatzformat wertvolle Hilfsmittel bei der Identifizierung von potentiellen neuen Medikamenten zu werden.

Die beschriebenen zellbasierten Reportergentest erlaubt die Identifizierung von Verbindungen, die mRNA Schicksal über Mechanismen abhängig von seinem 3 'UTR modulieren. Es besteht aus mehreren Haupt cBAUTEILE (Abbildung 1) und erfordert einige vorbereitende Schritte, um die Durchführbarkeit des Assays zu überprüfen. Zunächst wird das Reporterkonstrukt entworfen, um das 3'-UTR von einem Gen in der Nähe sind. Die 3'-UTR an das Ende eines Reportergens wie Luciferase (1) verschmolzen ist. Alle Änderungen, die in der posttranskriptionellen Kontrolle Mechanismen, durch die eingelegte 3'UTR ausgeübt wird, die Stabilität und / oder Translationseffizienz dieses chimären Transkript zu verändern, was zu vielfältigen Luciferase Ebenen. Daher ändert der Luciferaseaktivität dienen als indirektes Maß der betroffenen posttranskriptionale Regulation des Gens von Interesse. Die zweite Komponente des Systems ist ein Steuerreporterkonstrukt eine identische Expressionsplasmid, das das gleiche Reportergen exprimiert, jedoch keine 3'-UTR enthalten. Die beiden Reporter Plasmide können im Labor konzipiert mit konventionellen Molekularbiologie Protokolle werden oder von kommerziellen Quellen bezogen.

Die Auswahl einer geeigneten Zelllinie ist für den Assay Konstruktion. Welche Zelllinie ist die optimale Modell hängt von zahlreichen Faktoren, die von klinischen Anforderungen wie maximale Ähnlichkeit mit Pathologie, nur praktische Fragen wie Verfügbarkeit, Transfizierbarkeit und Wachstumseigenschaften. Wichtig ist, dass vor gehen sollte man sicherstellen, dass die Fusion des 3'-UTR an den Reporter-Gen einen erwarteten Einfluß auf die Höhe des chimären Transkript. Das Fehlen signifikanter Unterschied in Luciferase-Signal von dem 3'-UTR-Lager und Steuerreporterkonstrukte transient in den ausgewählten Zellen transfiziert würde, dass der 3'-UTR ist nicht funktionsfähig in diesem zellulären Modell, woraufhin zur Suche von anderen vorge. Für die Hochdurchsatz-Format, müssen die 3 'UTR-Lager und Steuer Luciferase-Reporter-Konstrukte stabil in der gewählten Zelllinie integriert werden. Mit einem stabil über transient transfiziert integriertZelllinie ist bevorzugt aus mehreren Gründen. Dadurch wird die Auswahl einer zellulären Modell inklusive schwer zu transfizierenden Zelllinien zu erweitern, verringern die Variabilität in den Daten, die aus Schwankungen der Transfektionseffizienz, sinken die Kosten. Außerdem, auf transiente Transfektion Zellen werden sehr oft mit einem DNA-Plasmid, die zur Sättigung des Systems überlastet. In diesen Einstellungen eine weitere Erhöhung der Reporterexpression könnte eine Herausforderung sein, was zu einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber potenziellen upregulating Verbindungen.

Schließlich, wenn alle Testkomponenten eingerichtet sind, ist es kritisch, bevor er in die Hochdurchsatz-Format, um die Durchführbarkeit des Tests bestimmen, dh, ob die Luciferase-Aktivität kann in der Tat nach oben und nach unten reguliert und zwar über dem eingesetzten 3 'sein UTR. Die besten Kontrollen wären kleine Moleküle berichtet, dass die Stabilität oder die Übersetzbarkeit der mRNA durch die 3'-UTR von Interesse zu modulieren. Wenn mit diesen istnicht möglich ist, werden Ersatzkontrollen imitieren die gewünschte Wirkung angenommen. Diese könnten miRNAs oder RNA-Bindungsproteine ​​bekannt, ihre Wirkung über die Bindung an der 3'-UTR von Interesse auszuüben. Auswertung solcher Kontrollen vor dem primären Screening zeigt nicht nur die Funktionalität des entwickelten Assays, sondern ermöglicht auch eine Schätzung seiner Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und Leistung in der Hochdurchsatz-Format.

Mit dem beschriebenen Protokoll wir abgeschirmte eine 2.000-Substanzbibliothek ^6. Neuroblastom, die häufigste extrakranielle solide Tumor des Kindesalters, wurde als biologisches Modell verwendet und die 3'-UTR des MYCN Onkogen, dessen Verstärkung stark prognostiziert negativen Ergebnis von Neuroblastom, als Zielgen ^7. Abbildung 2 skizziert die Versuchsanordnung. Das Screening wurde in drei Durchgängen mit der Chargengröße von 27 Platten in einem Arbeitsgang abgeschirmt unterteilt. Die Charge von 27 Platten enthalten Spectrum Kollektion BibliothekPlatten n.1-n.8 + n.25 (zum ersten Mal ausgeführt), n.9-n.16 + n.25 (zweiten Lauf) und n.16-n.24 + n.25 (dritte Piste), jeweils Platte dreifach abgeschirmt. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek Platte (n.25) in allen drei Läufen die Ermöglichung interLauf Vergleich untersucht. Das Protokoll beschreibt eine einzige Serie von 9 dreifach getestet Bibliotheksplatten.

Protokoll

HINWEIS: Der Durchsatz solcher Testsysteme hängt von der verfügbaren HTS Laborausrüstung. Dieses Protokoll wird von einem Tecan Freedom EVO 200 Roboter, der Liquid-Handling in 96-Well-Format führt erleichtert. Miniaturisierung zu 384-Well-Format ist ebenfalls möglich. Die Roboter-Liquid-Handling-System wird unter einer Steril um aseptischen Bedingungen in allen experimentellen Schritte halten positioniert. Wenn kein Liquid-Handling-Automatisierung zur Verfügung steht, kann das Protokoll leicht in Niedrigdurchsatzformat angepasst werden.

Primär Screening

1. Tag 1: Bereiten Sie und Samenzellen

HINWEIS: Saatgutzellen zu 80% Zusammenfluss zum Zeitpunkt des Luciferase-Aktivität, dh 48 Stunden nach der Aussaat zu ergeben.

1. Resuspendieren trypsiniert CHP134-mycn3UTR Neuroblastomzellen zu einer Konzentration von 2 × 10 ⁵ Zellen / ml in RPMI, enthaltend 10% FBS und 1% L-Glutamin. Für 27-Platten werden mindestens 250 ml Zellsuspension unter Berücksichtigung Liquid Handling, Mulden Totvolumen und wiederholte Pipettierschritte. Gießen Sie die Zellsuspension in sterile Behälter und legen Sie es auf den Roboter Schreibtisch.
2. Zeigen 9 Barcode-weiß mit flachem Boden 96-well Platten und eine Schachtel mit 200 ul steriler Pipettenspitzen am Roboter Schreibtisch. Mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren vor jeder Dispensation Schritt, um Zellen zu vermeiden Absetzen unter Schwerkraft. Verzichtet werden 75 ul der Zellen in jede Vertiefung der Platten 9, um eine endgültige Dichte von 1,5 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung erhalten.
3. Umfassen die Platten mit den Deckel und sie außerhalb des Inkubators für 30 min, damit sich die Zellen an den Boden der Vertiefung zu sedimentieren. Dies wird Randeffekte zu minimieren.
4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3 zweimal wiederholt, um eine Gesamtzahl von 27 Platten herzustellen.
5. Legen Sie die Platten bei 37 ° C und 5% CO ₂ und Inkubation für 24 Stunden.

2. Tag 2: Behandeln Sie die Zellen mit Bibliothek Verbindungen

ntent "> HINWEIS: Der Spectrum Sammlung kleinen Molekülbibliothek besteht aus 2000 Verbindungen in 8 Reihen und 10 Spalten in 25 Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Konzentration von 10 mM in DMSO angeordnet Die Vertiefungen auf der ersten und letzten Spalten sind steuerungs leer. . Compound Screening-Tests werden typischerweise bei 1-10 uM Konzentration der Verbindung ⁸ durchgeführt. Die hier beschriebene Screening-Protokoll behebt 2 uM als Arbeitskonzentration und 24 Stunden nach dem Test Endpunkt.

1. Auftauen 9 Substanzbibliothek Platten bei Raumtemperatur.
2. Bereiten Sie zwei Tröge mit sterilem PBS und PBS-0,5% DMSO-Lösungen und legen Sie sie auf dem Roboter Schreibtisch. Für jeden Bibliotheksplatte, vorbereitet und kennzeichnen ein Verdünnungsplatte - eine Polypropylen-U-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen mit einem Arbeitsvolumen von mindestens 400 ul. Füllen Sie jede auch der Spalten 2-11 des Verdünnungsplatten mit 398 ul sterilem PBS mit festen Spitzen der Flüssigkeit absetzen. Füllen Spalten 1 und 12 mit 50 & mgr; l steriler PBSmit 0,5% DMSO, um die Fahrzeugkonzentration in den Kontrollvertiefungen (0,02%) zu reproduzieren.
3. Legen Sie zwei Bibliotheksplatten, die entsprechend gekennzeichnet Verdünnungsplatten, zwei Kisten von 50 ul sterile Pipettenspitzen und sechs Zellen Platten auf dem Roboter Schreibtisch. Entdecken Zellen Platten.
4. Pipette 2 ul der 10 mM Stammlösung aus einer von zwei Bibliotheksplatten in der entsprechenden Verdünnungsplatte und gut mischen. Dies wird in einem Zwischenverbindungen Konzentration von 50 uM führen. Mit dem gleichen Satz Spitzen, verzichten 3 ul der 50 uM Verdünnung in 3 Barcode-weiß 96-well Platten mit Zellen. Diese Verdünnungsschema führt zu 2 uM Arbeits Konzentration jeder getesteten Verbindung.
   HINWEIS: Um unnötige Manipulationen mit den Spitzen zu vermeiden, einen vollständigen Satz von 96 Spitzen von Anfang an, auch wenn die Bibliotheksplatten enthalten nur 80 Verbindungen. Dies ist möglich, da die erste und die letzte Spalte der Bibliotheksplatten leer sind.
5. Setzen Sie die Pipettenspitzen und wiederholen Step 2.4 für die zweite Bibliothek Platte.
6. Decken Sie die Zellen Platten und bringt sie in den Inkubator für 24 Stunden.
7. Die Schritte 2,3-2,6 zwei weitere Male für die verbleibenden Bibliotheksplatten.

3. Tag 3: Führen Luciferase Assay

Hinweis: Vor der Durchführung des Luciferase Assay ist es möglich, es mit einer Lebensfähigkeit der Zellen-Assay auf Basis von Reduktion von Resazurin, um eine Zelllebensfähigkeit-Index von jeder Vertiefung ⁹ erhalten zu multiplexen. Multiplexing Luciferase und Lebensfähigkeitstest Assays führt zu einer Verringerung der Luciferase-Signal, kann jedoch vernachlässigt werden, wenn die Zellen eine hohe genug Niveau der Luciferase-Aktivität. Luciferase-Aktivität kann durch eine Vielzahl von kommerziellen und selbst ^10,11 Luciferase Assay-Reagenzien mit stabilen Lumineszenzsignals nachgewiesen werden.

1. Äquilibrieren Sie die wiederhergestellten Luciferase-Reagens der Wahl auf Raumtemperatur. Achten Sie darauf, das Volumen ist ausreichend für alle getesteten Platten. Für 27 Tellers 170 ml Luciferase-Reagens erforderlich unter Berücksichtigung von Liquid Handling werden, Mulden Totvolumen und wiederholte Pipettierschritte. Gießen Sie die Luciferase-Reagens in einen Vorratsbehälter und legen Sie es auf den Roboter Schreibtisch.
2. Entfernen Sie 9 Platten mit Zellen aus dem Inkubator, legen Sie sie auf dem Roboter Schreibtisch, aufzudecken und zu warten, bis auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht. Dann werden 50 ul des Luciferase-Reagens pro Well-Platte durch die Platte. Zwischen den Platten, eine Verzögerung gleich der Lumineszenz Lesezeit von einer Platte. Dies stellt sicher, dass alle Platten innerhalb gleicher Zeitintervall von der Zugabe von Reagenzien gemessen.
3. Nach einer 30-minütigen Inkubation, legen Sie die erste Platte in dem Luminometer und messen Lumineszenz nach einem kurzen Schütteln Schritt. Wiederholen Sie dies für alle Platten. Notieren Sie sich den Barcode jeder Platte und ordnen Sie auf die entsprechende Datendatei, um Fehler, die sich aus einer großen Zahl von Platten behandelt zu vermeiden.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 zweimal für die restlichen 18 Platten mit Zellen.
5. Sammeln Sie die übrigen Luciferase-Reagens und bewahren Sie sie bei -20 ° C.

4. Tag 4: Datenanalyse

1. Prozess experimentellen Daten nach Normierung aller Proben zu dem Mittelwert der auf-Platte mit Träger behandelten Kontrollen. Für jede Bibliothek Verbindung, berechnen Sie den Mittelwert x und SD über dreifach.
2. Wähle bis regulierend und Herunterregulierung Treffern, wenn ein Schwellenwert von x ± k × SD, wo der Mittelwert X und SD werden über alle Test verarbeiteten Werte berechnet, und k ist eine definierte Konstante ist.
3. Wählen Sie eine beliebige Schwelle Abschaltung <20% der mit Träger behandelten Kontrollen, wenn eine Reduktion der Luciferase-Signal wird wahrscheinlich mit der Verbindung Toxizität verbunden. Verwerfen der Zugriffe unterhalb dieser Schwelle wird deutlich verringern eine Reihe von falsch-positive Treffer in der Gegenüberprüfungen.
   HINWEIS: Anstelle von Steuerbasis Normalisierung, können experimentelle Daten Anwendung Z-Score oder die robuste analoge B s verarbeitet werdenKern ^12. Darüber hinaus müssen alternative statistische Ansätze zur Treffer Auswahl stehen ^12.

