Bewertung der Wirksamkeit der<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP als therapeutisches Werkzeug zur Behandlung von Blasenkrebs in einem orthotopen Mausmodell

Zusammenfassung

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Zusammenfassung

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Einleitung

Blasenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen des Urogenitaltrakts, mit fast 75.000 neue Fälle jedes Jahr in den USA ^1. Hohe Rezidiv erfordern lebenslanges Follow-up, die Blasenkrebs eine der teuersten Krebsarten behandelbar machen. Der Goldstandard für die Behandlung hochgradigen NMIBC ist transurethralen Resektion, gefolgt von intravesikale Immuntherapie mit BCG. Obwohl der genaue Mechanismus der Antitumoraktivität von BCG, muss noch vollständig aufgeklärt werden, wird akzeptiert, dass die Aktivierung der zellvermittelten Immunantwort der T-Helfer (Th) 1 und zytotoxische T (Tc) 1-Zellen angereichert ist für Der Erfolg der Therapie ^2.

Trotz der Tatsache, dass BCG bleibt die Behandlung der Wahl für NMIBC ein hoher Anteil der Patienten nicht auf die Therapie zu antworten; Darüber hinaus kann sie eine Reihe von Nebenwirkungen haben: ca. 70% der behandelten Tumore nach einer gewissen Zeit wieder auftreten und ~ 15% Fortschritt auf die muskelinvasiven Form desKrankheit. Andere Nebenwirkungen, die mit BCG-Behandlung verbunden sind Dysurie, Zystitis und Nierenentzündung ^3-6.

Die Entwicklung neuer Therapiestrategien zu beachten die Verwendung von präklinischen Modellen zu nehmen, nach der ersten in-vitro-Bewertung; Dies ist besonders wichtig bei Tumoren, deren Mikromilieu deutlich ihre Entwicklung und Ansprechbarkeit auf die Behandlung beeinflussen.

Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben verschiedene Aspekte der Immunmodulationsaktivität von HP-NAP, einer durch das Bakterium Helicobacter pylori hergestellte Protein gerichtet, zunächst als fördern kann endothelialen Adhäsion von polymorphkernigen Zellen (PMNs) ⁷ identifiziert. Strukturell gehört HP-NAP an die DNA-Schutz-Protein unter Bedingungen ausgehungert (DPS) Familie ⁸ und besteht aus 12 in einer dodecameren Schale angeordneten identischen Untereinheiten.

Wir haben gezeigt, dass HP-NAP isteinen Toll-like Rezeptor (TLR) 2-Agonisten mit einer starken immunmodulierende Aktivität zum Antreiben der Differenzierung von T-Lymphozyten verantwortlich Richtung des Th1-Phänotyp in vitro und in vivo ^9-10. Im Rahmen dieser Tätigkeit ist HP-NAP in der Lage, die Th2-Immunantwort in die vorteil Th1-Antwort in einem Mausmodell von allergischem Asthma ¹¹ umzuleiten.

Um die Th1-abhängige Anti-Tumor-Potenzial von HP-NAP bewerten, nutzten wir einem Mausmodell von Blasenkrebs durch O'Donnel und Kollegen ¹² zur Bewertung der Auswirkungen der BCG Verwaltung vor einigen Jahren entwickelt.

Bei diesem Protokoll, zeigen wir, dass HP-NAP hat eine starke Antitumor-Potential gegen Blasenkrebs und dass die Wirksamkeit von HP-NAP Verabreichung Parallelen der signifikante Akkumulation im Tumor und regionale Lymphknoten, sowohl Th1- und Tc1 Lymphozyten produzieren Interferon ( IFN) -γ ¹³ . Tumore von HP-NAP behandelten Mäusen isoliert zeigte mehr Nekrose und weniger Vaskularisation als die unbehandelte Gegenstück.

Der vorliegende Bericht liefert eine stepbystep Protokoll Detaillierung der Vorbereitung der Tiere, deren Harnröhrenkatheter, der chemischen Verbrennung für die Befestigung der Zellen an die Blasenschleimhaut erforderlich ist und die Injektion der Tumorzellen. Wir beschreiben auch die topische Verabreichung von HP-NAP, die als Prototyp einer für die Behandlung von Blasenkrebs entwickelt therapeutische Wirkstoffe betrachtet werden kann. Die durch den Vergleich Tumoren von Steuerung und HP-NAP behandelten Tieren isoliert erlangten Beweismittel betont nicht nur die Tatsache, dass HP-NAP könnte ein guter Kandidat für Blasenkrebs Immuntherapie, sondern auch die allgemeine Wirksamkeit der Versuchsanordnung ist.

Protokoll

Alle Verfahren für die Behandlung der Tiere wurden von der italienischen Gesundheitsministerium (DM 204/2011-B) genehmigt worden.

1. Tiere

1. Wachsen C57BL6 / J weiblichen Mäusen zu 8 Wochen in einzeln belüfteten Käfigen mit microisolation Filter.
   Hinweis: Frauen werden bevorzugt, da die anatomische Anpassung ihrer äußeren urogenitalen Gerät macht die Katheterisierung einfacher als bei Männern.

2. Zellkultur

1. Aufrechterhaltung der Maus Urothelkarzinom Zelllinie MB49 in RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 50 ug / ml Gentamicin ergänzt bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO _2.
2. Wachsen MB49-Zellen in T-75-Flaschen zu 80% Konfluenz. Trypsinieren und resuspendieren in 0,5 x 10 ^{5 bis} 0,5 × 10 ⁶ Zellen pro 150 & mgr; l PBS vor der Implantation in Mäuse.

3. Intravesikale Tumor Implant

1. Betäuben Mäuse mit einer Mischung aus dem Narkose zoletil und xylor (33 mg / kg und 20 mg / kg) intraperitoneal injiziert.
2. Zeigen Tiere in Rückenlage und fixieren die Hinterbeine in die Unterlage mit Tesafilm. Pfoten haben ausreichend getrennt, um die Harnröhrenmündung gut sichtbar und für die Einführung des Katheters zugänglich machen werden.
3. Hinweis: Für die Katheterisierung, ist ein 24 G pädiatrischen Venenkatheter geeignet für 8 bis 10 Wochen alten Mäusen. Die Wahl des Katheters ist, um eine Leckage zwischen der Harnröhrenwand und dem Katheter Flüssigkeit zu vermeiden sehr wichtig. Größere Bohrung Katheter muss für größere oder älteren Mäusen verwendet werden.
4. Mit einem kleinen Zange, kneifen eine Kante des äußeren Teil der Harnröhre und drehen Sie sie ganz sanft in Richtung der "Kopfende" der Mäuse. Diese Aktion macht die Harnröhrenmündung.
5. Entfernen Sie den inneren Nadel des Katheters und legen Sie diese in die Harnröhre in einem Winkel von 45 °, leicht orientiertin Richtung der "Schwanzende" der Mäuse. Nicht mit Gewalt den Eingang des Katheters; im Falle von Widerstand, nur drehen Sie den Katheter sehr vorsichtig, bis es schlüpft in der Harnröhre. Wenn etwa 0,5-0,8 cm des Katheters in die Harnröhre, vorsichtig die Katheter parallel zum Schwanz der Mäuse und setzen Sie sie vollständig.
6. Verwendung einer 1 ml Spritze, deren Nadel in den Katheter eingeführt werden muß, zu waschen, die Blase von Restharn durch Injizieren 200-300 ul sterilem PBS, und saugen die gesamte Flüssigkeit aus der Blase.
7. Hinweis: Bei der Injektion von PBS, wird die Blase zu füllen und eine Schwellung zwischen den Hinterbeinen der Mäuse sichtbar sein; Dies bestätigt, dass die Katheter korrekt ist. Die meisten Katheter haben ein Totvolumen, die berücksichtigt werden müssen bei der Berechnung der Einspritzmenge.
8. Verwendung einer sterilen 1-ml-Spritze, Injizieren 200 ul 0,1 N HCl. Füllen Sie die Blase, um seine ganze Wand zu verbrennen. Nach 10 sec, entfernen Sie alle Säure und sofort Neutralisaze durch Injizieren von 200 ul 0,1 N NaOH mit einer sterilen Spritze. Im Falle der Injektion von der höchsten Zahl der Zellen (0,5 × 10 ^6), wird die Ansäuerung Schritt nicht erforderlich.
9. Saugen Sie all die Restflüssigkeit und spülen den Hohlraum mit 300 ul sterilem PBS.
10. Leeren Sie die Blase durch Aspiration, und injizieren 150 ul PBS, das MB49-Zellen (Bereich von 0,5 x 10 ⁵ bis 0,5 x 10 ⁶⁾ in die Blase. Lassen Sie die Spritze mit dem Katheter zusammengebaut, um das Austreten von Zellen zu vermeiden. Es ist besser, die Spritze durch Befestigung an der Unterlage mit Klebeband sichern.
11. Nach 1 Stunde sanft zu extrahieren den Katheter aus der Harnröhre, und platzieren Sie die Maus in den Käfig, unter einer Glühlampe bis sie wach: dies geschieht in der Regel zwischen 1 und 2 Stunden nach dem Ende der Behandlung.

4. Intravesikale Lieferung von HP-NAP

1. Anmerkung: mindestens 3 Tage nach der Zell Instillation, ist es möglich, den BeginnBehandlung.
2. Catheterize wie in den Schritten 3.1 bis 3.4 beschrieben. Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht notwendig, den Blasenwand mit HCl verbrennen.
3. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze, waschen Sie die Blase von Restharn durch Einspritzen von 200-300 ul sterilem PBS und saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus der Blase.
4. Injizieren 50 ug HP-NAP pro 150 ul PBS in die Blase. Lassen Sie die Spritze an den Katheter angebracht ist, um eine Leckage von der Proteinlösung zu vermeiden. Befestigen Sie die Spritze durch Befestigung an der Unterlage mit Tesafilm.
5. Nach 1 Stunde sanft zu extrahieren den Katheter aus der Harnröhre und platzieren Sie die Maus in den Käfig, unter einer Glühlampe, bis sie wach.

5. Tumor Explantate und histologische Analyse

1. Am Ende der Behandlung, die Tiere zu opfern, legen Sie sie in Rückenlage und fixieren die Hinterbeine in die Unterlage mit Tesafilm.
2. Mit Hilfe eines chirurgischen Skalpell einen vertikalen Schnitt etwa 1,52 cm lang durch die Haut und diePeritoneum, beginnend knapp über äußeren Genitalien auf die "Kopfende" der Mäuse. Um das Risiko einer Beschädigung der Blase zu minimieren, achten Sie besonders auf die Tiefe des Schnittes.
3. Die Blase wird in der Mitte-Links des Schnitts positioniert werden und der Tumor sichtbar als dunkle rosa / violett Masse sein. Nach seiner Exzision, legen Sie die gesamte Blase in einem histologischen Käfig und befestigen Sie in 10% gepuffertem Formalin vor dem Einbetten in Paraffin.
4. Zur histologischen und immunhistochemischen Analyse vorzubereiten Serienschnitte der Blase (46 & mgr; m Dicke) mit einem Standard-Mikrotoms.
5. Färben die Schnitte mit Hämatoxylin / Eosin und fahren Sie mit der Berechnung der Tumorgröße (D xd ²⁾ und Bestimmung des Prozentsatzes Nekrose pro Querschnittsfläche mit Hilfe eines computergestützten Bildanalysegerät.
6. Für Behälter Zählen, gehen durch Färben der Abschnitte für die endotheliale Marker CD31 / PECAM, mit einem Standard-Immunperoxidase-Technik. Scannen Sie die Abschnitte at niedriger Leistung (4 x), um den Bereich der höchsten Gefäßdichte zu identifizieren. Innerhalb dieser Region zählen einzelnen Mikrogefäße in fünf separate Zufallsfelder mit hoher Leistung (20 x).

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Kathetertechnik; die Maus katheterisiert und mit 0,5 x 10 ⁶ MB49-Zellen eingeimpft. 3 Tage nach der Injektion von Tumorzellen wird eine Behandlung mit HP-NAP gestartet, um ihnen zu ermöglichen, an der Blasenwand zu befestigen und zu vermehren. Alle Tiere in der Kontrollgruppe gehörenden Entwicklung des Tumors; einige von ihnen vor dem Ende des 13-Tage-Zeitraum auf Grund der Verstopfung der Harnröhre sterben.

Nach der ersten Injektion mit H...

Diskussion

Der Großteil der Fortschritte in der Krebstherapie erfordern Tests in Tiermodellen, bevor klinische Studien. Die Möglichkeit, das Studium der Tumorbiologie in vivo, unter Ausnutzung der Tier-Modelle, ist ein entscheidender Werkzeug für Forscher untersuchen Krebs Pathogenese, so dass die Bewertung der unterschiedlichen Therapieansätze. Orthotopen Modellen bleibt der Goldstandard ^14-15, sowohl wegen der riesigen Menge an Zelllinien, die Einrichtung eines Tumor-Modell, und weil sie die Umgebung des ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System