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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur extrazellulären Vesikeln (EVs), kleine membranöse Teilchen aus Zellen freigesetzt zu isolieren, von so wenig wie 10 ul Serumproben. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit von Ultrazentrifugation, nur wenige Minuten von Testzeit erfordert und ermöglicht die Isolation von Elektrofahrzeugen aus Proben von begrenzten Mengen.

Zusammenfassung

Extrazellulären Vesikeln (EVs), membranartige Partikel aus verschiedenen Arten von Zellen freigesetzt, halten ein großes Potenzial für die klinische Anwendung. Sie enthalten von Nukleinsäuren und Proteinen Ladung und werden zunehmend als Mittel zur interzellulären Kommunikation sowohl eukaryote und prokaryote Zellen verwendet erfasst. Aufgrund ihrer geringen Größe, aktuelle Protokolle zur Isolierung von Elektrofahrzeugen sind oft zeitaufwendig, umständlich und erfordert große Probenvolumina und teure Ausrüstung, wie zum Beispiel einer Ultrazentrifuge. Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir eine papierbasierte Immunaffinitäts Plattform zur Trennung von Untergruppen von Elektrofahrzeugen, die einfach, effizient ist und erfordert Probenvolumen von nur 10 & mgr; l. Biologische Proben können direkt auf Papier Testzonen, die chemisch mit Fängermolekülen, die eine hohe Affinität zu bestimmten EV Oberflächenmarker haben die modifiziert wurden, pipettiert werden. Wir bestätigen die Assays unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), auf Papierbasis enzymgebundenen immunosorbent-Tests (P-ELISA) und Transkriptom-Analyse. Diese Papier-basierte Geräte ermöglichen das Studium von Elektrofahrzeugen in der Klinik und der Forschung Einstellung zu helfen unser Verständnis von EV-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

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Protokoll

Ein allgemeines Diagramm des Betriebs ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Mit ethischen Praktiken, sammelten wir Blutproben von gesunden Probanden und erhalten Kammerwasser-Proben von Patienten durch die Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan unter IRB zugelassen Protokolle ( IRB TCVGH Nr CF11213-1).

1. Herstellung von Papier Material

  1. Geschnitten Chromatographiepapier in Kreise von 5 mm im Durchmesser, um das gleiche Layout wie einer 96-Well-Mikrotiterplatte ist. Sandwich diese Papierstücke mit zwei Polystyrolplatten mit einem Stammdurchgangslöchern, und Laminat.
  2. Ändern Papier Geräte mit dem in den folgenden Schritten 28 beschrieben chemische Konjugation Verfahren.
    1. Saures Papier Geräte mit Sauerstoffplasma (100 mW, 1% Sauerstoff, 30 sec) in einer Plasmakammer.
      ACHTUNG: Besondere Vorsicht ist bei der Arbeit mit 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und N -γ-Maleimidobutyryloxy Succinimid genommen werden(GMBS), da sie sowohl feuchtigkeitsempfindlich und toxisch sind. Schutzhandschuhe und ein Einatmen zu vermeiden oder mit Haut und Augen zu kontaktieren. Halten Sie die Vorratsflasche fest verschlossen und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur vor dem Öffnen um eine Kondenswasserbildung zu vermeiden Gleichgewicht. Alternativ öffnen Sie die Vorratsflasche in einem mit Stickstoff gefüllten Handschuhbeutel oder Kasten. Aliquot in kleine Fläschchen häufiges Öffnen der Vorratsflasche zu vermeiden.
    2. Unmittelbar inkubieren behandelte Papier Vorrichtungen in einer 4% igen (v / v) Lösung von 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan in Ethanol (200 proof) für 30 min.
    3. Papier Geräte Spülen mit Ethanol und Inkubation sie mit 0,01 mmol / ml GMBS in Ethanol für 15 min.
    4. Spülen mit Ethanol (200 proof) und inkubieren Papier Vorrichtungen mit 10 ug / ml Avidin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) für 1 h bei 4 ° C. Lagerung bei 4 ° C, wenn nötig, und innerhalb von 4 Wochen.
  3. Befeuchten jeder Papiertestzonen mit 10 ul PBS, enthaltend 1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) Für 3 x 10 min vor Spek 10 ul biotinylierten Fängermoleküle für 3 x 10 min. Verwenden anti CD63-Antikörper (20 ug / ml in PBS, das 1% (w / v) BSA und 0,09% (w / v) Natriumazid) oder Annexin V (1:20, v / v in Annexin V-Bindungspuffer), wie Fängermoleküle.
  4. Abspülen ungebundenen anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle unter Verwendung von 10 & mgr; l entspricht, PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min auf.

2. Serum und Kammerwasser Probenerhebung und Datenverarbeitung

  1. Serumgewinnung.
    1. Sammeln Sie 10 ml peripheren Blut durch Venenpunktion in Serumtrennröhrchen und sanft das Röhrchen fünfmal. Stellen Sie die Röhre in einer vertikalen Position und für weitere 30 min.
    2. Zentrifuge bei 1200 × g für 15 min. Das Serum von der oberen Schicht in ein sauberes Röhrchen, und erneut zentrifugieren bei 3.000 × g für 30 min.
    3. Übergeben Sie den Überstand durch ein 0,8 um filter. Halten Sie die Probe bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Kammerwasser Kollektion: sammeln Kammerwasser-Proben von Patienten durch einen Augenarzt direkt durch invasive Verfahren und Lagerung von Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung diagnostiziert.