5. Counter-Screening

HINWEIS: Verbindungen im primären Screen identifiziert (mit der Bezeichnung "Hits") bestätigt und für die Spezifität durch eine Gegenüberprüfungen bewertet.

1. Kirsche holen die ausgewählten Hits aus den in einzelnen 2D-Röhrchen mit Barcode gespeicherten Teilmengen und neue "Hit-Platten", spart das entsprechende Layout. Vergessen Sie nicht, freie Stellen für die Kontrollen zu verlassen.
   HINWEIS: In Ermangelung eines effizienten Rosinenpickerei System, könnte man sowohl die Steuerung und 3'-UTR-tragende Zellen parallel im Primärscreening zu testen. In diesem Fall spezifische Auswahl von Verbindungen mit Wirkungen hängt nur von der eingebrachten 3'UTR nach dem primären Screening wodurch die Notwendigkeit von Gegenscreening möglich wird. Jedoch wird die Screening parallel in zwei Zelllinien, die den Assay verdoppelnKosten.
2. Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt "Tag 1: Bereiten Sie und Samenzellen"), für jeden "Treffer Platte" vorzubereiten drei 96-Well-Platten mit je CHP134-mycn3UTR und CHP134-CTRL stabile Zellen.
3. Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt "Tag 2: Behandeln Sie die Zellen mit Bibliothek Compounds") Setzen Sie jede Hit Platte zu drei CHP134-mycn3UTR und drei CHP134-CTRL-Platten mit 2 & mgr; Arbeitskonzentration zu behandeln.
   Anmerkung: Während der Gegenanzeige, die hier beschrieben wird, in dreifacher Ausführung im einzelnen Dosis von 2 & mgr; M durchgeführt wird, kann es vorteilhaft sein, die Standard-Replikaten ersetzen und Testen der Treffer in 3 Konzentrationen von 10-fachen Verdünnungen im Bereich von 2 & mgr; M bis 20 nM betragen. Die Anwendung dieses Ansatzes würde nicht nur die Daten von dem primären Screen zu bestätigen, sondern auch um vorläufige Dosis-Antwort-Daten auf den primären Zugriffe zu erhalten, minimiert Fehlalarmquote. In diesem Fall sollte eine andere Analyse Pipeline Anwen seined, um die experimentellen Daten bearbeiten und bestätigen die Hits.
4. Nach dem Protokoll für das Primärscreening (Abschnitt "Tag 3: Führen Luciferase Assay"), messen die Luciferase-Aktivität in allen CHP134-mycn3UTR und CHP134-CTRL-Platten.
5. Nach dem Protokoll für die Primärscreening (Abschnitt "Tag 4: Data Analysis"), Normalisieren experimentellen Daten von behandelten Vertiefungen zum Durchschnitt auf-Platte mit Träger behandelten Kontrollen und berechnet den Mittelwert und SD über Replikaten. Für jede getestete Verbindung, berechnen Sie die fache Änderung der Luciferase-Aktivität in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-Zellen. Wählen Sie beliebige fache Veränderung Abschaltungen von> 1,5 und Bedeutung p-Werte von <0,01.
   HINWEIS: Bei den beschriebenen Testeinstellungen der bestimmende Parameter zur Treffer Spezifität ist ein bedeutender fache Änderung der Luciferase-Aktivität in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-Zellen. Bei Bedarf könnte man auch prüfen, Verbindung Toxizität, indem gleichzeitig eine Zelllebensfähigkeitstest auf dem SEwählten Verbindungen. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn die primäre Treffer werden in einer Dosis-Wirkungs-Analyse Gegen abgeschirmt. Für eine Einzeldosis, unsere Erfahrung zeigt eine starke Korrelation reduziert Luciferaseaktivität mit verringerter Lebensfähigkeit der Zellen ^6. Daher verringerte die Luciferase-Aktivität in den Zielzellen als auch die Kontrollzellen als Indikator der Toxizität der Verbindung bei der getesteten Konzentration zu berücksichtigen.

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Ansatz, abgeschirmt wir eine 2.000-Substanzbibliothek für potentielle Modulatoren der posttranskriptionellen Kontrollmechanismen durch die 3'-UTR des Gens MYCN ausgeübt wird. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse des primären Screening von einer einzigen Bibliotheksplatte veranschaulicht. Luciferase-Signal in Prozent der mit Träger behandelten Kontrollen angezeigt, wurde bestimmt, indem die Luciferase-Aktivität in dreifacher Platten CHP134-mycn3UTR Zellen mit Verbindun...

Diskussion

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A