Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Zusammenfassung

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Zusammenfassung

Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.

Einleitung

Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen ^1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions ^5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung.

Gewebe können auf zwei verschiedenen Wegen für lichtmikroskopische Untersuchung vorbereitet werden. Das erste Verfahren, Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten erfordert Gewebe in 10% gepuffertem Formaldehyd natürlichen bevor sie mit Paraffin eingebettet ^11,12 fixiert werden. Der Fixierungsschritt hilft, Morphologie besser zu bewahren, sondern auch Querverbindungen endogenen proteins macht es erforderlich komplizierte Antigen-Retrieval-Verfahren für die Immunfärbung und die Beseitigung der Möglichkeit der enzymatischen Flecken auf solche Abschnitte ^12. Gefrierschnitte andererseits brauchen nicht vor, eine feste oder verarbeitet werden sollen; daher sind Proteine ​​in der Lage, native biologische Konformationen ^13,14 beibehalten. Ferner gefrorene Schnitte auch schnelle Durchlaufzeit, die manchmal notwendig ist, beispielsweise in der intraoperativen Diagnose von Sarkomen und anderen chirurgischen Biopsien ¹⁵ ermöglichen. , Wenn nicht richtig gemacht, Diese Methode ist jedoch anfällig für Schäden, die Änderungen an Muskel-Architektur macht die Abschnitte ungeeignet für die histologische Untersuchung stellt einfrieren. Dieses Papier wird die effektivste Methode, um Muskelbiopsien, um eine optimale Färbung für die ordnungsgemäße Prüfung zu erreichen vorbereiten zu skizzieren.

Protokoll

1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe

1. Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt.
2. Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch.
3. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften von losen Haarsträhnen auf die Muskeln zu reduzieren. Schälen Sie die Haut von dem Schenkel mit einer feinen Pinzette, wie # 5.
4. Trennen Sie vorsichtig die Muskeln von Interesse (tibialis anterior (TA) in diesem Fall) von den Knochen unter, ausgehend von der Sehne und zu entfernen.
5. Auszuschneiden den Muskel, bedecken Sie es in OCT (optimale Schnitt Temperatur-Verbindung), und legen Sie ihn flach auf einem markierten Einweggefrierform. Stellen Sie sicher, dass der Muskel an seinem normalen physiologischen Orientierung (Kopf bis tail) ohne Dehnung. Alternativ einfrieren den Muskel auf kleinen Styropor-Plätze und stecken Sie es mit Insektenstifte auf die richtige Länge der Muskeln zu gewährleisten.
6. Chill-2-Methylbutan (Isopentan) in einem Stahlbecher mit Hilfe von flüssigem Stickstoff. Dies dauert im Durchschnitt 3-5 min. Halten Sie das Rühren mit Unterbrechungen bis weiße Niederschläge beginnen, sich auf den Boden und die Wände des Bechers zu bilden.
   HINWEIS: Wenn dies geschieht, Isopentan optimale Gefriertemperatur erreicht hat (150 ° C)
7. Tauchen Die Formen, die Muskeln in der gekühlten 2-Methylbutan. Einfrieren kleinen Muskeln, wie der Membran und extensor digitorum longus (EDL) für 6-12 sec und größere Muskeln wie gastrocnemius soleus (GS) und Trizeps für 15-20 sec. Die Muskeln Nicht einfrieren zu lange, da dies zu Rissen führen.
8. Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe auf Trockeneis und lassen Sie die Isopentan verdampft (beachten Sie, dass dieser Prozess dauert im Durchschnitt etwa 15 bis 20 min). Wickeln Sie das Gewebe in Aluminiumfolie und im Kühlschrank bei ultra niedriger Temperatur (-70 ° C bis -80 ° C) bis zum Schneiden.