3. Isolierung der extrazellulären Vesikeln

  1. Stichproben auf jeder Papiertestzone mit einer Geschwindigkeit von 5 ul / min.
  2. Abspülen ungebundenen EVs mit 10 ul entsprechenden PBS, das 1% (w / v) BSA oder Annexin V-Bindungspuffer Lösungen für 3 × 1 min für die Papiervorrichtungen funktionalisiert mit Anti-CD63-Antikörper oder Annexin V-Moleküle sind. Führen Sie die folgenden Downstream-Assays.

4. Downstream Testbeispiel 1: Scanning Electromicrographs

  1. Fix EVs auf funktionalisierten Papiertestzone mit 10 ul 0,5 x Karnovsky Fixativ für 10 Minuten eingefangen.
  2. Spülen Sie die Proben mit ausreichend PBS für 2 x 5 min.
  3. Entwässern derProben mit anschließender 35% Ethanol für 10 min, 50% Ethanol für 2 × 10 min, 70% Ethanol für 2 x 10 min, 95% Ethanol für 2 × 10 min und 100% Ethanol für 4 x 10 min.
  4. Critical trocken und Sputter-Beschichtung der Proben mit Palladium / Gold und untersuchen mit einem Rasterelektronenmikroskop bei geringer Elektronenbeschleunigungsspannung betrieben (~ 5 kV).

5. Downstream Testbeispiel 2: Papier-basierten ELISA

  1. Fügen Sie ein 5 ul-Lösung, die Anti-CD9 primären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS zu jeder Testzone, die gefangen genommen EVs. Warten Sie 1 Minute.
  2. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
  3. Hinzufügen einer 5 & mgr; l Lösung, die Meerrettich-Peroxidase (HRP) -verknüpften-sekundären Antikörper bei 1: 1000 Verdünnung in PBS und 1 min warten.
  4. Mit 30 Spülen Sie die Proben ml PBS bei 100 Umdrehungen pro Minute für 30 Sekunden geschüttelt.
  5. Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats 5 ul, das 1: 1-Volumenverhältnis von Wasserstoffperoxid eind 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) und scannen Sie mit einem Desktop-Scanner.

6. Nachgeschaltete Testbeispiel 3: RNA-Isolierung

  1. Tauchen Sie die Proben in 35 ul von Polyvinylpyrrolidon-basierte RNA-Isolierung Hilfe und 265 ul Lyse / Bindungspuffer auf EVs erfasst lysieren. Vortex kräftig.
  2. In 30 ul Homogenat bei der Isolation Kit zum Lysat zur Verfügung gestellt. Vortex kräftig und auf Eis für 10 Minuten gestellt.
  3. Extrahieren der RNA unter Verwendung von Säure in den folgenden Schritten beschrieben, mit Phenol-Chloroform-Trennung.
    1. Nehmen 330 ul Phenol-Chloroform von der Bodenschicht der Flasche und in den Homogenats / Lysat. Vortex kräftig.
    2. Zentrifugieren bei 10000 × g für 5 min. Übertragen Sie die wässrige (obere) Phase in ein sauberes Röhrchen und das Volumen entfernt.
  4. Fällt die Gesamt-RNA mit 100% Ethanol das Volumen, das 1,25-fache des Volumens der wäßrigen Phase in der vorhergehenden Stufe und co entfernt istllect die RNA in der Elutionslösung auf 95 ° C vorgewärmt.
  5. Eine Konzentration und weiteren Reinigung der RNA unter Verwendung eines RNA-Cleanup Kit nach dem Protokoll des Herstellers.

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Ergebnisse

Die Fähigkeit des Papiers Gerät Gruppen von EVs isolieren stützt effizient auf seine empfindliche und spezifische Erkennung von EV-Oberflächenmarker. Die stabile Modifikation von Papierfasern mit Fängermolekülen wird durch die Verwendung von Avidin-Biotin-Chemie als anderswo 28-30 beschrieben ist. Die Wirksamkeit der chemischen Konjugation, und dass der Physisorption Verfahren unter Anwendung der fluoreszenzbasierten Auslesungen beurteilt. Die Papier Prüfzonen folgenden Protokoll Schritt 1) ​​mit A...

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Diskussion

Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Isolierung von Untergruppen von extrazellulären Vesikeln sind: 1) eine gute Wahl des Papiers; 2) stabile und hohe Abdeckung der Fängermoleküle auf der Oberfläche der Papierfasern; 3) die richtige Handhabung der Proben; und 4) allgemeine Laborhygienemaßnahmen.

Poröse Materialien haben sich in vielen preiswerten und Ausrüstung freien Tests genutzt. Sie haben abstimmbare Porengrße, vielseitige Funktionalität, niedrige Kosten und hohe Oberfläc...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Science Council Taiwan-Beihilfen NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) und NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), und der Veterans General unterstützt Krankenhäuser und Universitätssystem von Taiwan Joint Research Programme (CC).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

Referenzen

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