3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Zusammenfassung

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Zusammenfassung

Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz.

Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 ^lo, Aire-negative in CD80 ^hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 ^hallo mTEZ.

Einleitung

Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Abweichung in den regulatorischen T-Zelllinie beteiligt. Im Zusammenhang mit der zentralen Toleranzinduktion sind mTEZ, daß sie ein breites Spektrum von gewebe beschränkt Selbst-Antigene (TAA), die so Spiegeln des peripheren selbst exprimieren einzigartig. Dieses Phänomen wird als Promiscuous Genexpression (pGE)^1,2.

Die meisten aktuellen Studien zu diesem faszinierenden Zelltyp verlassen sich auf ex vivo isolierten Zellen, wie verschiedene kurzfristige 2D-Kultursystemen unweigerlich zum Verlust von PGE und Schlüsselregulator Moleküle wie MHC-Klasse II, FOXN1 und Aire in den ersten 2 Tagen ^3-6 geführt . Es blieb jedoch unklar, welche bestimmte Komponenten und Funktionen des intakten 3D Geflecht des Thymus in 2D-Modelle fehlt. Die Reaggregation Thymus-Organkultur (RTOC) bisher das einzige 3D-System, das die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung ermöglicht, einerseits und stromal cell biology, auf der anderen Seite war, in einer intakten Thymus Mikro ^7. Dennoch haben RTOCs bestimmte Beschränkungen, das heißt sie enthalten bereits eine komplexe Mischung von Zellen, erfordern die Eingabe von fötalen Stromazellen und ertragen einer maximalen Kultivierungsdauer von 5 bis 10 Tagen.

Der Mangel an reduktionistischen in vitro Kultursystemen hat das Studium behindertmehrere Aspekte der T-Zell-Entwicklung und Thymus Organogenese nicht zuletzt die molekulare Regulation von PGE und seiner Beziehung zu der Entwicklungsbiologie mTEZ.

Durch die enge Bezogenheit der strukturierten Organisation der Epithelzellen der Haut und der Thymus, entschieden wir uns für ein 3D organotypische Kultur (OTC) System, das ursprünglich entwickelt worden war, um die Differenzierung von Keratinozyten in vitro nachzuahmen und so eine dermale Äquivalent. Die OTC-System besteht aus einem inerten Gerüstmatrix mit dermalen Fibroblasten, die in einem Fibrin-Gel, auf die Keratinozyten ausgesät ^8,9 gefangen sind überlagert. Hier ersetzt wir Keratinozyten mit gereinigtem mTEZ. Und dabei die grundlegenden Merkmale dieses Modells optimierten wir bestimmte Parameter.

In der angenommenen OTC Modell mTEZ vermehrt unterzog terminalen Differenzierung und gepflegt mTEC Identität und PGE, somit eng in vivo mTEZ Entwicklung nachahmt ^{10 ist. Dieses Datenblatt ein detailliertes Protokoll, das die schrittweise Einrichtung von Thymus OTCs.}

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet.

1. Isolierung von mTEZ aus Thymus

HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor ¹ unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt.

1. Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI 1640-Medium (enthaltend 5% FCS).
2. Schneiden Sie die Thymi in feine, kleine Stücke schneiden und in einem Rundrohr mit ~ 5-30 ml RPMI-Medium und sanft umrühren mit einem Magneten für 10 min bei RT.
3. Danach dekantiert die überstehende, die hauptsächlich Thymozyten und verdauen die verbleibende Gewebe nacheinander mit einer Runde collagenaSE-Typ IV (0,2 mg / ml und 57 U / ml Endkonzentration concentartion) für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Collagenase / Dispase (0,2 mg / ml und 1,2 U / ml Endkonzentration) für jeweils 25 min bei 37 & deg; C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren bis zum Thymi vollständig verdaut. Verwenden Sie 1 ml Enzym pro zwei vor drei Thymi.
4. Man schüttelt das Gewebe einmal alle 7-10 min mit einer Pasteurpipette. Bündeln die Kollagenase / Dispase Fraktionen und durch ein 70 & mgr; m Gaze.
5. Bereichern die mTEZ durch magnetische Zellsortierung (MACS). Führen die Reinigung von mTEZ durch magnetische Zellsortierung wie zuvor ¹¹ beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt.
   HINWEIS: Bei Magnetsortierung mTEZ verwendeten wir die folgenden Antikörper: anti-CD80-PE (16-10A1, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) und Anti-EpCAM-bio (G8.8, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) ^12. Unreifen und reifen mTEZ mit MACS wurden wie folgt definiert: CD45 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- und CD45 ^- CD80 ⁺ JEWEILIGENEly.
6. Nach Reinigung MACS (Reinheit von unreifen mTEZ = 83,1 ± 6,3% und reifen mTEZ = 79,23 ± 3,42%), die Samen mTEZ auf die organotypischen Kulturen, wie unten beschrieben (Abschnitt 2.3).
7. Alternativ Art mTEZ durch FACS (unter Verwendung von 100 & mgr; m Düse) nach CD45 MACS Erschöpfung mit den folgenden Antikörpern: anti-CD45-PerCP (30-F11, Einsatz bei 1: 100 Verdünnung), Anti-Ly51-FITC (6C3, verwenden Sie bei 1 : 100-Verdünnung), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, Verwendung einer 1: 500 Verdünnung) und Anti-CD80-PE (16-10A1, Verwendung bei 1: 100 Verdünnung). Ausschließen toten Zellen mit Propidiumiodid (1: 5.000) (Tag 4). Unreifen und reifen mTEZ mit FACS wurden wie folgt definiert: ^- CD45 ^- Ly51 ^- EpCAM ⁺ CD80 ^- und PI ^- CD45 ^- Ly51 ^- PI EpCAM ⁺ CD80 ⁺ sind.

2. 3D Organotypische Co-Kulturen (OTCs)

HINWEIS: Die 3D-Hautkonstrukte für organotypischen Kultivierung keratinocytes wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, ^9,13. Bei allen Schritten wurden die Zellen bei 37 ° C inkubiert und 5% CO _2. Die OTCs Verwendung mTEZ wurden mit leichten Modifikationen, wie folgt hergestellt.

1. Herstellung von menschlichen Fibroblasten
   HINWEIS: Die humanen Hautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen von de-epidermised Dermis wie zuvor ⁹ beschrieben, erhalten.
   1. Kurz gesagt, geschnittenen Streifen der menschlichen Haut (~ 5 cm Länge) und behandle mit Thermo (0,5 mg / ml in Kochsalzlösung mit 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bei 4 ° C.
   2. Danach trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette.
   3. Fein in einer 10 cm Petrischale schneiden die Lederhaut in kleine Stücke, Ort und lassen Sie sie für 1-2 Stunden unter einem sterilen Luftstrom trocknen. Ergänzen die Explantate regelmäßig mit DMEM, das 20% FBS.
   4. Teilen Sie die aus wachsenden Fibroblasten bei konfluenten (in der Regel etwa 3 Wochen) mit 0,1% Trypsin, sicherzustellen, dass die Explantate weiterhin auf die Platte für weitere con haftenaufeinander folgenden Runden der Auswuchs.
   5. Erweitern Sie die Fibroblasten aus dem gleichen Explantate für bis zu 3-mal in DMEM mit 10% FBS und Kryo-bewahren ^14. Verwenden Sie die gleiche Charge von Fibroblasten für jede Versuchsreihe.
      HINWEIS: Die Fibroblasten wurden nicht für den Aufbau der Hautäquivalente bestrahlt.
2. Vorbereitung des Scaffold
   1. Schneiden Sie die 0,4-0,6 mm dicken Viskose, Vliesfasermaterial (Produktdetails bei der Unterstützung der Excel-Tabelle) in gut abgegrenzten Kreise mit einem scharfen 11 mm Durchmesser Metall Puncher genau in 12-Well-Filtereinsätze passen. Dann legen Sie sie in den 12-Well-Filtereinsatz (Polyester kapillare Porenmembran, 3 & mgr; m Porengröße) als Gerüst. Setzen Sie den kompletten Filter-Setup in eine sterile 12-Well-Platte.
   2. Vorbereiten des Fibringels Verwendung eines Fibrinkleber-Kit für die Chirurgie bestehend aus einer Kombination von Fibrinogen und Thrombin. Pre-Verdünnung des Fibrinogen- sowie die Thrombin-Komponente des Kits bis 8 mg / ml und 10Einheiten / ml. Für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte wie folgt vorgehen.
      1. 100 ul verdünnte Fibrinogen (8 mg / ml) mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca ^₂₊ und Mg ^_2+, pH 7,0. Verdünnter 100 ul Thrombin (10 Einheiten / ml) mit 100 ul FCS enthaltenden 270.000 Fibroblasten.
      2. Verzichtet werden 200 ul Thrombin Fibroblasten enthaltende zell mischen auf das Stützgerüst, wozu 200 & mgr; l Fibrinogen hinzuzufügen (1: 1-Mischung), was zu einer Endkonzentration von Fibrinogen von 2 mg / ml und Thrombin von 2,5 Einheiten / ml. Gut mischen und gleichmäßig zu verteilen über die gesamte Fläche des Gerüsts durch vorsichtiges Pipettieren (Tag 1).
         HINWEIS: Nach 30 Minuten bei 37 ° C ein Gerinnsel umschließt den Fibroblasten gebildet haben, Füllen vollständig die Innenräume des Gerüsts und eine glatte obere Oberfläche.
3. Co-Kultur mit mTEZ
   1. Für Vorkultur, Tauchen Sie das Organkulturen inDMEM mit 10% FBS, 50 & mgr; g / ml L-Ascorbinsäure und 1 ng / ml TGF-β1 mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage für 4-5 Tage.
   2. Am Tag der Aussaat mTEC Ersetzen des Mediums durch RFAD Medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) mit 10% FBS, 10 ^-10 M Choleratoxin, 0,4 mg / ml Hydrocortison, 50 & mgr; g / ml L-Ascorbinsäure, RANK-Ligand (0,1 ug / ml) und 500 Einheiten / ml Aprotinin, wodurch frühreifen Fibrinolyse von Serinproteasen durch Fibroblasten sezerniert.
   3. 7-8 Stunden später, die Co-Kulturen Set-up durch Impfen 250.000 mTEZ (entweder komplett mTEZ oder CD80 ^lo und CD80 ^hallo Untergruppen) in einem Volumen von 100 ul pro Vertiefung auf der Oberseite des Fibroblasten-Gerüst. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Neubauer Kammer (Tag 4).
      HINWEIS: Zu allen Zeiten der Thymus 3D organotypischen Kulturen werden in den Medien im Gegensatz zu Haut OTCs, die Klima aufgehoben sind untergetaucht.
   4. Nach 24 Stunden Inkubation, liefern die Kulturen mit Medium (insgesamt Trägeraustausch) wie oben (Schritt 2.3.2) genannte jetzt haltendeng reduzierten Mengen Aprotinin, 250 Einheiten / ml (Tag 5).
   5. Um die proliferative Aktivität von mTEZ beurteilen, fügen EdU (6,7 & mgr; M / ml, das heißt 10 & mgr; / Vertiefung) zu OTCs für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Führen Sie die Färbung von OTC Kryo-Abschnitte, wie in der EdU Imaging Kit in Kombination mit Co-Färbung von Keratin 14 in zwei Abschnitte einer jeden Kultur Probe oder durch Strömungs beschrieben Bestimmen Sie die proliferative Indizes mTEZ, entweder durch Zählen der K14 ⁺ EdU ⁺ Zellen Durchflusszytometrie (EDU Durchflusszytometrie, Abschnitt 1.7, aber statt Ly51-FITC verwendet CDR1-PB ¹⁵ bei einer 1: 100 Verdünnung und 2.3.6.4).
   6. Nach 4-7 Tagen der Co-Kultur, kündigen die OTCs und Verfahren zur RNA-Isolierung, Kryo-Schnitte oder FACS-Analyse (Tag 8-11).
      1. Beenden der Kulturen mit einer Pinzette, Abtrennen der Gerüst / dermales Äquivalent vom Filter des Bohrlochs Einfügen.
      2. Für Kryo-Schnitte, betten die gesamte OTC in OCT-Verbindung und frieren in liquid Stickstoffdampf vor dem Kryo-Schnitte. Bereiten Sie 5-7 um dicke OTC Abschnitte mit einem Kryostaten und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für Immuno-Histochemie von Kryo-geschnitten OTCs ein anti Keratin 14 (AF64, Verwendung einer 1: 1000 Verdünnung) und anti-Vimentin (GP53, die Verwendung einer 1: 100 Verdünnung) Antikörper. Führen Sie die indirekte Immunhistochemie Färbung mit entsprechenden Sekundärantikörper.
      3. Für die RNA-Isolierung, 1 ml Denaturierungslösung (enthält Phenol und Guanidiniumthiocyanat) in einer Schraubkappe eines 2 ml RNase frei Rohr. Schneiden Sie die gesamte OTC in Stücke mit einem Skalpell und fügen Sie in das Röhrchen mit Denaturierungslösung. Mechanisch zerkleinern das OTCs mit FastPrep Instrument zweimal für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0, legen Sie in zwischen auf Eis für 2 min (die Probe bei -80 ° C nach diesem Punkt gespeichert werden). Wenn bei -80 ° C eingefroren, aufgetaut auf Eis. Zentrifugieren der Rohre an 11,500-13,000 Upm 10 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, Inkubation für 5 min bei RT und follow RNA Isolation Protokolle unter Verwendung von sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben.
      4. Für die FACS-Analyse, entfernen Sie das Gerüst und trennen Sie die Membran aus dem Fibrin / Fibroblasten / mTEC Gel. Feinschnitt das Gel mit einem Skalpell und verdauen in einem FACS-Röhrchen für ~ 20 min oder bis vollständig mit 2 ml Collagenase / Dispase bei 37 ° C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren verdaut. Rühren der Enzymlösung mit einer Pasteurpipette einmal alle 5 min. Nach der vollständigen Verdauung, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m-Filter; Flecken auf der Einzelzellsuspension mit den Antikörpern, wie in 1.7 beschrieben, und mittels Durchflusszytometrie analysiert.

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Ergebnisse

Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten ⁹ entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen ...

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Diskussion

Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) "vereinfachte 3D-Kulturen" mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs ^10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 mice	Charles River WIGA
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
CD45 Microbeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-052-301
Anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)	Ref. 12
CD80-PE antibody	BD Pharmingen	553769
CD45-PerCP antibody	BD Pharmingen	557235
Ly51-FITC antibody	BD Pharmingen	553160
CDR1-Pacific Blue	Ref. 15
Keratin 14 antibody	Covance	PRB-155P
Vimentin antibody	Progen	GP58
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-003
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	106-546-003
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes (Invitrogen GmbH)	A-11008
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Invitrogen	C10339
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit	Invitrogen	C10425
12-well filter inserts (thincerts)	Greiner bio-one	657631
12-well plate	Greiner	665180-01
Jettex 2005/45	ORSA, Giorla Minore, Italy
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno	Baxter
PBS	Serva	47302.03
DMEM	Lonza	BE12-604F
DMEM/F12	Lonza	BE12-719F
HEPES	Gibco	15630-049
FBS Gold	GE Healthcare	A11-151
Aprotinin (Trasylol)	Bayer	4032037
Cholera toxin	Biomol	G117
Hydrocortisone	Seromed (Biochrom)	K3520
L-ascorbic acid	Sigma	A4034
TGF-ß1	Invitrogen	PHG9214
RANKL	R&D systems	462-TR-010
Thermolysin	Sigma Aldrich	T-7902
OCT Compound	TissueTek	4583
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)	Invitrogen	10296028
FastPrep FP120	Thermo Scientific
Collagenase Type IV	CellSystems	LS004189	0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.
Neutrale Protease (Dispase)	CellSystems	LS002104	0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.
DNase I	Roche	11 284 932 001	25 µg/ml final conc.