2. Einbindung der Gewebe in OCT zu Tissue-Block vorbereiten

1. Transport Gewebe auf Trockeneis zu cyrostat zu Auftauen zu verhindern. Transfer Gewebe Kryostatkammer (bei -20 bis -24 ° C eingestellt, um volle Auftauen der Gewebe zu vermeiden) und lassen Sie sie für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen.
2. Drehen Sie das Peltier-Kühlschacht auf. Wenn der Kryostat nicht diese Kühlung haben, verwenden Aerosolkühlspray, schnell einfrieren Oktober Lassen Sie sich nicht den Muskel Tauwetter zu irgendeinem Zeitpunkt während der Einbettung, da dies zu Frostschäden führen.
3. Fügen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht von Oktober auf der Probenscheibe und abkühlen lassen. Wenn die meisten der Oktober ist auf dem Boden, während immer noch Flüssigkeit auf der Oberseite eingefroren, legen Sie die Gewebe an der richtigen Ausrichtung (senkrecht zur OCT zur Querabschnitte und parallel Oktober für Längsschnitte). Benutzen Sie Aerosol-Kühlspray, schnell einfrieren Oktober Tippen Sie auf die unembeded Teil des Gewebes mit Wärme extRactor und warten Sie 45 Sekunden.
4. Fügen Sie eine weitere dünne Schicht Oktober rund um die Muskeln, Aerosolspray mit Kühlspray und extrahieren Sie die Hitze wie im vorherigen Schritt.
5. Halten Sie das Hinzufügen Oktober in kleinen Schritten und schnell einfrieren des OAT mit einer Kombination von Aerosol-Kühlspray und Wärmeableitblock bis der ganze Muskel wird abgedeckt.
6. Legen Sie die Wärmeableitblock auf der Oberseite der Gewebeblock, und warten Sie 5 Minuten.

3. Vorbereitung Profile und Identifizieren der Teile von Mid-Bauch Region der Muskeln

1. Montieren Sie die Probe auf die Probe Kopf. Ziehen Sie den Knopf, um die Disc zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist in einem guten Kontakt mit dem Objektkopf.
2. Passen Sie die Raumtemperatur zwischen -21 und -24 ° C, und warten Sie, bis die eingestellte Temperatur erreicht ist.
3. Passen Sie die Einstellungen Dicke (7 & mgr; m); schneiden Sie den Block durch Vorschieben oder Zurückziehen des Blocks mit Grob- und Feineinstellungen.
4. Sammeln Sie die AbschnitteAuf vorgewärmten positiv geladenen Objektträgern durch Drücken der Oberseite des Schiebers auf die Abschnitte mit der Anziehung zwischen entgegengesetzten Ladungen, um die Haftung der ausgeschnittenen Abschnitte zu der Folie zu erleichtern.
5. Identifizieren Sie die Mitte der Bauchabschnitte durch Messung Querschnittsfläche (CSA) der Abschnitte. Tun Sie dies mit Imaging-Software auf dem Computer, an das Mikroskop angeschlossen ist.
   HINWEIS: Phasenkontrastbilder aufgenommen und Umfang des gesamten Muskel wird über eine Rückverfolgung-Funktion auf dem Software-Programm gemessen. Dies wird sowohl CSA sowie minimale Frettchen Messer (Maß für die Faserquerschnittsgröße, die als der kleinste Abstand zwischen zwei parallelen Tangenten an gegenüberliegenden Seiten eines Teilchens ausgedrückt wird) Messungen zu erhalten. Hinweis: Bei der CSA und Frettchen Mindestdurchmessermessungen beginnen, Plateau, hat Mitte Bauch erreicht ist.
6. Inventur und Archivierung der Objektträger bei -80 ° C für die künftige Färbung.
   HINWEIS: Oktober muss nicht vor der entfernt werden, um staining Verfahren. Sobald Folien eingedeckt werden, sind sie bereit, sofort gefärbt werden.

4. Die Färbung

HINWEIS: Während ausführliche Schritt-für-Schritt-Verfahren finden Sie auf der Produkt-Datenblatt entnommen werden und sollte für Färbeverfahren befolgt werden, können persönliche Optimierung erforderlich, um eine optimale Färbung zu erhalten.

1. Da die Montage Medien (siehe Tabelle) ist nicht mit Wasser mischbar ist, dehydrieren gleitet durch zunehmende Grade von Alkohol (2 min jeweils in 70%, 95% und 100% Ethanol), und deaktivieren Sie sie mit Xylol (100% für 5 Minuten), um sicherzustellen, Dias nicht undurchsichtig über die Zeit.
2. Deckglas Sektionen und trocknen lassen. Bild mit Mikroskop mit Bildbearbeitungssoftware ausgestattet.

Ergebnisse

Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschl?...

Diskussion

Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine ​​Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.
OCT	4583	Sakura Inc.	Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific